JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Erratum Notice
  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Erratum
  • Перепечатки и разрешения

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Резюме

Выпадающий протокол РНК оптимизирован здесь для обнаружения взаимодействий между РНК-связывающих белков (ОДП) и некодирующих, а также кодирования РНК. Фрагмент РНК из рецептора андрогена (AR) был использован в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как извлечь ее из ОПБ lystate первичных бурых адипоцитов.

Аннотация

РНК-связывающие белки (ОДП) появляются в качестве регулирующего слоя в развитии и функционировании жировой ткани. ОДП играют ключевую роль в регуляции экспрессии генов на посттранскрипционных уровнях, влияя на стабильность и поступательное эффективность мРНК мишеней. РНК выпадающий метод широко используется для изучения взаимодействия РНК-белок, который необходим, чтобы выяснить механизм, лежащий в основе функции ОДП ", а также длинные некодирующие РНК» (lncRNAs). Однако высокая липидный изобилие в адипоциты представляет собой сложную техническую задачу в проведении этого эксперимента. Здесь подробно выпадающий протокол РНК оптимизирован для первичной культуры адипоцитов. Фрагмент РНК из (AR) 3 'нетранслируемой области рецептора андрогена (в 3'UTR), содержащие аденилатной-uridylate богатых elementwas, используемые в качестве примера, чтобы продемонстрировать, как получить его RBP партнера, Гур белок, из адипоцитов lystate. Описанный здесь способ может быть применен для обнаружения взаимодействий междуОДП и некодирующие РНК, а также между ОДП и кодирование РНК.

Введение

ОДП представляют собой белки, которые связываются с двойной или одноцепочечной РНК в клетках и участвуют в формировании РНК-белковых комплексов. ОДП может связать различные виды РНК, включая мРНК и длинных некодирующих РНК (lncRNAs), и оказывают свое влияние на пост-транскрипционных уровнях. Оба ОДП и lncRNAs появляются в качестве новых регуляторов в развитии жировой и функции 1,2,3. Для того, чтобы понять механизм RBP- и lncRNA-опосредованной регуляции клеточных путей, часто бывает необходимо, чтобы обнаружить взаимодействие между конкретной молекулы РНК и одного или нескольких ОДП, и, иногда, чтобы определить полный спектр белковых партнеров РНК транскрипт. Тем не менее, этот эксперимент может быть сложной задачей из-за высокого содержания липидов в адипоцитах. Протокол спускающее РНК , описанный здесь может быть использовано для получения белковых партнеров специфической РНК из адипоцитов лизатов первичных культур 4,5.

Обоснование для этого протоCol можно суммировать следующим образом. РНК приманку в пробирке транскрипции из матрицы ДНК, меченного биотином и конъюгированные с покрытыми стрептавидином магнитными гранулами 4. РНК приманку инкубируют с клеточными лизатов, чтобы обеспечить образование РНК-белковых комплексов, которые впоследствии снесенных на магнитной подставке. Более конкретно, РНК протокол спускающее описано ниже использовать фрагмент РНК из AR 3' - UTR в качестве приманки , чтобы получить Hur протеин, универсально выраженный ОПБ , связанный с 3' - UTR мРНК 6,7, от theadipocytelysate первичной культуры. Для проверки специфичности связывания этого анализа, а нерелевантных RNAas также пустые стрептавидином шарики включен в качестве контроля. Этот протокол совместим с вестерн - блоттинга или масс - спектрометрии (MS) , чтобы подтвердить захват конкретного ОПБ или определить полный репертуар захваченных ОДП соответственно 8.

Некоторые методы доступны для изучения взаимодействия РНК-белокs. Для выявления РНК, связанные с данной РСП, RIP (РНК иммунопреципитации) и CLIP (УФ-сшивка и иммунопреципитация) могут быть применены. В противоположность этому, для выявления белковых партнеров данной РНК, РНК выпадающий, Chirp (хроматина изоляция путем очистки РНК), ДИАГРАММА (захват анализ гибридизации РНК-мишеней) и RAP (очистка антисмысловой РНК) могут быть применены. По сравнению с более поздними, РНК выпадающий метод требует меньших усилий, чтобы создать. Он может быть использован для захвата белков в пробирке и в естественных условиях. В естественных условиях подход РНК спуском, который является технически более сложной , чем его аналог в пробирке, сохраняет РНК-белковых взаимодействий путем сшивания в клетках, захватывает аптамеров меченные РНК , представляющие интерес из клеток, а затем обнаруживает связанные ОДП. РНК спускающее может быть использован для обогащения низких обильные ОДП, и для выделения и идентификации РНК-белковых комплексов , которые имеют различные функциональные роли в управлении клеточной регуляции 9,10 .

протокол

Примечание: РНК представляет интерес в контексте данного исследования является фрагментом AR 3'UTR.

1. Приготовление биотин-меченой РНК

  1. Для получения РНК, усиливать Т7-AR-олиго методом ПЦР с последующей транскрипцией в пробирке с использованием коммерческого набора и в соответствии с инструкциями изготовителя 11.
    Примечание: праймеры для ПЦР, приведены в таблице 4: T7-AR-F и Т7-AR-R.
  2. Для неспецифического связывания контроля, усиливать частичную последовательность люциферазы светлячка (ФЛ) ДНК с помощью ПЦР из psiCHECK-2 плазмиды, а затем в пробирке транскрипции.
    Примечание: праймеры для ПЦР, приведены в таблице 4: hluc (+) - Т7-зонд-F и hluc (+) - зонд-R Таблица 4 Последовательности матрицы и праймеров для ПЦР - амплификации...
  3. Для 50 мкл ПЦР-реакции, смесь 50 нг ДНК (олиго или плазмиды), 4 мкл дНТФ (2,5 мМ каждого отдельного дНТФ), 5 мкл 10х реакционного буфера, 1 мкл 2,5 U / & #181; л ДНК-полимеразы, 2 мкл 10 мкМ прямого праймера, 2 мкл 10 мкМ обратного праймера, и нуклеазы без воды.
    1. Запуск ПЦР-амплификации в амплификатор с использованием следующей программы. ЭТАП 1: один цикл 95 ° С в течение 2 мин; STEP2: 35 циклов 95 ° С в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 72 ° C в течение 30 секунд (AR) или 60 секунд (FL); ШАГ3: один цикл при 72 ° С в течение 10 мин.
  4. Обобщить биотинилированных РНК с использованием транскрипции набора в пробирке в соответствии с инструкциями изготовителя 11. В этом эксперименте используют продукты ПЦР в качестве матриц для синтеза РНК. Для 20 мкл в пробирке реакции транскрипции, смешайте 200 нг ПЦР - амплификации ДНК, 2 мкл каждого отдельного NTP, 1 мкл 10 мМ биотин-CTP, 2 мкл 10х реакционного буфера и 2 мкл РНК - полимеразы Т7. Выдержите смесь при температуре 37 ° С в течение 4 часов.
  5. После транскрипции в пробирке, Трит реакционной смеси с 1 мкл 2 ед / мкл ДНКазы при 37 & #176 ° С в течение 15 мин для разрушения шаблона ДНК. И, наконец, разбавленным биотинилированного РНК в общем объеме 60 мкл для последующей очистки.
  6. Очищают биотинилированных РНК для удаления солей и некорпоративные нуклеотидов с помощью колонок для очистки в соответствии с инструкциями изготовителя 12. Измерение концентрации РНК и хранят при -80 ° С в течение последующих раскрывающихся анализов.
  7. Для обеспечения правильной вторичной структуры для РНК интереса к РНК-белкового взаимодействия, тепла 50 мкл биотинилированным РНК (50 мкМ) при 90 ° С в течение 2 мин, холод на льду в течение 2 мин, затем поставить с 50 мкл 2x структуры РНК - буфера (табл 3), а также позволяют РНК складном при комнатной температуре в течение 30 мин 13,14.

2. Получение РНК-гранулами, конъюгированными

Примечание: Используйте магнитную подставку для разделения магнитных шариков и супернатанта.

  1. Ресуспендируют покрытые стрептавидином магнитные гранулы в оригинальном флаконе с кратким vorteсин в соответствии с инструкциями изготовителя. Перенести 150 мкл ресуспендировали бусин в 1,5 мл трубки. Поместите пробирку на магнит в течение 1 мин. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
    Примечание: В РНК раскрывающихся анализах, когда аликвоты ресуспендировали бусы из оригинального флакона, используйте 50 мкл бус Для анализа с последующим вестерн-блоттинга, и 200 мкл бусинки для анализа с последующим МС.
  2. Вымойте бусин один раз ресуспендирования бусинка гранул с 1 мл рекомендованной заводом - изготовителем 1x W & B (связывание и промывки) буфера (таблица 3), а затем, вращая трубку в течение 5 мин при комнатной температуре в ротатор. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
  3. Для того, чтобы инактивировать РНКазы на шариках, мыть бусин в два раза, каждый раз с помощью ресуспендирования осадком из гранул с 400 мкл буфера А. буфера А представляет собой щелочной раствор , содержащий 0,1 М NaOH и 0,05 М NaCl (таблица 3). Поворот через трубку в течение 2 мин при комнатной температуре в ротатора. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
    4. <литий> Чтобы удалить NaOH из бисера, бусин мыть дважды, каждый раз при диспергировании осадком из гранул с 400 мкл буфера В (таблица 3), с последующим поворотом трубочки в течение 2 мин при комнатной температуре в ротатора. Удалите супернатант. Держите шарик шарик.
  4. Ресуспендируют осадок шарик 300 мкл 2x W & B буфера, разделить поровну шарики и переносят на три 1,5 мл пробирки (100 мкл шариков на пробирку). Поставка бортовых содержащих пробирки с 100 мкл РНКазы свободной воды, 100 мкл биотинилированным РНК FL и 100 мкл биотинилированного А.Р. 3'UTR РНК, соответственно.
  5. Инкубируют каждый шарик смеси в течение 1 ч при комнатной температуре с вращением. Поместите трубки на магнит в течение 1 мин. Выбросьте все супернатант. Держите шарик гранул.
  6. Промыть бусин в два раза, каждый раз с помощью ресуспендирования каждый осадком из гранул с 400 мкл 1x W & B буфера, а затем вращая пробирки в течение 5 мин при комнатной температуре в ротатора.
  7. Поместите трубки на магнит в течение 1 мин. Выбросьте все супернатант. Ресуспендируют каждый шарик Pelleт с 50 мкл буфера для ядерной изоляции (таблица 3).

3. преадипоцитов Изоляция и адипогенеза Индукционная

  1. Как было описано в предыдущих публикациях 5, рассекают преадипоциты из межлопаточной бурой жировой ткани (мышей дикого типа C57BL6, 3 недель).
  2. Вырастить и в пробирке дифференцировать преадипоциты 5. Клетки готовы к применению вниз по течению через 4-5 дней после начала дифференцировки.

4. Получение клеточного лизата из первичных адипоцитов

Примечание: Убедитесь, что все процедуры подготовки клеточного лизата сделаны на льду, и все буферы охлажденным на льду. Предварительно охлажденные Даунса стеклянные гомогенизаторы на льду.

  1. Растут и дифференцировать преадипоциты в 15 см чашки 5 (смотри раздел 3.2). Каждое блюдо обеспечивает адекватные клетки для одной РНК выпадающим анализа. На 4-й день или 5-й день дифференциации, сброшенных среды для культивирования клеток, и мыть CELLS один раз с 1x PBS.
  2. Для сбора клеток, добавляют 10-15 мл 1X PBS к клеткам, царапать, чтобы собрать клетки в 50 мл пробирку и Гранул клетки центрифугированием при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант с помощью пипетки 1 мл.
  3. Осадок Ресуспендируют клеток в 2 мл гипотонического буфера (таблица 3), и инкубировать клетки на льду в течение 15 мин. Передача клеток в стеклянном гомогенизаторе 15 мл Даунса и касательные клетки механически на льду с 20 ударов.
  4. Гранул ядра клеток центрифугированием при 3300 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Держите ядер гранул на льду для дальнейшего использования (см раздел 4.6). Перенести супернатант в 1,5 мл пробирки, добавляют 3М KCl к супернатанту, чтобы получить конечную концентрацию 150 мМ, и спина при 20000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
  5. После центрифугирования, тщательно удалить lipidlayeron верхней с помощью 1 мл пипетку, и собирают супернатант в качестве цитоплазматического клеточного лизата.
  6. Ресуспендируют ядер гранул (смотри раздел 4.4) в 1 мл ядерной изоляции буфера. Tядер ransfer в стеклянном гомогенизаторе 15 мл Даунса с использованием 1 мл пипетку и сдвига ядер механически на льду с 100 ударов. Гранул ядерного дебриса путем центрифугирования при 20000 х г в течение 15 мин при 4 ° С, и собирают супернатант в качестве ядерного клеточного лизата.
  7. Либо объединить ядерные и цитоплазматические клеточные лизаты, или использовать каждую фракцию отдельно, ниже по течению выпадающим применения. В этом демонстрационном эксперименте, эти две фракции клеточных лизатов были объединены при объемном соотношении 1: 1.
  8. Добавить ингибитор РНКазы в этой нефракционированного клеточного лизата с получением конечной концентрации 0,5 ед / мкл. Отложите 100 мкл клеточного лизата в качестве входного контроля для вестерн - блоттинга 15.

5. Binding и элюирования ОПБ

  1. Разделение лизат клеток на три равные аликвоты (1 мл лизата клеток в 1,5 мл трубки), и инкубировать с пустым, FL РНК-конъюгированные и А.Р. 3'UTR РНК-гранулами, конъюгированными (смотри раздел 2.8), соответственно, в течение 3 ч при 4 ° Сс вращением.
  2. Поместите трубки на магнит в течение 1 мин. Собирают супернатант с использованием 1 мл пипетки, с последующим выделением РНК из надосадочной жидкости для подтверждения РНК целочисленность. Изолировать РНК с использованием кислоты гуанидина раствора тиоцианата-фенол В соответствии с инструкциями производителя (таблица 2). Оценка РНК целость путем анализа 28S и 18S субъединиц рибосомальной РНК. Держите шарик гранул на льду.
  3. Промыть магнитные гранулы шесть раз, каждый раз с помощью ресуспендирования каждый осадком из гранул с 1 мл ядерной изоляции буфера, содержащего 40 ЕД РНКазы ингибитора и 0,25% Igepal, а затем вращая пробирки в течение 2 мин при комнатной температуре в ротатора. Используйте магнитную подставку для разделения магнитных шариков и супернатанта. Выбросьте все супернатант. Держите шарик гранул на льду.
  4. Используйте следующие шаги для элюирования РНК-белковые комплексы из бисера для вестерн-блоттинга. Во-первых, ресуспендируют каждый шарик осадок в 75 мкл буфера для ядерной изоляции; Затем добавьте 25 мкл 4x Вестерн-блот загрузки БУФFER (содержащий SDS), чтобы получить общий объем 100 мкл. И, наконец, кипеть бусин в этом 100 мкл раствора при 95 ° С в течение 5 мин.
    Примечание: Используйте следующие шаги для элюирования РНК-белковые комплексы из бисера для MS. STEP1: ресуспендирования каждый шарик осадок в 100 мкл буфера для элюции (таблица 3); STEP2: инкубировать пробы шарик в течение 2-3 ч при комнатной температуре с вращением; STEP3: центрифуга и собирать белок, содержащий супернатант; STEP4: концентрат белковых растворов до 20-30 мкл до подачи на MS.
  5. Центрифуга каждые 100 мкл бисерной образца при 12000 х г в течение 30 с при температуре 4 ° С, и собирать надосадочную жидкость. Алиготе 15 мкл супернатанта для Вестерн-блоттинга (смотри раздел 6.1 и 6.2). Зонд полученной мембраны с разбавленной HuR мышиных моноклональных антител (1: 1000 разбавления), в течение ночи.

6. Вестерн-блоттинг по проверке ОПБ

  1. Отдельные ОДП по SDS-PAGE с использованием стандартных методик.
  2. Проведение мыСтерн-блоттинга с использованием стандартных методов, путем зондирования для ОДП, ассоциированных с РНК, представляющей интерес.
    Примечание: В этом демонстрационном эксперименте HuR мышиные моноклональные антитела использовали для иммунологического белка Hur.
  3. Выдержите полученную мембрану, разбавленным Hur антителом (1: 1000 разведение) в 5% вес / объем Обезжиренное сухое молоко, 1x TBS, 0,1% Твин - 20 на 4 ° C при осторожном встряхивании, в течение ночи. Вымойте мембраны три раза 1x TBST. Инкубируйте мембрану со вторичным антителом (козье антитело против мышиного IgG-HRP), при комнатной температуре в течение 1 часа. Вымойте мембраны. Разработка и запись сигнала.

Результаты

В этом демонстрационном эксперименте, фрагмент AR РНК использовали в качестве приманки, чтобы захватить его связывающий белок Hur. Оба РНК-приманка FL, которая не является отношение к белку Хур и аликвот неконъюгированных пустых стрептавидином бусин служили в качестве о...

Обсуждение

lncRNAs и ОДП играют жизненно важную роль в здоровье и болезни, однако молекулярные механизмы этих молекул изучены слабо. Идентификация белков, которые взаимодействуют с молекулами lncRNA является ключевым шагом на пути к выяснению механизмов регулирования. Обогащение ОДП по выпадающим сис...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа финансировалась Сингапур NRF стипендий (NRF-2011NRF-NRFF001-025), а также CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Major materials used in this study.
MEGAscript kit Ambion
Biotin-14-CTP Invitrogen
NucAway spin columns Ambion
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen
HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) Santa Cruz Biotechnology
Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) Santa Cruz Biotechnology
Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) HyClone
Phosphate Buffer Saline (1×PBS) HyClone
RNase inhibitor Bioline
Protease inhibitor Sigma
Pfu Turbo DNA polymerase Agilent Technologies
TRIsure Bioline
NameCompanyCatalog NumberComments
Major equipment used in this study.
Sorvall Legend Micro 21R centrifuge Thermo Scientific
Sorvall Legend X1R centrifuge Thermo Scientific
Bio-Rad T100 thermal cycler Bio-Rad
Nanodrop 2000 Thermo Scientific
BOECO rotator Multi Bio RS-24 BOECO,Germany
Protein gel electrophoresis and blotting apparatus Bio-Rad
DynaMag-2 magnet Life Technologies

Ссылки

  1. Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
  2. Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
  3. Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
  4. Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
  5. Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
  6. Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
  7. Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
  8. König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
  9. Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
  10. McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
  11. Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
  12. Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
  13. Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
  14. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
  15. Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
  16. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
  17. Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
  18. Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
  19. Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture
Posted by JoVE Editors on 8/20/2016. Citeable Link.

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

The author list has been updated from:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

*These authors contributed equally

to:

Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2

1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School

2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore

3Division of Bioengineering, School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

*These authors contributed equally

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

113

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены