JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here, we present a novel humanized mouse liver model generated in Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice following the transplantation of immature and expandable human hepatic stem cells.

Аннотация

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in which the liver has been repopulated with functional human hepatocytes, could serve as a useful tool for investigating human hepatic cell biology, drug metabolism, and other preclinical applications. One of the key factors required for successful transplantation of human hepatocytes into mice is the elimination of the endogenous hepatocytes to prevent competition with the human cells and provide a suitable space and microenvironment for promoting human donor cell expansion and differentiation. To date, two major liver injury mouse models utilizing fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) and uroplasminogen activator (uPA) mice have been established. However, Fah mice are used mainly with mature hepatocytes and the application of the uPA model is limited by decreased breeding. To overcome these limitations, Alb-toxin receptor mediated cell knockout (TRECK)/SCID mice were used for in vivo differentiation of immature human hepatocytes and humanized liver generation. Human hepatic stem cells (HpSCs) successfully repopulated the livers of Alb-TRECK/SCID mice that had developed lethal fulminant hepatic failure following diphtheria toxin (DT) treatment. This model of a humanized liver in Alb-TRECK/SCID mice will have functional applications in studies involving drug metabolism and drug-drug interactions and will promote other in vivo and in vitro studies.

Введение

Mice are commonly used for pharmaceutical testing since biomedical research in humans is restricted1; however, these models are not always useful since they may inaccurately simulate the effects observed in humans. Most drugs in current medical use are metabolized primarily in the liver. However, the same drug can be metabolized into different metabolites in mouse and human livers because of inter-species differences. Thus, it is often difficult to determine during development whether a potential drug poses any risks for clinical applications2,3.

To address this problem, "humanized" mouse livers have been developed by growing human liver cells inside mice4-6; these models exhibit drug responses similar to those observed in the human liver. The primary mouse models currently used for humanized liver generation include uroplasminogen activator (uPA+/+) mice4,7, fumarylacetoacetate hydrolase (Fah−/−) mice6, and the recently reported thymidine kinase (TK-NOG) mice.

However, previous reports have shown that transplanted human immature cells or stem cells are less competitive than adult human hepatocytes in Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−) mouse livers8-10. Moreover, Fah−/− mice provide a growth advantage only for differentiated hepatocytes and not for immature liver progenitor cells11. The transplantation of human hepatic stem cells (HpSCs) into TK-NOG mice in the lab has been unsuccessful. Hence, no useful mouse model for the efficient engraftment of human immature liver cells currently exists.

Thus, we developed a novel Alb-TRECK/SCID mouse model that could be efficiently repopulated with human immature hepatocytes. This transgenic mouse model expresses human heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF) receptors under the control of a liver cell-specific albumin promoter. Following the administration of diphtheria toxin (DT), these mice develop fulminant hepatitis due to conditional ablation of hepatocytes, enabling donor cell residency and proliferation12. Although mouse hepatocytes have been successfully transplanted into Alb-TRECK/SCID mice in previous studies13,14, the generation of a humanized liver using Alb-TRECK/SCID mice has yet to be reported.

In this study, humanized livers were generated in Alb-TRECK/SCID mice via transplantation of HpSCs. This humanized liver provides an in vivo environment for universal stem cell differentiation and the ability to predict human drug metabolism patterns and drug-drug interactions.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все экспериментальные процедуры животных были проведены в соответствии с Руководством по защите животных от Yokohama City University.

1. Генерация модели острого печени Травма мыши

  1. Добавить 1 мл phenolized 0,85% раствора NaCl (0,6 г фенола в 100 мл 0,85% раствора NaCl) до 1 мг токсина дифтерии (DT), чтобы сделать 1 мг / мл маточного раствора DT. Примечание: ДТ в концентрации 1 мг / мл может храниться в течение приблизительно 2 лет при 3 ° С до 8 ° С.
  2. Серийно разбавить 1 мг / мл маточного раствора ДТ до 0,3 мкг / мл DT в phenolized 0,85% раствором хлорида натрия и готовят аликвоты 0,3 мкг / мл раствора DT в качестве рабочего раствора. Примечание: Этот рабочий раствор должен быть свежеприготовленным.
  3. Для проведения экспериментов с использованием сублетальных дозы (~ 50% летальность), управлять 8-недельных мышей в возрасте 1,5 мкг / кг дозы DT.
    1. Выполните внутрибрюшинную инъекцию DT, держа мышь в спинных лежачее и вставьте needlе ниже сгиба колен, слева или справа от средней линии. Избегайте средней линии, чтобы предотвратить проникновение в мочевой пузырь. Угол иглы под примерно 45 ° по отношению к телу.
    2. Использование инсулиновый шприц, вводят мышам с помощью 100 мкл свежеприготовленного 0,3 мкг / мл DT на 20 г веса мыши. Например, 18-г мыши должен получить 90 мкл 0,3 мкг раствора DT / мл.
  4. В 48 ч после инъекции дт, собирают кровь из хвостовой вены, помещая мышь в фиксатор и нагревая хвост мыши на водяной бане 37 ° С в течение приблизительно 10 мин, чтобы расширить кровеносные сосуды. Затем, сделайте 1-мм ник в хвост 2 см от кончика с острым скальпелем и собирают кровь с микрокапиллярной трубкой.
    1. Центрифуга микрокапиллярной трубки, содержащей кровь при 1500 х г в течение 5 мин и собирают сыворотку отделение надосадочной жидкости и осадка клеток.
  5. 50 мкл 1:20 разбавленной сыворотки мыши на GOT / AST-PIII скользит. Измеряют поглощение продукта реакции (синий краситель) при 650 нм с использованием многоцелевой автоматического анализатора сухим химии в соответствии с протоколом производителя.
    Примечание: для чтения из аспартатаминотрансферазы (АСТ) / отображается автоматически глутаминовой щавелевоуксусной трансаминазы (GOT) активность. 2 дня после инъекции DT, примерно 60% мышей выставлены значения AST между 12000 - 16000 МЕ / л и были рассмотрены, страдают от острого повреждения печени. Эти мыши были переведены в новую клетку, и использовали в качестве реципиентов трансплантата клеток.

2. Подготовка печени человека стволовых клеток

  1. Изолировать печени человека стволовые клетки из первичных клеток эмбриональной печени человека с использованием клеток сортировщика антигены CDCP1, CD90 и CD66 клеток для получения субпопуляции CDCP1 + CD90 + CD66-, затем засеять популяцию клеток изолированных на коллаген IV покрытием блюда культуры, как сообщалось ранее 15. Используйте первичные эмбриональные клетки печени человека зачаточномвозраст от 14 до 18 недель.
  2. Собирают печени человека стволовые клетки культивировали до 80% - 90% слияния на чашки для культивирования 100 мм, аспирация культуральной среды, промыть клетки с 10 мл PBS, а затем удалить PBS. Trypsinize клетки с 2 мл 0,05% -ного раствора трипсина / ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С. Примечание: Клетки в более чем 90% слияния, не подходят для трансплантации клеток, так как дифференцировка клеток могут влиять на их способность пролиферативный у мышей.
  3. Контроль состояния дисперсии клеток под микроскопом. Когда клетки кажутся плавающими или течет свободно, остановить ферментативного расщепления путем добавления 8 мл DMEM / F12, содержащей 10% FBS.
  4. Суспендирования клеток медленно с помощью 10 мл серологической пипеткой и переносят клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 100 х г и 4 ° С.
  5. Аккуратно ресуспендируют осадок клеток в 10 мл DMEM / F12, содержащей 10% FBS и определяют количество клеток с помощью микроскопа счетнокамерное.
  6. Разделить ячейки в 1,0 × 10 6 клеток на 50 мкл PBS аликвоты для каждой отдельной мыши и не хранить на льду до трансплантации.

3. внутриселезеночное Трансплантация печени человека стволовых клеток

  1. Поместите чистую клетку на 37 ° C электрический грелку.
  2. Обезболить мыши с помощью изофлуран ингаляции (1 - 1,5% (об / об) в 2 л кислорода в минуту), поместив ее под соплом. В качестве альтернативы, используйте пробирки, содержащие марлю, смоченную изофлуран.
    1. Убедитесь в том, что мышь находится под наркозом, слегка зажимая заднюю лапу. Если коленный рефлекс выявляется, поместите мышь обратно в камеру. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  3. Бритье хирургический сайт, используя электрические ножницы и применять 70% (по объему / об) этанола и повидон-йода для стерилизации. Затем делают разрез кожи 1 см в левый бок чуть ниже реберной границы ребер, а затем разрез набрюшной стенки, а также брюшину.
  4. Осторожно обнажения селезенки. С помощью 100-мкл микроинъекции шприц с 32-G 1/2-дюймовый иглу , чтобы непосредственно вводить 1,0 × 10 6 печени человека стволовых клеток в 50 мкл PBS в селезенку каждой мыши. Наклоните иглу под углом 5 ° для инъекций.
    1. Убедитесь, что глубина инъекции составляет менее половины толщины селезенки. Игла должна войти в селезенку на одном конце (голова) и хранение клеток на другом конце (хвост).
  5. Для того, чтобы предотвратить утечку клеток после инъекции, осторожно применять давление с помощью пальца в течение 2 мин, а затем удалить иглу.
  6. Поместите селезенку обратно в тело мыши и закрыть полость с нормальной проточной шву для мускулатуре и кожи.
  7. Передача мышей в 37 ° C подогретого клетки сразу же после трансплантации. Для обеспечения мышь способна дышать комфортно, поместите курсор на его стороне в клетке, Аопорожнять контакт между клеткой и подстилки месте операции.
  8. Монитор мышей до анестезии не спадет, чтобы обеспечить швы остаются закрытыми и мыши вернуться к предоперационного условия.
  9. Убедитесь, что у мышей обеспечены нормальной питьевой водой и пищей. Через 1 ч возвращают в клетку в комнату мыши центра животных и контролировать мышей ежедневно.

4. Обнаружение пересаженных печени человека стволовых клеток, полученных из гепатоцитов в печени мышей

Примечание: Для следующих процедур, усыпить всех животных с помощью передозировки кетамина и ксилазина с последующим смещением шейных позвонков.

  1. Через 4 - 6 недель после трансплантации, эвтаназии мышей и открыть брюшной полости за счет одновременного разрезания кутис и фасции с помощью хирургических ножниц.
  2. Рассеките соединительной ткани над брюшины, используя ножницы, как расширитель, и разрезают брюшину вдоль белой линии, чтобы открыть брюшнуюполость.
  3. Lift грудину с пинцетом, проколоть мембрану, и прорезать каждую сторону от грудины вверх через цервикальный пояском.
  4. Отрежьте полую вену на грудном стороне печени и тянуть пищевод через печень в переднем направлении. Извлеките диафрагму, чтобы удалить печень.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы держать кончики ножниц указал вверх, чтобы предотвратить повреждения органов грудной клетки внизу. Тимус имеет тенденцию иногда цепляются к спинной стороне грудной кости, и это должно быть тщательно избегать.
  5. С помощью диафрагмы в качестве ручки, начинают вытягивать печень из брюшной полости. Внутренняя полая будет держать печень на месте. Обрежьте внутреннюю полую вену; будьте осторожны, чтобы не преждевременно освободить правый надпочечник.
    Примечание: Мыши имеют четыре-лопастные печень, состоящую из средней доли, левой доли, правой доли, и хвостатого мочку. Желчный пузырь суспендируют в небольшом раздвоениюмедианная лопасть.
  6. Отдельные лепестки друг от друга на стыках и встраивать их в оптимальной температуры резания (ОКТ) соединения в соответствии с протоколом производителя. Замораживание ОКТ, содержащий ткани печени в металлических сеток на криостата.
  7. Вырезать 5-мкм срезы толщиной образца с помощью криостата при температуре -18 ° C и смонтировать их на предметные стекла микроскопа RT. Хранить запас при -80 ° С. Подготовьте слайды для гематоксилином и эозином (H & E) и иммунофлюоресценции окрашивания в соответствии с ранее описанными процедурами 16.

