Модель ремоделирования сердца Через сужением брюшную аорту у крыс

Резюме

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

Аннотация

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

Введение

Сердечная недостаточность представляет собой сложный клинический синдром, симптомы которого включают усталость, одышка, непереносимость физической нагрузки, и задержка жидкости в периферических тканях. Это является основной причиной смерти в развитых странах ^1. Помимо наследственной кардиомиопатией , вызванной мутацией в саркомера белков или ионных каналов ^2, дисфункции миокарда может быть вызвано различными заболеваниями, в том числе гипертонии, клапанными пороками сердца, ожирение и сахарный диабет ^3. Изменения структуры миокарда, электрической проводимости и энергетического обмена приводят к неадекватной сердечной мощности накачки для удовлетворения кровеносную требования, которые в конечном итоге приводит к сердечной недостаточности ^3,4. Исследуя механизмы, лежащие в основе сердечной недостаточности, поэтому, имеет решающее значение в области сердечно-сосудистых исследований. Выявление молекулярных механизмов, приводящих к прогрессированию сердечной недостаточности в конечном итоге может помочь в обнаружении новых терапевтических мишеней или полезных биомаркеров 1. Поэтому важно разработать модели сердечной недостаточности на животных , которые разделяют основные клинические особенности с сердечной недостаточностью в организме человека ^5.

Сердечная гипертрофия и ремоделирование играет критическую роль в развитии сердечной недостаточности. Гипертоническая болезнь сердца является ключевым фактором , способствующим сердечной гипертрофии и неадекватные ремоделирования видели в человеческих пациентов ^1. Для того, чтобы имитировать эти человеческие условия, животные модели часто создаются с помощью хирургических процедур. В частности, поперечное или брюшной аортой может быть сужен, чтобы увеличить сопротивление против левого желудочка, что в конечном итоге приводит к перегрузке давления в сердце. Это явление обычно приводит к гипертрофии сердца, физиологическое компенсация кардиомиоцитов для удовлетворения спроса функциональной сердечно-сосудистой системы. Тем не менее, функциональное требование переопределяет нормальных физиологических компенсаторных механизмов, что приводит к сердечной фиброза и Contracплитка обесценения. Поперечные Сужение аортального (ТАС) хирургическое вмешательство часто включает в себя сложные процедуры, в том числе торакотомии, механической вентиляции и разделения тимуса и жировой ткани от дуги аорты. В отличие от этого , брюшной аорты Сужение требует более простых экспериментальных методов ^6-8. Брюшную аорту, между левой и правой почечной артерии, стягивается во время операции. Сердечная гипертрофия и ремоделирование может наблюдаться через несколько недель после того, как брюшной аорты стягивания операции ^6-8; они производят надежные гипертоническая болезнь сердца , аналогичную порождена поперечным сужением аорты хирургии ^9,10. Здесь мы опишем протокол для проведения брюшной аорты перетяжку у крыс с помощью эффективной, высоко-воспроизводимый, и минимально-инвазивным методом. Брюшной аорты рядом с почечных артерий сужен петлей на 0,72 мм, образованный 4-0 шелковой нитью. Через десять недель после операции, гипертрофия сердца и remodelinг может наблюдаться. Модель крысы брюшной аорты гипертрофии сердца, вызванной сужением обеспечивает платформу для изучения механизмов болезни и патофизиологии, а также развитие потенциальных терапевтических средств.

протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованной в США Национальным институтом здоровья (NIH публикация №. 85-23, пересмотренным в 1996 г.). Этот протокол был утвержден и в соответствии с руководящими принципами, установленными Институциональные уходу и использованию животных комитета Национального университета Тайваня.

1. Животное хирургии

1. Приготовьте 22 G иглу шприца путем притупление кончик иглы на бруска. Используя плоскогубцы, складчатые иглу под прямым углом.
2. Перед хирургическим вмешательством, подготовить необходимые хирургические инструменты и материалы, а также клетку восстановления. Автоклав все инструменты и хирургические материалы перед использованием.
3. Поддерживать крыс около 200 г и держать их под 12 ч свет / темнота циклов при контролируемой температуре (21 ± 2 ° С) со свободным доступом к пище и воде. Включите по крайней мере, 6 крыс в каждой группе. Обезболить крыс с фенобарбиталом(75 мг / кг в 0,5 мл, внутрибрюшинно) или другого подходящего анестетика. Подтвердите глубины анестезии путем тестирования хвост рефлекс.
   Примечание: Отсутствие хвоста рефлекса является показателем адекватной анестезии.
4. Поместите крысу в положении лежа на спине на хирургической платформе с грелку для поддержания температуры тела. Бритье брюшной области у крыс с клипера животное волос и лосьон для удаления волос, чтобы избежать хирургических загрязнений. Скраб чисто выбритый живот с бетадин или другого очищающего реагента перед операцией.
   Примечание: Важно поддерживать стерильную поле в течение всей процедуры.
5. Сделайте 2 см разрез по средней линии живота с помощью скальпеля. Используя физиологический раствор, держать в брюшной полости орган влажной во время операции. Смещать органы пищеварения тщательно к стороне, используя ватные шарики, чтобы выставить нижнюю полую вену, которая лежит в заднем брюшную область. Определить брюшной аорты, которая лежит смежное и, как правило, наслева от нижней полой вены.
   ПРИМЕЧАНИЕ: брюшная аорта является судно, которое пульсирует в такт частоты сердечных сокращений.
6. Пирс брюшины с парой щипцов, чтобы раскрыть сосуды под ним. Осторожно изолируют брюшной аорты, прилегающих к почечных артерий и пройти 8 см длиной 4-0 шелковой нити под брюшной аорты между истоков правого и левого почечных артерий.
7. Сделайте свободный двойной узел с шовного материала; оставить петлю диаметром 3 мм, и поместите притупляются и изогнутую 22 G иглы внутри цикла. Затянуть узел вокруг аорты и иглы, а затем удалить иглу сразу достичь перетяжку диаметром 0,7 мм.
8. Закройте брюшной полости с 6-0 рассасывающиеся шовный материал. Шовный мышцы или кожи надрезы с простыми узловыми швами. Для того, чтобы предотвратить инфекцию, вычистить хирургический сайт с настойкой йода.
9. Обратите внимание на животное тщательно до тех пор, пока вновь обретает достаточное сознание, как обозначено свободное перемещениеи потребление пищи. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Для того, чтобы предотвратить после операции боли, лечить крысу с ацетаминофена (300 мг / кг в 0,5 мл, внутрибрюшинно).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи должны вводить анальгетики, утвержденной институциональной политики.

2. ткани и крови для сбора проб

1. Через 10 недель после операции, взвесьте крысу и обезболить его с фенобарбиталом (75 мг / кг в 0,5 мл, внутрибрюшинно). Перед хирургическим вмешательством, подтвердить глубину анестезии, проверяя его хвост рефлекс. Поместите крысу на металлический поднос.
2. Сделайте 2 см разрез по средней линии шеи с помощью скальпеля. тщательно смещать мышцы с пинцетом, чтобы выставить трахею. Тщательно соблюдать для выявления сонной артерии, которые параллельны трахеи и пульсируют в такт частоты сердечных сокращений.
3. Собирают кровь из сонной артерии в сбора крови трубки, покрытой ЭДТА. Сразу центрифугекровь в течение 15 мин при 2000 х г и собирают плазму. Хранить плазму крови при -80 ° C до тех пор, пока это необходимо.
4. Сделайте 5 см разрез в в грудной области, вокруг средней линии мечевидный отросток. Пирс диафрагму с острыми щипцами. Используя пару ножниц, вырезать и удалить грудную клетку вдоль середины ключицы линий с обеих сторон, чтобы обнажить сердце. Вырежьте сердце тщательно вдоль сердца и сосудов границ. Удалите сердце осторожно, не захватывая ткани.
5. Установите сердце на модифицированном перфузионной аппарата Лангендорфа, связывая аортальный ствол к перфузионной иглы. Заливать сердца с буфером Кребса (содержащий 110 мМ NaCl, 2,6 мМ KCl, 1,2 мМ KH ₂ PO _4, 1,2 мМ MgSO _4, 25 мМ NaHCO _3, и 11 мМ глюкозы [pH 7,4]) , чтобы смыть кровь. Взвесьте сердце и вычислить отношение сердца веса к массе тела. Закрепить сердце с 4% параформальдегид на льду. Не забудьте надеть маску, так как пара параформальдегид токсикодендронIC.

3. Ткань Фиброз Количественное

1. Поместите параформальдегид фиксированной ткани сердца на секционирования устройстве ткани и вырезать толщиной 2 мм секции. Поместите срезы ткани в вложению кассете. Обезвоживает ткани через серию градуированных спиртовых ванн (50%, 75%, 95% и 100% в течение 1 ч каждый).
2. Инфильтрат ткань с ксилолом в течение 1 ч и, наконец, в воске в течение 1 часа. Поместите пропитанную ткань в вложению кассету и вставлять парафином. Хранить не срезах тканей в парафиновые блоки при комнатной температуре до microtoming.
3. Нарезать внедренный в ткань толщиной 4 мкм секций. Поместите секции в водяной бане при 45 ° С. Смочите предметное стекло в ванну с водой под углом и постепенно приближаться к парафином сечения ребра, чтобы позволить частичное присоединение к слайду.
4. Переместить слайд в и из ванны, чтобы удалить возможные воздушные мешки под срез ткани и чтобы облегчить прикрепление. Сухие тон скользит при 37 ° С в течение 1 ч и хранить их при комнатной температуре в течение гистологического окрашивания.
5. Поместите слайд в бак. Deparaffinize слайд с ксилолом в течение 30 мин и повторно гидратировать его в последовательно разбавленным спиртом (95%, 75%, и 50% в течение 3 мин каждый) и, наконец, в дистиллированной воде. Используйте адекватную picrosirius красный раствор, чтобы полностью покрыть срезы ткани в течение 1 часа. Промыть слайды в 0,5% растворе уксусной кислоты в течение двух изменений, а затем выполнить два полосканий в абсолютном спирте.
6. Высушите слайд и смонтировать слайд в синтетической смолы с покровным. Сфотографировать слайд в видимом световом поле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: красная область на фотографии показана picrosirius красный положительной зоне под микроскопом при увеличении 200X. Рассчитывают процент picrosirius красной положительной зоне над общей площади, что свидетельствует о степени фиброза ^11.

4. Кровь тропонина Количественное

1. Количественно плазменные уровни тропонинас помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Пробирной каждого образца в двух экземплярах. Нагрузка 50 мкл плазмы крови и 50 мкл коктейля антител в соответствующие лунки. Уплотнение пластины и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре на шейкере при 400 оборотах в минуту.
   Примечание: Сердечный тропонин в плазме является маркером сердечной травмы.
2. Аспирируйте жидкость и промойте каждую лунку 250 мкл буфера для промывки три раза. После последней промывки пластину перевернули и промокните его против чистых бумажных полотенец, чтобы удалить лишнюю жидкость.
3. Добавляют 100 мкл тетраметилбензидина субстрата в каждую лунку и инкубировать в течение 10 мин в темноте на шейкере при 400 оборотах в минуту. Добавьте 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку. Встряхнуть планшет на шейкере в течение 1 мин перемешать. Записывают оптическую плотность (OD) при 450 нм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация тропонина пропорциональна значению OD.

Результаты

Через 10 недель после абдоминальной хирургии аорты сужением, полученный в результате патологии сердца была проанализирована. Сердечный гистологии измеряли путем вычисления отношения веса сердца к весу тела и путем определения количества коллагена в сердце. Сердечны...

Обсуждение

Hypertensive heart disease, a major health problem that contributes greatly to morbidity and mortality, can lead to cardiac hypertrophy and heart failure⁵. The pathogenesis and progression of hypertensive heart disease in humans is complex, so an appropriate animal model is critical to investigate the underlying mechanisms and to test novel therapeutics that aim to improve cardiac structure and function⁵. The abdominal aortic constriction model, which simulates chronic heart disease, is an effective...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G syringe needle	BD Biosciences	309572
EDTA Blood Collection Tubes	BD Biosciences	REF365974
4-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2515N
6-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2150N
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	441244
Acetaminophen	Sigma Aldrich	A7085
Picrosirius red solution	Abcam	ab150681
Cardiac troponin kit	Abcam	ab200016
Imagequant	Molecular Dynamics
Langendorff	ADInstruments	ML870B2