Использование метода рукав в мышиной модели аортальной трансплантации - обучающее видео

Резюме

Мы представляем ортотопическая аорты трансплантации модель с помощью метода рукав мышей. Это очень быстрое анастомоза метод, который может использоваться в исследованиях сосудистых заболеваний.

Аннотация

Ортотопическая аорты трансплантации с использованием метода рукав уменьшает повреждения в аорту с отказов лишь 10-20%. Время для анастомозируют аорты у мышей с использованием метода рукав был короткий и простой в среднем 20 минут, позволяя исследования iso/Алло графтов. Следующей статье описывается процедура трансплантации аорты, используемая в нашей лаборатории. Мышей были под наркозом с смесь изофлюрановая объем 1,5% и 100% кислорода через маску. На данный момент, сегмент между почечных артерий и его бифуркации аорты была отделена от верхней полой вены, свободно подготовлен и clampedat проксимальных и дистальных сегментах с одной Шелковый шов. До удаления аорты физиологический раствор, содержащий гепарина было впрыснуто в нижней полой вены. Затем был сокращен аорты между зажимами и физиологическим Гепарин раствор была использована для промойте просвет. Рукав технику с Мононить швы было использовано для пересадки брюшной аорты в положении ортотопическая.

Введение

Как указывалось в предыдущем исследовании, большое внимание было уделено мышиных трансплантации аорты модели, допускающие дискриминацию между конкретными сосудистой ответы, вызванные трансплантата, сам и некоторых системных факторов, связанных с окружающей средой АРТЕРИОГЕННОЙ ^{1 , 2 , 3}. основным фактором, который играет решающую роль здесь является наличие Выбивное и трансгенных мышей. Их участие в такой модели дает возможность выявления и определения новых патофизиологические пути, связанные с развитием дегенеративные заболевания сосудов, таких как атеросклероз и аневризмы формирования^{4, 5}.

Стоит отметить, что во время прививки внутренней ишемии/реперфузии может появиться травмы для судов, предназначенных для пересадки. Таким образом нельзя исключить возникновение конкретных проблем с трансплантата целостности или неожиданный воспалительная реакция в послеоперационный период возможно исключающих патофизиологических изменений в дегенеративные заболевания сосудов^{3 ,4,5,6,7}. Рукав анастомоза альтернативный метод конца в конец для артериальной анастомоза с диаметром менее одного миллиметра судов и успешно применяется в почечной и сердечной трансплантации в крыс, которая впоследствии была адаптирована для аорты Пересадка в мышей, Dambrin и др. ^{8 , 9 , 10 , 11}.

Аорты ущерб, используя метод трансплантации рукав свернуто с очень низкой технической отказов, из-за его в среднем длится всего 20 минут. Наши предыдущие результаты продемонстрировали отличные функциональные и структурные свойства isograft в естественных условиях после трансплантации, используя технику рукав¹. Dambrin et al. описывают, что после короткой кривой обучения успеха было свыше 78%¹⁰. Осложнений, таких как тромбоз редки, например Энгельбрехт et al. не наблюдали тромбоз, используя технику рукав в почечной трансплантации в крыса⁸.

Мышиных трансплантации аорты модель с рукавом анастомозов является быстрый и простой инструмент для изучения реакции iso/аллотрансплантата в трансплантированы судна. Это видео демонстрирует процедуру трансплантации аорты, проведенные в нашей лаборатории. Эта модель пересадки могут быть полезны в определении основных патологических механизмов дегенеративные заболевания сосудов и может способствовать дальнейшей оценки молекулярной и фармакологического вмешательства¹².

протокол

процедур с участием животных темы были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университете RWTH Aachen, AZ 84-02.04.2012.A234.

Примечание: процедура показана с помощью взрослого мужчины дикого типа мышей с фоном CD1. Держите мышей в специализированную лабораторию единицы до и после операции, обеспечение надлежащего доступа к продовольствию, специализированные ветеринарного контроля и лечения. Если животные приобретаются от снаружи, позволяют одной недели акклиматизации перед выполнением операции.

1. Подготовка донора

1. использования стерильных материалов и инструментов для поддержания стерильных условий во время операции, чтобы избежать инфекции.
2. Анестезировать каждая мышь с смесь 1,5% объема изофлюрановая и 100% кислорода через маску. Положите мыши на платформе в лежачем положении и ленты всех его ноги к операционному столу. Проверьте свои рефлексы, щипать задние лапы, чтобы быть уверенным, что мышь достаточно наркозом. Место глазная мазь на глазах для предотвращения высыхания во время процедуры.
3. Удаление всех волос из живота, используя для удаления волос гель или использовать бритву. Выполните операцию в стерильных условиях. Лечить живота с чередующимися скрабы, хлоргексидин и стерильной воды.
4. Удалить доноров аорту через разрез брюшной срединной линии с ножницами или скальпелем. Убрать кишечника вручную справа. Аккуратно вручную отражают кишечника за сторону, используя неопудренные перчатки.
   1. Место кишечника на кусок Марли, пропитанные солевых чтобы сохранить влажные.
   2. Прочь вскрыть брюшной аорты очень тщательно из окружающих тканей, с использованием тупых диссекции с помощью пинцета.
   3. Отдельный сегмент аорты, почечных артерий и его бифуркации от верхней полой вены с помощью пинцета.
   4. Обеспечить все мелкие ветви этого сегмента очень тщательно с использованием 11-0 леска единого шва.
   5. Перед удалением аорты, придать 0.5 миллилитров (мл) физиологический раствор, содержащий 50 ед гепарина в нижней полой вены.
   6. Пусть доноров животное exsanguinate после удаления сегмент аорту.
   7. Промыть трансплантата полностью с соленой и затем передать его сразу к контейнеру ледяной физраствора.

2. Подготовка получателя

1. анестезировать получателя животных со смесью 1,5% объема изофлюрановая и 100% кислорода через маску, а затем удалить волосы и дезинфекции (раздел 1). Сделать середине линии разреза от мечевидного в таз с помощью скальпеля и втягивать брюшную стен. Место глазная мазь на глазах для предотвращения сухости во время процедуры.
2. Обертывание кишечника в солевой раствор смачивают марлевые и вытеснять очень осторожно к животному ' s справа.
3. Infrarenal аорты бесплатно между почечной артерии проксимальнее нактоузах и бифуркации дистально с помощью пинцета.
4. Обеспечить все мелкие ветви этого сегмента очень тщательно с использованием 11-0 леска единого шва.
5. Зажим проксимальном и дистальном части аорты с 6-0 одного Шелковый шов.
6. Делят аорты в середине между зажимами и орошать отрезока заканчивается гепаринизированным солевой раствор для очистки открытых люмен.
7. Место трансплантата в положении ортотопическая с конца кормления сосуд вставляется в принимающих судна, следуют ушивание с 11-0 мононить, заботясь, чтобы избежать любых кручения аорты, правильно совместив доноров и получателей ( Рисунок 1) ¹⁰.
8. тщательно выхода лигатуры после проведения инспекции анастомоза. Сначала релиз дистальной зажим. Это приводит к низкого давления, держа стены вместе перед выпуском проксимальной стороне.
9. Perfuse трансплантат немедленно и проверьте видимый пульс. Аккуратно удалите остатки шелка. Оптимального совпадения между донорами и получателями аорто-1-2 мм.
10. Вернуться содержимого брюшной полости в брюшной полости и закрыть весь раны с работает 3-0 Полигликолидная кислота швом.
11. Дайте мыши бупренорфин (0,05 мг/кг массы тела подкожно (SC)) перед завершением анестезии.
12. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока он полностью осознает. Управление боли терапии с бупренофина 0,05 мг/кг веса тела ведении SC три раза в день в течение трех дней после операции, утвержденные органом институционального надзора.
13. Для ткани уборки, анестезировать получателя мышей, как описано выше и флеша судов с фосфат амортизированное saline (PBS) следуют 4% формальдегида/PBS, (рН = 7,4) путем пункции сердца. Осторожно извлеките графтов. После ночи фиксации в 4% формальдегида/PBS, образцы процесс дальнейшего и встроить в парафин.

Результаты

Мышей оправился от анестезии в течение 15-30 мин с не наблюдается физического ущерба, хотя существует повышенный риск возникновения тромбоза. Ультразвукового исследования был использован при послеоперационном последующей. Мышей дикого типа, используемые в исследовании выставлены никаких изменений в размеры их просвет. Соответственно были замечены стеноз ни аневризмы образований. Пересадка животных не выставлять налета развитие сосудистой стенки (рис. 2).

Обычные окрашивание процедуры, такие как immunohistology может использоваться для определения зубного налета, шаблон гладких мышечных клеток и накоплением макрофагов. В нашем исследовании гистологические и иммуногистохимическое окрашивание проводился через 6 недель после прививки для проверки целостности трансплантата. Гистологические окрашивание (гематоксилином и эозином (он) и иммуногистохимическое окрашивание (гладкие мышцы актина (SMA) и макрофагов (MAC2)) (рис. 3) показал нам без изменений структуры распределения гладких мышечных клеток, подкладка нетронутыми эндотелиальных клеток и без накопление клеток интимы. Эти результаты показывают, что без существенных поражения или ячейки активации был обнаружен в привитые судов (рис. 3).

Рисунок 1 : Рукав техника. Брюшной аорты был пересажен с использованием метода рукав. В этой процедуре аорты донора был помещен в ортотопическая положении с поверхностным укусов в кормления судна. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Интраоперационная и ультразвуковых изображений. Примеры представления интраоперационной (вскрытие) графтов 6 недель после пересадки (A), трехмерное УЗИ (B) и B-режиме (C). Послеоперационные следить было проведено с использованием ультразвука. Фотографии показывают проходимость трансплантата без изменений в размеры просвета. Кроме того наблюдались не стеноз или аневризмы образований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Гистологические и изображения иммуногистохимия. Гистологические и иммуногистохимии представитель образы пересаженных животных на 6 недель после пересадки. Без значительных поражениях наблюдались в трансплантированы аорты по гистологии (гематоксилином и эозином, он, 100 крат, шкалы бар = 50 мкм), иммуногистохимическое окрашивание (гладкие мышцы актина SMA (красный), или макрофаги MAC2 (зеленый), 200 крат, шкалы бар = 25 мкм). Ядра были противодействию запятнана DAPI (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

До этого исследования различных других трансплантации модели мышей были тщательно проанализированы^{3,6,7,10,,1314}. Модели аортальной трансплантации, с использованием метода рукав с изменениями, Dambrin et al. был выбран как это соответствует нашим критериям и показали высокую надежность рукав анастомоза по сравнению с обычными end-to-end шовные методы ^{1 , 10}.

Эта техника выгодно во многих отношениях с кросс зажим время значительно сократилось минимизации ущерба в аорту во время операции. Низкая заболеваемость тромбоза было отмечено в дополнение к избегая потенциальных несоответствие калибра судна между донором и получателем. Приведенные выше замечания делают этот метод хорошо подходит для исследования сосудистых заболеваний аорты трансплантации в мышей.

В последовавшем исследовании, в котором УЗИ проводилось 8 недель после пересадки существенных изменений не были обнаружены. Это подтвердил предположения, что любой ущерб в аорту во время операции будет минимальным¹.

Прививочных процедуры, представленные в этой статье гарантии не нарушения целостности трансплантата и его функции. Таким образом можно сделать вывод о том, что эта модель экспериментальной трансплантации может служить ценным инструментом для будущих молекулярной и фармакологические исследования дегенеративных судна заболевания в генной инженерии мышей.

Мы считаем, что видео руководство может функционировать в качестве учебных материалов, иллюстрирующих использование этой простой модели артерио артериальная и что она будет способствовать дальнейшей плодотворные дискуссии по многим важным вопросам в сосудистой патологии. Этот метод очень быстрое анастомоза может использоваться для изучения сосудистого заболевания в генной инженерии мышей. Он может также использоваться как модификация модели аневризмы, в сочетании с трансплантацией.

Во время процедуры являются критическими точками. Размещение шовный материал сам является наиболее важным этапом. Хирург должен заботиться, чтобы избежать любых кручения аорты по надлежащему применению доноров и получателей. Зажимы, тщательно удаляются после осмотра анастомоза. Дистальная зажим, всегда должны быть освобождены сначала обусловило проведение стены вместе до выпуска проксимальной стороне низкого давления. Следствие не должным образом после последовательность выпуска будет кровотечение.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halsey Needle Holder	Fine Science Tools	12001-13
Dumont #5 Forceps -	Fine Science Tools	11254-20
Lexer-Baby Scissors	Fine Science Tools	14079-10
Castroviejo Micro Needle Holder	Fine Science Tools	12060-01
Vannas Scissors	Aesculap, Germany	Typ OC498R
Castroviejo Suture Forceps	Geuder, Germany	19015
6-0 silk black (Silk)	Deknatel, Research Triangle Park NC, USA	18020-60- FST
11-0 monofilament (Ethilon)	Ethicon, Norderstedt, Germany	EH7438G
3-0 polyglycolic acid suture (Serafit)	Serag-Wiessner, Naila, Germany	60203214
Isofluorane	Any genericon
Heparin	Any genericon
0.9% saline	Any genericon
Buprenorphine	Any genericon
Bepanthene eye and nose cream	Bayer, Germany
Microscop	Zeiss	Opmi MDO/S5
Vaporiser	Eickemeyer	TEC3
Ultrasound	Vevo, Canada	770,2100