Визуализация Cell Shape Переоборудование и Cell движения в<em&gt; Drosophila</em&gt; гаструляцией Использование DE-кадгерин Reporter Трансгенные Мухи

Резюме

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

Аннотация

Гаструляция первый набор морфологически динамических событий , которые происходят во время эмбрионального развития многоклеточных животных , таких как дрозофилы. Это морфологическое изменение также признается как эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT). Дисрегуляция EMT связано с фиброзом и метастазирование рака. Существует доказательство того, что возникающие ЕМТ контролируется ряда молекулярных механизмов. Как также известны такие, многие ключевые гены, контролирующие верхушечный перетяжку являются важными факторами в ЕМТ наблюдается в метастазирования рака. Как EMT во время гаструляции Drosophila, эпителиальные клетки можно заставить изменить свою форму и быть перепрограммирован перенаправлять судьбу клеток по отношению к различным другим типам клеток. Здесь мы предлагаем надежный метод визуализации дрозофилы гаструляцией для анализа инициации морфогенетических клеточных движений и идентификации клеточных судеб на этой стадии эмбрионального развития. Используя этот метод, мы определяем грELL перегруппировки во время гаструляции и демонстрируют важность апикального сужения во время гаструляции с помощью GFP маркированы DE-кадгерин.

Введение

Гаструляция первый набор морфологически динамических событий , которые происходят во время эмбрионального развития многоклеточных животных , таких как Drosophila ^1,2. Интересно отметить , что возникающие данные свидетельствуют о том, что этот процесс регулируется через взаимодействие между механическими и молекулярных механизмов ^3. Кроме того, эпителиальный к переходу мезенхимальной (EMT), которая представляет собой важный процесс в гаструляцией, также участвует в процессах заболеваний человека , таких как рак ^4-8 метастаз. Как также известны такие, многие гены , которые контролируют верхушечный перетяжку, являются ключевыми факторами в ЕМТ наблюдается при раке метастазирования ^9. Таким образом, верхушечный Сужение во время гаструляции является отличной моделью для исследования вышеупомянутых регулирующих механизмов и повысить понимание метастазирования рака. Преимущество этого метода заключается в том, что мы можем наблюдать движение клеток во время гаструляции в режиме реального времени и, следовательно, мы будемвозможность скрининга генов, участвующих в гаструляции, а также метастазирование рака.

Хотя относительно неизвестной, клеточная адгезия к клетке , как полагают , играет центральную роль в вершинной сужением ^1. Drosophila генетика хорошо подходит для отдельных исследований на уровне клеток , исследующих регуляторных молекулярных механизмов. Эта модель позволит нам раскрыть важность апикального сужения во время гаструляции. Более того, этот метод может быть использован для скрининга генов, участвующих в метастазировании рака. Захват живые образы Drosophila гаструляцией еще больше позволило нам понять более подробно молекулярные механизмы , регулирующие перестановку ткани. Здесь мы приводим подробное описание простого способа для достижения этой цели.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Трансгенные мухи , используемые в настоящем исследовании , включают следующее: DE-хама :: GFP ^10.

1. Подготовка компании Apple плиты

1. Приготовить смесь из 12,5 г агара, 125 мл 100% коммерчески доступного яблочный сок, 12,5 г глюкозы и 375 мл H ₂ O. Смесь нагревают в микроволновой печи и вылить его в 3 см для культивирования клеток блюдо с. Хранить смесь при температуре 4 ° С для последующего использования.
2. После приготовления яблочного тарелку, добавить тонкий слой замешанного дрожжевого пасты поверх него, чтобы позволить мухи заложить яйца.

2. Эмбрион Подготовка и протокол Живая съемка

1. Поместите около 50 мух (25 мужчин и 25 женщин) в бутылке к спариванию, а затем откладывают яйца на ночь на яблочной пластины, покрытой в замешанного дрожжей. Установите яблочный сок пластины во рту бутылки. Держите бутылку вверх дном в инкубаторе. Оберните пластиковые бутылки Drosophila акции с алюминиевой фольгой , чтобы подсказать йе летит заложить больше яиц.
2. На следующее утро, заменить старый яблочный сок пластины с новым.
3. Пусть мухи откладывают яйца в течение 3 до 4 часов, обернув бутылку с алюминиевой фольгой.
4. Через три-четыре часа спустя, собирают эмбрионов в зародыше ситечко из яблочного сока пластины с помощью кисти или ватный плохо, и мыть их с PBS. Вымойте эмбрионов от 2 до 3 раз больше с PBS в 12-луночные планшеты для культивирования.
5. Dechorionate эмбрионов с 50% хлорной извести в течение 5 мин в 12-луночные планшеты для культивирования.
6. После процесса dechorionation, мыть эмбрионов от 2 до 3 раз больше с PBS.
7. Перенос эмбрионов до 3 см для культивирования клеток блюдо, содержащую PBS и выберите стадии 5 эмбрионов под микроскопом на основе уровня прозрачности в их границах. Пипетировать инсценированном эмбрионов с использованием 200 мкл кончиком пипетки.
8. Затем поместите два выбранных эмбрионов на покровного стекла, и удалить избыток PBS с бумагой крученого ткани. Сориентировать эмбрионов спинной стороной вверх напокровное с использованием бумаги крученого ткани. После этого, приложите эмбрионов к покровного стекла с силиконовой смазкой с помощью тонкой иглы и бумаги витую ткани.
9. Добавьте небольшую каплю масла галоидоуглеводородов 700 на зародышах и помещают покровное, содержащий зародыши вверх дном на отступом горкой, оставляя некоторое пространство в нижней части слайда.
10. Изучение эмбрионов с помощью конфокальной системы визуализации, аргоновой / 488 лазера, а также цель нефти погружения (63x).
    Примечание: Определение эмбриона на соответствующей стадии развития имеет важное значение для захвата изображений события гаструляции. В этих условиях наблюдается почти все эмбрионы развиваются нормально до, по меньшей мере стадии 14. Анализируемый эмбрионов можно культивировать в дальнейшем развивать как взрослый.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Здесь мы покажем , гаструляции события зародыша дрозофилы и общий обзор процедуры подготовки эмбриона (Рисунок 1). Клеточные мембраны помечены с помощью DE-кадгерин :: GFP и живой визуализации движений клеток производится во время гаструляции у дрозофилы

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Although we have previously reported a similar procedure to capture live images of the gastrulation process in Drosophilla¹, the method we describe here is detailed and easy to trace endogenous cadherin expression and thus is quite useful for genetic screening of key factors involved in gastrulation. To maximize success with this imaging procedure, it is essential to use an indented slide. Mechanical pressure sometimes causes embryonic death. Therefore, it is also important to handle the embryos as ge...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 700	Sigma	MKBH 5726
Vacuum grease Silicone	Beckman	335148
Glass coverslip	Matsunami glass	Thickness No1	24 - 36 mm
Embryo stariner	Corning	Corning3477
Plastic Drosophilla Stock Bottles	Hitec	MKC-100
DE-Cadherin knock-in flies			REF (10)