5. Обнаружение Альбумин человека секретируемых Расчет химерного Rate

  1. Для измерения человеческого воссоздание печени, проводить человеческого альбумина ELISA с использованием сыворотки и человеческого альбумина ELISA набор в соответствии с инструкциями изготовителя.
  2. Вычислить гуманизированного печени химерный скорость путем ПЦР в реальном времени анализ уровней экспрессии во всем-гуманизировать печени. Определить относительную ехотношение уровней прижимное актина человека специфичные для человека и мыши кросс актина (соотношение 1) и отношение мыши конкретных актина к человеческой-мышиной поперечному актина (отношение 2). Химерные ставка рассчитывается как отношение 1 / (соотношение 1 + 2) соотношение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Alb-Treck / SCID мышей гепатоциты экспрессии человеческого рецептора DT HB-EGF ген под контролем промотора альбумина и проявляют цитотоксические эффекты после введения DT 12. Для того, чтобы оценить влияние лечения на ДТ поражения печени, DT дозы 1,5 мкг / кг вводили в 8-недельн?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Недавние исследования показали , что печень мыши может быть заселена с гепатоцитах человека, в том числе взрослых гепатоцитов и пролиферативных печеночных стволовых клеток 17. Эти заселен печенки были использованы в качестве доклинических экспериментальных моделей для тестиров...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have no competing financial interests to disclose.

Благодарности

We wish to thank the Mammalian Genetics Project, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science, for providing the mice. We also thank S. Aoyama and Y. Adachi of the ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion) & Toxicology Research Institute, Sekisui Medical Company Ltd., Japan, and K. Kozakai and Y. Yamada for assistance with LC-MS/MS analysis. This work was supported in part by Grants-in-Aid from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology (MEXT), Japan to Y-W.Z. (18591421, 20591531, and 23591872); by the Jiangsu innovative and entrepreneurial project for the introduction of high-level talent and the Jiangsu science and technology planning project (BE2015669); and by grants to H.T. for Strategic Promotion of Innovative Research and Development (S-innovation, 62890004) from the Japan Science and Technology Agency.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Human albuminSigmaA6684Mouse
Human CK19DakoM088801Mouse
Human nucleiMilliporeMAB1281Mouse
Human CK8/18ProgenGP11Guinea pig
CDCP1Biolegend324006Mouse
CD90BD559869Mouse
CD66BD551479Mouse
GOT/AST-PIIIFujifilm14A2X10004000009
DMEM/F-12Gibco11320-033
FBSBiowestS1520
0.05% Trypsin-EDTA Gibco25300-054
Diphtheria ToxinSigmaD0564-1MG
Human Albumin ELISA KitBethyl LaboratoriesE88-129
Syringe (1 ml)TerumoSS-01T
32G 1/2" needleTSKPRE-32013
O.C.T.Compound(118 ml)Sakura Finetek Japan4583
MoFlo high-speed cell sorterBeckman CoulterB25982
DRI-CHEM 7000Fujifilm14B2X10002000046

Ссылки

  1. Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
  2. Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
  3. Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
  4. Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
  5. Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
  6. Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
  7. Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
  8. Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
  9. Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
  10. Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
  11. Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
  12. Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
  13. Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
  14. Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
  15. Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
  16. Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
  17. Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
  18. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
  19. Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
  20. Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
  21. Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
  22. Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

114Treck SCID

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены