Субнанометровым Resolution Imaging с амплитудной модуляцией атомно-силовой микроскопии в жидком

Резюме

Мы представляем способ достижения разрешения изображения субнанометровым с (режим кратковременного нажатия) амплитудной модуляции атомно-силовой микроскопии в жидкости. Метод демонстрируется на коммерческих атомных силовых микроскопов. Поясним обоснование позади нашего выбора параметров и предложить стратегии для оптимизации разрешения.

Аннотация

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

Введение

С момента своего изобретения, три десятилетия назад, атомно - силовой микроскопии (AFM) ¹ зарекомендовал себя в качестве метода выбора для исследования образцов на наноуровне, особенно там , где усреднение по макроскопических участков поверхности невозможно , и требуется местной информации. В типичном измерения AFM, отклонение гибкого кантилевера используется для количественного определения силы взаимодействия между небольшим числом молекул и наконечником Ultrasharp установлена ​​на конце кантилевера. В зависимости от типа взаимодействий и временные рамки рассматриваемого, широкий спектр информации может быть получена, в том числе вязкоупругих свойств мягких биологических мембран ^2,3, сила одного химического вещества или молекулярной связи ^4,5, атомистической детали поверхность ^{6 - 8,} магнитная ^9, емкостный ^10, проведение ^11, тепловых и химических ^{12,13 14} свойств образцов ^{15. Часть успеха АФМ является его способность работать в широком диапазоне материалов 16 и в различных средах , таких как вакуум 17, газа или жидкого 11,18 19,20, так как он не зависит от конкретной силы между зондом и образцом ,}

На практике, однако, управляя AFM, отличных окружающих условий, может быть сложной задачей, и многие опубликованные результаты все равно будут достигнуты в воздухе. Дополнительная трудность исходит из того, что обычно необходимо для работы AFM в динамическом режиме (вибрирующий кончик) для того, чтобы сохранить и зонда и образца, избегая больших сил трения. Хотя более сложной задачей, динамическая работа в принципе может предоставить больше информации о анализируемого образца, и без потери пространственного разрешения. За последнее десятилетие, поле динамического AFM в жидкости произошли важные события, с появлением видео-курса AFM ^{21 - 23,} для измерения многочастотных ^{24,25 и субнанометровым изображений гидратных структур на границах 26 - 31. Операция АФМ при погружении в жидкость теперь обычно используется в биологии и биофизики 32 - 36, 37 полимера исследования, электрохимии 38 - 40 и твердое тело-жидкость интерфейсов характеристики 41 - 44. Наличие жидкости вокруг вибрирующей кантилевера существенно изменяет его динамику 45, а также взаимодействие между зондом и образцом 29,42. При правильном использовании, жидкость может быть использована для повышения разрешения изображения 26,29, с типичным улучшением почти на порядок по сравнению с лучшим разрешением , достигнутый в условиях окружающей среды 46.}

В АФМ, самое высокое пространственное разрешение достижимо для конкретного измерения зависит как от качества самого AFM и природы тон взаимодействие зондировали ^20,47,48. В настоящее время, наиболее высокого класса, коммерчески доступные АФМ нынешние уровни шума, которые близки к тому , что термического предела ¹² таким образом, определяющим фактором для решения, как правило , взаимодействие зонд-образец. Это эффективно пространственный градиент этого взаимодействия, который определяет разрешение: измерения, основанные на малой дальности, быстро распадающихся взаимодействие дают результаты с более высоким разрешением, чем при более дальности взаимодействия в игре. В жидкости, сольватации силы могут улучшить разрешение изображения , так как они , как правило, исчезают в течение всего несколько молекулярных диаметров жидкости (обычно <1 нм) при удалении от поверхности образца ^49. Эти силы возникают в результате взаимодействия между молекулами жидкости и поверхностью образца. Жидкость с сильным сродством к поверхности будет иметь тенденцию быть более упорядоченным и менее подвижны , чем объем жидкости на границе раздела с образцом ^29,42,50. В результате,потребуется больше энергии для вибрационного наконечника AFM для вытеснения межфазных молекул жидкости , чем наливных ^42, что делает измерения очень чувствительны к локальным изменениям в межфазных свойств жидкости на наноуровне -The сольватации ландшафта.

Для того, чтобы использовать сольватацион- силы, несколько практических аспектов необходимо принимать во внимание. Во-первых, амплитуда колебаний наконечника должна быть сравнима с диапазоном сольватных сил, как правило, <1 нм. Во-вторых, жидкость, используемая должна образовывать четко определенный сольватации ландшафт на поверхности образца. Макроскопически, это равносильно тому, требующий «смачивание» жидкость для пробы рассматриваемой. Например, в воде, легче достичь разрешения на молекулярном уровне на гидрофильной слюды , чем на гидрофобной графита ^42,51. И, наконец, пружина кантилевера , поддерживающей наконечник должен быть выбран соответствующим образом ^52,53. При работе в этих конвиях, АФМ не только позволяют получать изображения молекулярного уровня интерфейса, но она также получает информацию о локальной аффинностью жидкого образца , который может быть использован для получения химической информации о поверхности образца ^54.

Наиболее распространенные динамические режимы работы для атомно-силовой микроскопии в жидкости являются амплитудной модуляции (АМ, также "режим кратковременного нажатия ') AFM и частотной модуляции (FM) AFM. В первом случае ^55, кончик растровой сканирует образец , а его амплитуда колебаний поддерживается постоянной с помощью петли обратной связи , которая непрерывно повторно отрегулировать расстояние зонд-образец. Топографическая изображение образца получают из коррекции, применяемой цепи обратной связи. В FM-AFM ^28,41,56, то частота колебаний кантилевера / наконечником , который поддерживается постоянным , пока наконечник сканирует образец. Обе методики обеспечивают сравнимую топографическую разрешение в жидком ^36,57. Количественное взаимодействия зонд-образец имеет тенденцию быть более ес'иghtforward и точны в FM-AFM, но AM-AFM проще реализовать, более надежные, и позволяет работать с более мягкими консолями, что-то полезное для изучения легко деформируемых или тонкие образцы. Важно отметить, что AM-AFM более широко распространена среди пользователей AFM, частично по историческим причинам, но и из-за того, что технически легче контролировать.

Несмотря на то, амплитуда поддерживается постоянной с помощью цепи обратной связи во время формирования изображения АМ-AFM, фазовое запаздывание между колебанием кончика и движущую колебаний может свободно изменяться. Фазового запаздывания может дать полезную информацию о зонд-образец взаимодействия, имеющие отношение к энергии , рассеиваемой во время колебаний наконечника на границе с образцом ^58. Следовательно, фаза-изображения могут быть получены одновременно с топографической визуализации, и часто дополняют друг друга в освещении гетерогенность поверхности образца. визуализация фазы была использована для различного отображения взаимодействий, в том числе диRect отображение энергии сцепления ^42, вязко - упругих свойств ⁵⁸ и гидратной ландшафт интерфейса ^44.

Практически, получение изображений с высоким разрешением в жидкости остается нетривиальной из-за большого числа параметров для управления, а также отсутствие простого, систематического протокола, который работает в любой ситуации. Качество изображения , как правило , зависит от геометрии кантилевера и эластичности, химии наконечника, амплитуды колебаний и жесткости образца, среди других ^55. Измерения АФМ также, по определению, пертурбативые к системе. В результате, изменение переменных формирования изображения и условий окружающей среды без надлежащих условий может привести к трудностям в воспроизводимости и / или misrepresentative наблюдений и искаженных результатов.

Здесь мы представляем наш протокол для достижения изображений с высоким разрешением твердых и мягких образцов в растворе, с использованием коммерческих инструментов, эксплуатируемые в AMPL-модуляции широты места. Наша цель состоит в том, чтобы предложить практические процедуры для оптимизации основных параметров, могущие повлиять на решение по различным образцам, объясняя в каждом конкретном случае обоснование нашего выбора из физических принципов, лежащих в основе процесса формирования изображения. Мы подробно шаг за шагом подход, от очистки подложки и подготовки, к выбору кантилевера, настройка параметров визуализации и устранении наиболее распространенных неполадок. Объясняя научное обоснование нашего выбора и процедур высокого разрешения должно помочь сделать рациональный выбор при адаптации методологии, а также служить в качестве отправной точки для визуализации новых систем.

На протяжении всего этого текста мы используем AM для обозначения режима работы амплитудной модуляции АФМ. Мы имеем в виду параметра обратной связи поддерживается постоянным во время либо отклонения кантилевера (режим контакта) или амплитуды колебаний (режим AM) в качестве значения уставки. В режиме AM, кантилевер извне приводомлибо с помощью акустических колебаний или импульсным лазером, у основания кантилевера. Амплитуда привода интенсивность внешнего колебательного сигнала. Абсолютное значение амплитуды привода, необходимого для достижения заданной амплитуды колебаний кантилевера зависит от многих параметров, таких как метод вождения (акустических, фототермической или магнитным), консольные и фиксации параметров (жесткость, геометрия) и выравнивание лазера. Точное значение амплитуды привода, следовательно, не имеет значения, но оно регулируется в каждом эксперименте с тем, чтобы обеспечить соответствующий (и количественному) амплитуды колебаний кантилевера. Когда ведомая кантилевера находится далеко от образца и не демпфирование его вибрации не происходит через зонд-образец взаимодействия, его амплитуда колебаний называется амплитудой свободные колебания. По мере того как вибрирующий кончик приближается к поверхности образца, его амплитуда начинает уменьшаться. Если обратная связь включена, то г-пьезо будет константныеantly подрегулировать его расширение так, чтобы киль выбранной амплитуды заданного значения, константа. Заданное значение, как правило, всегда меньше, чем свободной амплитуды. Распространено в виду отношение уставки, отношение амплитуды заданного значения (амплитуды изображения) над свободной амплитудой. Чем меньше отношение заданное значение, тем более жесткими условия формирования изображения.

протокол

1. Очистка инструментов и других поверхностей

Примечание: При наведении на большой размер, любая форма загрязнения может иметь негативные последствия. Поэтому необходимо, чтобы гарантировать, что все инструменты, используемые для работы с образцом, подложки или AFM советы тщательно очищены. Следующее относится к любой поверхности или инструмента (например, пинцета) , которые могут вступать в контакт с образцом, консольных, или AFM клетки, в том числе самой стадии образца.

1. Ванна-разрушать ультразвуком инструменты в сверхчистой воде (18,2 МОм, <5 частей на миллион Organics), а затем изопропанолом (чистота 99,7%), а затем снова сверхчистой воды, каждый из которых в течение 10 мин. Когда это возможно, использовать изопропиловый спирт под вытяжкой для уменьшения вдыхания паров.
2. Сухое в токе азота.
3. Если полное погружение не представляется возможным (например, для консольного держателя / электроника), физически чистую поверхность, протерев однослойные, тканей с низким линт (малотоннажных тканей стеклоочистителей) , смоченным в ultrapuповторно водой, изопропанолом и сверхчистой водой, последовательно. Дайте поверхности высохнуть на воздухе (как правило, в пределах от 15 до 30 мин).

2. Подготовка основания

Примечание: Субстрат обозначает твердую поверхность, непосредственно поддерживающих образцы, как правило, в физическом контакте как сканер AFM и образцом. Большинство АФМ имеют магнитное крепление и стальные диски могут быть использованы, но тот же протокол также подходит для субстратов, таких как стеклянные слайды. Здесь мы предполагаем, стальной диск, на котором прикреплена слюды диск. Цель этой процедуры заключается в ограничении как можно больше внешних источников загрязнения, которые могут повлиять на визуализацию. Перчатки следует надевать во все времена.

1. Ванна-разрушать ультразвуком стальной образец диска в сверхчистой воде (18,2 МОм), а затем изопропанол, и, наконец, с помощью сверхчистой воды снова, каждый в течение 10 мин.
2. Сушат диски в токе азота.
3. Приготовьте небольшое количество эпоксидного клея с реагентами тщательно перемешивали и место ~ 1081, л на стальном диске.
4. Наклейте субстрат (мусковит слюда, SiO ₂ кристалл, стекло и т.д.) к стальным диском, применяя давление на подложке. Разрешить эпоксидной вылечить в течение нескольких часов при повышенной температуре (см спецификации производителя).
5. Убедитесь, что ни один эпоксидный непосредственно не подвергается воздействию воздуха, вокруг краев подложки. Это произойдет, если чрезмерное количество эпоксидной смолы используется и может стать источником загрязнения.
   1. Для подложки из слюды, плотно прижмите ~ 2,5 см в ширину клейкой ленты на подложку, так что все лицо покрыто, и плавно очистить его. С помощью слегка липкую ленту, и кожица слюду, потянув параллельно поверхности. Удаленный материал виден на ленте. Повторите эту процедуру 2-3 раза, пока слюда не зеркально-гладким на глазу.
   2. Для стекла / SiO _2, если требуется дальнейшая модификация химической поверхности, повторите ванны-Ультразвуком процедуру шагов 2,1-2,2. В качестве альтернативы, использовать UБлок V экспозиции (18 Вт UV-C бактерицидные лампы) в течение 30-60 мин, в зависимости от мощности), чтобы пиролиз любые органики, которые могут быть оставлены на поверхности. Эта процедура также оказывает поверхность более гидрофильной без существенного увеличения шероховатости.

3. Подготовка кантилевера и Совет

1. Опустить чип кантилевера в ванну с изопропанолом, а затем сверхчистой воды, каждый из которых в течение 60 мин.
2. Если кантилевер / наконечник требует тщательной очистки (например, после длительного хранения в коробке гель), добавьте 30 мин замачивания в ацетоне (> 99,5% чистоты) до стадии 1 (см также загрязнение раздел адресации). Хранения насадок в гелевых коробках, по нашему опыту, один из первичного источника загрязнения , которое может произойти очень быстро ^59.
3. Expose кончик к ультрафиолету на короткое время (<5 мин), чтобы способствовать формированию стабильных участков гидратации ^60. Избегайте более длительного времени Передержка, как это может повредить наконечник или инкрrease ее радиус кривизны.
4. Вставьте кантилевера в держатель кантилевера АФМ и пипеткой ~ 50 мкл раствора изображений (от природы раствора будет зависеть от образце исследуемого, но в этом случае используют 10 мМ раствора хлорида рубидия в сверхчистой воде) на консольные и кончиков предварительно смоченного его; это ограничит появление пузырьков воздуха при приближении образца.

4. Установить план AFM Cell

1. Установить образец диска и подложки, на стадии образца и добавить каплю жидкости (жидкость визуализации обычно 2-3 мм толщиной в самой высокой точке).
2. Подключите держатель кантилевера к АФМ.
3. Доведите кантилевера и образца в непосредственной близости с тем, чтобы сформировать капиллярный мост между жидкостями на кантилевер / иглой и образцом.

5. Инициализация измерения и калибровки кантилевера

1. Выровнять измерительный лазер (обычно красного цвета) близко к кончику-еН.Д. кантилевера. В зависимости от модели АФМ, сделать это либо с помощью программного управления или с помощью ручной настройки лазера позиции. Приобретать тепловой спектр кантилевера в жидкости (см рисунок 1А). Процесс записывает тепловые колебания кантилевера с помощью лазера, для того, чтобы найти частоту основного резонанса кантилевера (фундаментальной) собственной моды. В большинстве современных AFM, это делается с помощью автоматизированных процедур в режиме программного управления, но детали могут отличаться от атомно-силовой микроскопии для атомно-силовой микроскопии.

Рисунок 1: Настройка и калибровки кантилевера. A: Тепловой шум спектр вертикального отклонения кантилевера (черный) с помощью простого гармонического осциллятора (SHO) приступе основной собственной моды (красного цвета). Здесь резонанс 18,7 кГц в воде. Первые три резонансные частоты, которые соответствуют первым трем модам изгибных являются highlighted с синими стрелками. B: Калибровка кантилевера Обратные Оптический Lever чувствительности. Линейное отклонение кантилевера прижатой жесткой (не деформируемого) поверхности используется для измерения коэффициента преобразования (InvOLS) между отклонением измеренного в вольтах и ​​соответствующее значение в нанометрах. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Записать отклонение от расстояния кривой с кантилевера на жесткой подложке (например, слюды или стекла) и калибровки отклонения путем наложения , что наклон кривой в линейной области отклонения (как показано на рисунке 1В) равна единице ^{61 - 63.}
   Примечание: Этот процесс находит коэффициент преобразования между измеренным прогибом на фотодетектор (в вольтах) и реальное отклонение кантилевера (в нанометрах) - KNOшп как обратный Optical Lever чувствительность (InvOLS). Калибровка может повредить наконечник, так что лучше провести ее после того, как все измерения завершены. Используйте значение InvOLS производный для другого кантилевера того же типа, во время предыдущего эксперимента, чтобы получить оценку (обычно> 90% точности) истинного амплитуды перед калибровкой.
3. Установить резонансный пик в спектре теплового с простой модели гармонического осциллятора ^{64 - 66} с получением пружины кантилевера. Эта процедура автоматизирована в большинстве AFM программного обеспечения и обычно не требует специальных знаний о рассматриваемой модели.
4. Настройтесь кантилевер. Найти амплитудную кантилевера , когда извне приводом (например, акустически или путем фототермического возбуждения) в диапазоне частот , близких к его номинальной резонансной частоте. Установите вождения частоты к вблизи максимума в этом спектре, немного влево. Если кантилевер жащихstically приводом, многие поддельной максимумы могут появляться при настройке.
   1. Выберите резонансный пик как можно ближе к (и в пределах огибающей) резонанса, идентифицированной в тепловом спектре с использованием программного управления AFM, но специфика может зависеть от типа программного обеспечения и версию, которая контролирует AFM.

6. Подход и первоначальная проверка образца

1. Установите амплитуду движущую таким образом, чтобы амплитуда колебаний свободной составляет приблизительно 5 нм. Как правило, это соответствует 0,2-0,8 В на большинстве АФМ (в случае InvOLS не откалиброван). Отрегулируйте заданное значение амплитуды до ~ 80% от свободной амплитуды.
2. Настройте коэффициент усиления обратной связи относительно высокой (абсолютная величина зависит от AFM), но гарантировать, что никакой нестабильности или звона не происходит.
3. Установить начальную скорость сканирования и размер сканирования для малых значений (например, ~ 1 Гц и 10 нм соответственно). Это помогает сохранить наконечник в случае, если некоторые параметры обратной связи являются плохо настроенныеизбегая сканирования на большие расстояния. Размер сканирования может быть в дальнейшем увеличена до большего значения (например, 100 нм) , если условия сканирования появляются подходит.
4. Определить приблизительную высоту поверхности (в некоторых случаях это должно быть сделано оптически) до подхода.
5. Инициировать подход кончика по к поверхности с помощью программного обеспечения управления AFM. Мелкие детали этого процесса будет зависеть от модели AFM и используемого программного обеспечения.
   1. Если есть проблемы с подходом при использовании мягкого кантилевера, проводят подход в контактном режиме. В этом случае, убедитесь, что выгоды ниже, чем в режиме АМ, и установить заданное значение относительно низкого значения (0,1-0,2 V после центрирования лазера на фотоприемник), чтобы сохранить кончик.
   2. Оценка ли кончик достиг поверхности, не запуская к изображению путем незначительного изменения значения уставки (увеличение контактного режима или уменьшения в режиме AM). Если наконечник находится на поверхности, воздействие на тон расширение Z-пьезо должно быть незначительным. Живые движения Z-пьезо обычно отображаются графически в программном обеспечении управления большинства AFM. Если изменение уставки вызывает видимое движение пьезо, это указывает на ложный вступить в бой. В последнем случае, повторно начать подход от текущего положения зонда, используя несколько выше (контакт) или более низкое заданное значение (AM).
6. После того, как наконечник достиг поверхности, втяните Z-пьезо (как правило, просто нажав "стоп") и перенастроить кантилевера (шаг повторения 5.4.); резонансная частота, вероятно, сместились на более низкое значение из-за зонд-образец взаимодействий.
7. Изменение уставки до ~ 80% от вновь настроенная свободной амплитуды (при этом зонд-образец на расстоянии).
8. Engage кантилевера и провести 10 × 10 нм ² сканирования поверхности в режиме AM , чтобы убедиться , что параметры визуализации пригодны.
   1. Проверьте, что след (сканирование слева направо) и обратный ход (сканирования справа налево)Профили накладываться. Если это не так далее уменьшить заданное значение и попытаться увеличить коэффициент усиления.
   2. Опустите выигрыш, если изображение становится шумным.
9. Повторите операцию с большим - 1 × 1 мкм ² до 5 × 5 мкм ² - сканирование образца при условии , что это возможно. На мягких или биологических образцов, это может привести к загрязнению наконечника.

7. изображений с высоким разрешением

1. Уменьшение размера сканирования до значения , подходящего для визуализации функций (например, 100 × 100 нм ² для кристаллов протеина или 20 × 20 нм ² для слюды или кальцита).
2. Снизить привода амплитуды кантилевера достаточно для контура обратной связи для автоматического втягивания Z-пьезо и, следовательно, наконечник от поверхности. В то время как консольная находится далеко от поверхности, регулировать амплитуду привода, так что амплитуда кантилевера составляет ~ 1-2 нм (пик-пик).
3. С помощью программного обеспечения управления AFM, Progresключительно Снизить заданное значение несколько десятков мВ, в то время, пока Z-пьезо продляет снова к поверхности и исходное изображение восстанавливается. Держите амплитуду заданного значения от 75% до 95% новой свободной амплитуды.
4. Отрегулировать выгоды, используя программное обеспечение управления AFM; более высокие доходы могут быть использованы при более низких амплитуд без введения значительного шума.
   1. Повторите шаги 7.2-7.4, чтобы определить наилучшее сочетание свободной амплитуды, заданного значения и получить для высокого разрешения. Оптимальные условия зависят от образца (сольватации ландшафта и увлажняющих свойств жидкости), но и кантилевера (пружины, жесткость).
   2. Исследуйте различные комбинации амплитуд для оптимизации условий формирования изображения. Может возникнуть необходимость снова увеличить свободную амплитуду ^42. В таком случае регулируют первое заданное значение до более высокого значения , а затем увеличить диск (т.е. обратная процедура , чем используется для уменьшения амплитуды).
   3. Держите setpoiнт амплитуды в диапазоне от 0,5 нм - 1,5 нм (от пика до пика) с коэффициентами уставки поддерживается выше 0,7 (обычно 0,75-0,95). Для solvophilic интерфейсов, используйте кантилеверов с жесткости пружины 0,5 - 2 Н / м. Этого достаточно для наконечника, чтобы удалить большую часть жидкости на границе раздела фаз, не попав на поверхность. Правило большого пальца предлагается в экв. 4 ссылки ^29.

Результаты

Протокол, описанный в предыдущем разделе, была успешно применена с несколькими коммерческими АФМ для достижения или молекулярно-атомного уровня изображения. Все изображения были получены с рабочими амплитудами от 0,5 нм до 1,5 нм подбирается индивидуально в соответствии с процедурой шаги 7.1-7.4. Результаты могут быть получены в широком диапазоне мягкого (рисунок 2) и жесткой (рисунок 3) образцов. В каждом случае особенности интерес выдвинуты на первый план. Одним из главных преимуществ метода является то , что малые амплитуды колебаний и высоких заданных значений минимизировать усилие , оказываемое наконечником на образце, что позволяет хрупкими самостоятельно УЗЛАМИ липидов (рис 2А), белков (рис 2B и D), и амфифильные молекулы (фиг.2С) , чтобы быть отображены без ущерба в растворе. Труднее кристаллических материалов , таких как минералы (фиг.3А, B, D) иионы одного металла , адсорбированного на поверхности (рис 3в) можно визуализировать с использованием подхода , так как в каждом случае, это межфазное жидкость, которая эффективно визуализируют с помощью протокола , описанного. Сольватации силы сопоставимы на образцах , показанных на фиг.2 и 3: все образцы являются гидрофильными ( в более общем плане , "solvophilic" в случае рисунках 2в, 3В, 3D) относительно решения визуализации. Последовательно, кантилеверов с сопоставимой жесткости - использовали (0,2 0,8 Н / м) во всех случаях. Оба образца, так и кончик должен быть solvophilic, чтобы гарантировать, что жидкость молекулы образуют хорошо определенную структуру сольватации, которые могут быть отображены. Это не всегда является достаточным условием, но в большинстве случаев и для относительно небольших молекул жидкости, жидкость повторно структуры себя в пути, который имитирует симметрию образца. Основным фактором высокого разрешения является локальное изменение сродства адсорбированных молекул растворителядля поверхностей (ангстремных масштабе, в случае фиг 2А, 3А, 3С). Методика поэтому лучше всего подходит для материалов, где структура растворителя изменяется в значительной степени по всей поверхности.

Рисунок 2: Мягкие интерфейсы изображаемой с помощью AM-AFM в водных растворах. A: дипалмитоил-фосфатидилхолин (ДПФХ) липидный бислой в гелевой фазе отображается в в 150 мМ KCl. В шестиугольной упакованы липидные различимы полярных головных групп как в топографии и фазы, наряду с локальным контрастом с указанием конкретных участков изменения в гидратации. Б: Пурпурные мембраны Halobacterium Салинарум изображаемого в 150 мМ KCl, 10 мМ Трис, рН 7,4. Несколько бактериородопсина белка тримеры выдвинуты на первый план. Фаза демонстрирует контрастность, отличную от топографии из-за локальных гидратных участков на белках. Индивидуальные тримеров белка могут быть сделаны из (пунктирные линии). С: амфифильные краситель (Z907) молекулы , адсорбированные на поверхности наночастиц TiO ₂ в сенсибилизированных красителем солнечных элементов. Снимок был получен в этиловом-изопропил сульфона. Губчатую внешний вид создается адсорбированными молекулами красителя. D: аквапорин кристалл в родных бычьих мембран линз отображенных в том же буфере B. An аквапорин тетрамере подсвечивается. Суб-структура, соответствующая между спиральными петли видны в топографии в то время как фаза показывает разительно отличается контраст из-за необычного поведения воды вблизи белка. Изображения выполнены из работ ³⁶ (B), исх ³⁸ (С) и ссылка ⁶⁷ (D). Шкалы составляет 5 нм (А), 10 нм (В), 3 нм (C) и 15 нм (D) Цветовая шкала показывает соответственно высоту и фазы вариации 200 мкм и 15 ° (A), 600 м и 4 ° (В), 2,5 нм и 2,5 ° (С), и 1,6 нм и 9,5 ° (D).нагрузка / 54924 / 54924fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Представитель AM-АСМ изображения твердых образцов в жидких растворах. A: кальцита кристалл [ ] Поверхность отображается в равновесном растворе сверхчистой воды. Б: титанат стронция , полученный в изображается диметилсульфоксид (ДМСО). Высокое разрешение было невозможно в воде. C: мусковита отображается в 3 мМ RbCl - одиночных ионов Rb ⁺ адсорбированные видны на узлах решетки слюды в обеих фаз и высоты сканирования. D: карбид кремния в ДМСО отображается в. Ожидаемые кристаллографические механизмы представлены в образах B и D. Изображения выполнены из работы ⁶⁸ (A), реф ⁴² (B и D),и исх ⁴⁴ (С). Шкалы составляет 3 нм (А, В, D) и 5 ​​нм (С). Шкала цвета указывает на то, соответственно, высоту и фазовое изменение 250 мкм и 14 ° (а), 600 мкм и 5,5 ° (В), 800 часов и 15 & deg; (С), и 500 ч и 3,5 & deg; (D). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Предполагая, что жидкость формирования изображения и жесткость кантилевера были выбраны соответствующим образом, наиболее важные шаги для достижения успешного высокого разрешения являются регулировка амплитуды изображения, и общая чистота системы исследованной.

Амплитуды сравнима с толщиной межфазной области жидкости ( как правило , менее 2 нм) зондов в основном изменение свойств на границе раздела фаз растворителя ^42. Если амплитуда колебаний слишком велика, вибрирующий кончик будет проходить на большие расстояния, нелинейные силовые поля ⁵² , которые исключают стабильность движения кантилевера, и неизбежно попадают на образец , независимо от условий формирования изображения ^29, что приводит к ухудшению разрешения. Помимо потерь в разрешении, высшие гармоники начинают появляться в движении наконечника и система становится более сложной модели ^55. В качестве альтернативы, если амплитуда изображения слишком мала Oолько часть интерфейса зондировании ( как правило , определенные слои на границе раздела фаз жидкость) и стабильное изображение может быть достигнуто только с жесткими консолями (> 10 Н / м в воде ⁵³⁾ для удовлетворительного отношения сигнала к шуму, с риском повреждая мягкие образцы на больших вариаций высоты. Необходимость жесткой консолями является преодоление теплового шума, который может стать более значительным, что сигнал, измеренный при работе с малыми амплитудами, дальнодействующие взаимодействия между зондом и образцом все еще присутствуют, но в значительной степени постоянна и не влияют на с высокой разрешающей способностью контраст в изображениях, полученных.

Чистота окружающей среды формирования изображения имеет первостепенное значение, когда дело доходит до высокого разрешения атомно-силовой микроскопии. Нежелательные соединения в системе могут мешать как и в производстве силовой спектроскопии. Есть две основные категории загрязнений, которые имеют тенденцию влиять на эксперименты: (I) загрязняющие вещества непосредственно видны при визуализации ( Рисунок 4B, 4C) и (II) вообще необъяснимое отсутствие высокого разрешения. Случай (I) , как правило, происходят только в сильно идеализированных систем , таких , как на границе раздела вода-слюды , где адсорбированные молекулярные агрегаты , которые вмешиваются зонд-образец взаимодействия явно контрастируют с атомарно плоской поверхности слюды (рис 4а). Перед заменой зонда и образца, то стоит приобрести кривые спектроскопические с большим отклонением, эффективно нажав жесткий кончик против образца повторно. Это, как правило, повредить новый наконечник, но иногда может очистить грязный наконечник или вызвать устойчивые участки гидратации, пригодные для работы с изображениями. Этот наконечник будет, тем не менее, неизбежно, сглажены и, следовательно, быть пригодны только для плоского образца, даже если изображения улучшается. При подозрении на загрязнение более жестких образцов, может быть стоит пытаться изображению со второй собственной моде кантилевера перед попыткой несколько деструктивную процедуру, описанную выше. Это просто требует ЕОзуд частота вынуждающей ко второй собственной моды и перенастройки амплитуды / заданного значения (см обсуждение по устранению неисправностей ниже). Эффективная жесткость увеличивается значительно консольных при работе на второй и любой собственной моды слабо адсорбируются загрязнителем может быть оттолкнул наконечником в то время визуализации. Эта стратегия не заменяет необходимость чистого образца и наконечника, но предлагает некоторые дополнительные пути, чтобы получить удовлетворительные изображения, когда наконечник / образец явно не является идеальным.

Рисунок 4: Примеры загрязнения , наблюдаемые при визуализации мусковита, ингибирующие изображений с высоким разрешением. Ответ: Mica отображается в 5 мМ RbCl - никакие загрязняющие частицы не видны. B: Заражение принимая форму агрегатов порядка десятков нанометров в то время получения изображения в номинально сверхчистой воды. C: Самоорганизующиеся структуры , образованные загрязЧастицы NAnt предположительно амфифильные в природе. Визуализацию снова проводили в номинально сверхчистой воды. D: Вертикально смещенные участки , соответствующие пунктирными линиями A, B и C , иллюстрирующих отклонение от атомарно плоской поверхности слюды в. Шкала баров в A, B и C соответствуют 300 нм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Случай (II) является более распространенным и характеризуется в основном разочарование тем, что особенности субнанометровым просто не может быть решена, независимо от условий формирования изображения. Подпись такого рода ситуации, как правило, видны при измерении силы спектроскопии, которые, как правило, чтобы показать некоторые несоответствия. Они могут включать в себя плохо воспроизводимые кривые и амплитуду против расстояния кривых , которые существенно отличаются от типичного сигмовидную форму ^42. Если загрязняющих веществ, ионных или иначе, являются Dispersе изд равномерно по всему жидкости, они могут не отображаться в топографической визуализации , но может нарушить структуру гидратации образца ^69, которая имеет решающее значение для поддержания регулярного взаимодействия зонд-образец ²⁹ и получения высокого разрешения ^70. Там также может быть прямое воздействие загрязняющих веществ на образце, особенно в мягких биологических экспериментов. Например, хорошо известно , что присутствие спиртов (от процедуры очистки) может разжижения гель-фаза бислоев ^{71 - 73,} разрешение визуализации уровня субнанометровым невозможно. Если высокого разрешения не представляется возможным, следует в первую очередь принимаются в процессе очистки, обращая особое внимание на любое оборудование, которое вступает в контакт с раствором визуализации. Даже якобы стабильные соединения, такие как эпоксидная смола может сольвата в жидкости до некоторой степени, если не полностью излечена.

Высокое разрешение изображения с AM-AFM требует, требует терпения ичасто несколько испытаний до достижения наилучших условий обработки изображений. Небольшие экспериментальные проблемы могут легко стать достаточно важным, чтобы предотвратить навыки высокого разрешения и поиска неисправностей являются существенными. Далее мы перечислим некоторые из наиболее распространенных проблем, с которыми мы столкнулись с предложенной нами решения.

настройка Консольные

Большинство коммерческих АФМ используют акустического возбуждения для привода кантилевера. В таком случае, настройка кантилевера, как описано на стадии 5.4, вблизи его резонансной частоте часто обеспечивает достаточную производительность для работы на воздухе. В жидких средах, жидкость имеет тенденцию вызывать некоторую связь между различными механическими частями AFM, таких как консольного чипа и держателем. Это может повлиять на кажущуюся резонанс кантилевера, часто иллюстрируется с помощью частотного спектра кантилевера, который демонстрирует много резких пиков и долин обычно описывается как "лес пиков". В результате, часто бывает трудно найти соответствуюкт частоты привода. Эти пики существуют также в газовых средах, но из - за высокой стоимости добротности кантилевера, амплитуда при резонансов значительно больше ^74,75. В жидкости выбора соответствующего пика для привода кантилевера может быть не так просто и может потребовать метод проб и ошибок. На практике, пик частоты с крутого изменения амплитуды в "лесу" пиков вокруг резонансной частоты, как правило, лучший выбор, несмотря на то, не обязательно точно на резонанс и часто обеспечивает частоту вождения достаточную для получения изображений с высоким разрешением.

искажение изображения

Дрейф изображений часто является проблемой при поиске с высокой разрешающей способностью и делает изображения выглядят искаженными (как правило, растягивается). Его происхождение , как правило , тепловой, либо потому , что сканер / АФМ не достиг равновесного рабочей температуры, или потому , что часть образца жидкости быстро тает (например, изображения в спиртах ). Во всех случаях, дрейф становится пренебрежимо малым при тепловом равновесии. Поэтому полезно, чтобы фиксировать температуру образца, если это возможно. В противном случае, стоит оставить AFM для сканирования пустой образец (большой размер сканирования при медленной скорости сканирования) в течение нескольких часов перед проведением эксперимента. Если испарение не является проблемой, эта процедура лучше всего делать после того, как на шаге 6 процедуры, следя за тем, чтобы сначала снять кончике короткое расстояние (например, 20 мкм) от поверхности. Время от времени, дрейф будет сохраняться даже после обширного термализации. Как правило, это указывает на то, что консольная или его чип частично перетащить образец во время формирования изображения, то, что может произойти на мягких липких образцов, таких как тонкие пленки или если кончик / консольные / чип не соответствующим образом размещены. На чипах, которые принимают более одного консольного / наконечник, часто бывает полезно, чтобы сломать кантилевера, которые не используются, а не позволить им тащить по поверхности.

Ионная сила

ntent "> Поскольку визуализация доминирует на границе раздела фаз жидкость, иногда полезно добавить немного соли для изображений с высоким разрешением заряженной поверхности в воде. Роль соли в два раза. Во-первых, он изменяет гидратной ландшафт поверхность изображается при адсорбции, которая часто усиливает контраст. Во- вторых, это помогает экран сильного электростатического взаимодействия между зондом и образцом (например, на слюде). Как правило, более крупные ионы , такие калий, рубидий и цезий позволяют лучшие изображения из - за их специфических свойств гидратных ^76, а также тот факт , что они часто адсорбируют в основном в уникальном гидратной состоянии ^77.

Bad кантилевера / наконечник

Если есть подозрение, что кантилевер является источником загрязнения (см симптомы, описанные выше), она должна быть сначала проверены под оптическим микроскопом. При хранении в коробке геля, кантилевер может подобрать следы полимеров геля или силиконовое масло ⁵⁹ , которые могут появиться, В крайнем случае, когда темные пятна, на задней стороне кантилевера (как на рисунке 5А). Фототермический колебаний кантилевера может вызвать подобные пятна, но они из-за деградации / перегрева консольной покрытия с помощью задающего лазера. Заражение, как правило, возникает случайным образом на кантилевер. Более длинный (12 ч), очистка с помощью изопропилового спирта, а затем и сверхчистой водой может удалить любые нежелательные частицы от кантилевера.

Рисунок 5: Сравнение между новой кантилевера и идентичной той , которая широко применяется на твердых поверхностях , и оставленной в коробке геля в течение длительного периода времени. A: Верхняя часть ; оптическое изображение совершенно новой консоли, которая была очищена (см процедуру). Дно; оптическое изображение демонстрирует появление видимых загрязнений (синяя стрелка) из коробки геля. B: Сравнение соответствующих спектров теплового консолями.Уширение первого резонансного пика старого кантилевера ясно (зеленая стрелка) и некоторые режимы высшего порядка усиливаются (синяя стрелка). Спектры были вертикально смещения и представлены на двойном логарифмическом масштабе для ясности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Если требуемое разрешение субнанометровым не достигается, несмотря на приемлемые изображения с более низким разрешением, вполне возможно, что наконечник AFM стал химически модифицирована в процессе его среды хранения. Это можно лечить с помощью облучения чипа консольно к ультрафиолетовому окислителем в течение 120 сек, что способствует созданию гидрофильных поверхностных групп на наконечнике ^60. Необходимо следить за тем не менее, так как точное время, необходимое может варьироваться в зависимости от геометрии зонда и УФ мощности, и чрезмерное воздействие может привести к притупление наконечника и уменьшенным разрешением.

Тепловой шум

Изображения с высоким разрешением требует большой чувствительности к изменениям силы и расстояния ( как правило , к югу от П.Н. сил и суб-Ангстрем расстояния ^78). Для получения более мягкого консолями, тепломеханической движение кантилевера из-за своей внутренней броуновским движением (тепловой вибрации) может быть проблемой. В первом приближении, с кантилевера жесткости к, что невозможно измерить особенности меньше , чем , Амплитуда теплового шума, где к _B постоянная Больцмана и Т-температура. Практически, с помощью кантилевера с более высокими частотами резонанса распространяется шум в более широком диапазоне частот, а также снижает общий уровень шума в полосе измерения ^79.

Выше изображения собственных мод

Иногда может быть полезно для работы кантилевера на его второй собственной модыблагодаря эффективной жесткости увеличения (см обсуждение загрязнения). Практически, это сделано просто путем приведения в движение кантилевера на своей второй собственной моде (второй резонансный пик при более высокой частоте, см Фигура 1А). При настройке кантилевера, просто выбрать вторую собственную моду вместо основного резонанса и перейдите к шагу 5.4. Обратите внимание, что InvOLS будет отличаться, когда кантилевер приводится в действие второй собственной моды; как правило, ~ 1/3 из InvOLS измеренных на шаге 5.2 для прямоугольного кантилевера.

Основным ограничением метода является то, что она требует стабильной сольватации ландшафта на поверхности образца. Образец должен быть достаточно прочным, чтобы позволить возмущающих на границе раздела фаз жидкость, не вызывая существенной деформации самого образца. Это может быть сложным на очень мягких и нестабильных образцов таких крупных биомолекул. Кроме того, малые амплитуды АФМ, как описано здесь, не может получить механическую информацию о рЕ СВОЙСТВА из образца, а кончик кантилевера проводит большую часть своего времени в границе раздела фаз жидкость. Для этого, это может быть полезно использовать другие подходы , такие как количественное наномеханическим Mapping ⁸⁰ или использовать высшие гармоники движения кантилевера. Высшие гармоники , как правило , усиливается при визуализации в жидкости (с низким качеством-факторов) ^{29,81 - 83} и может обеспечить одновременно топографию и жесткость образцов ^{25,81 - 84} , но они , как правило , наносит ущерб большой размер. Другие ограничения, присущие всем методам сканирующей зондовой микроскопии по-прежнему действует здесь, в частности, тот факт, что результаты неизбежно содержат информацию об измерительном наконечнике. Использование малых амплитуд тоже не является идеальным для образцов с большими вариациями высоты; петля обратной связи, неизбежно будет реагировать медленнее, когда вариации высоты больше, чем амплитуда изображения, следовательно, рискуя образцом и зондом повреждения. Использование OF мягче кантилевера смягчает эту проблему до некоторой степени.

Основное преимущество метода, представленного здесь является тот факт, что она обеспечивает высокое разрешение изображения, возможное с AFM в жидкости, но может быть реализован на любом коммерческом AFM, при условии, что уровень шума машины достаточно низки. Сопоставимые разрешение на коммерческих инструментов обычно достигается в режиме контакта, а иногда и в FM-АФМ с жесткими консолями. Работа в режиме AM-и относительно мягкими консолями позволяет более широкий выбор образцов, и проще реализовать, чем FM-AFM на большинстве систем. Подход основан на использовании силы сольватации существующих на границе раздела между любой твердой и жидкой для повышения разрешения и получить местную химическую информацию. Он может, в принципе, можно использовать в условиях окружающей среды, полагаясь только на слоях воды (как правило, в несколько нанометров толщиной) нарастают на большинстве поверхностей из-за влажности воздухоочистителя. Принципы, лежащие в основестратегия высокого разрешения остаются неизменными , но большая часть наконечника находится в воздухе, только с капиллярным мостом между вершиной зонда и образца ^85. Высокое разрешение было продемонстрировано на жестких образцах в этих условиях ^86,87. Условия формирования изображения, однако, отличаются от тех, погруженного жидкости из-за более высокой добротности колебаний кантилевера. Практически, мы обнаружили, что трудно добиться стабильной работы над мягкими или нерегулярных образцов, предположительно из-за временных изменений капиллярного моста и увеличение добротности для данного кантилевера жесткости.

Протокол, описанный здесь, предлагает методологию для достижения разрешения изображения на молекулярном уровне образцов в жидкости с большинством современных коммерческих AM-АФМ. Мы предлагаем научное обоснование нашего выбора параметров обработки изображений и подчеркнуть роль сольватации сил. Мы также обсудить общие проблемы и, в частности, загрязнения. Конкретные зонд-образец взаимодействия CAп варьируются значительно в зависимости от содержания решения обработки изображений, геометрии кантилевера и материалов, а также в области химии образца. Практическое понимание природы доминирующих сил, присутствующих во время сканирования Поэтому крайне важно, чтобы адаптировать этот протокол к новым системам и обеспечить надежные результаты. После оптимизации, экспериментальный подход является мощным , чтобы получить на месте локальные идеи молекулярном уровне образцов в растворе.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multimode IIIA AFM	Brucker	NA	One of the machine used
Cypher ES AFM	Asylum Resarch	NA	One of the machine used
AFM cantilever/tip	Nanoworld	Arrow UHF-AUD	best for high frequency
AFM cantilever/tip	Olympus	RC800-PSA	versatile and cheap
ultrapure water	Milipore	NA	lab filtering systems can induce contamination
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aaldrich	200-664-3	standard chemical, no further purification
Monovalent salts	Sigma-Aaldrich		standard chemical, no further purification
Lipids	Avanti polar lipids		lipid bilayers formed using stadard protocols
Crystals	MTI		polished crystals
Scotch tape	3M	Scotch Magic Tape	Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly