Поколение человеческих моноцитов дендритных клеток из цельной крови

Резюме

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Аннотация

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.

The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Введение

Дендритные клетки (ДК) являются наиболее важными специализированными антиген-представляющих клеток нашей иммунной системы. Незрелые РС (IDCS) находятся в коже или в тканях слизистой оболочки и поэтому среди первых иммунных клеток, чтобы взаимодействовать с вторгающихся патогенов. Контроллеры домена представляют собой мост между врожденной и адаптивной иммунной системы ^1, так как они могут активировать Т- и В-клеточные реакции после обнаружения патогенных микроорганизмов. Кроме того, они способствуют провоспалительных иммунных реакций, из-за выделения больших количеств цитокинов, таких как IL-1, IL-6 и IL-12. Контроллеры домена также активирует клетки NK и привлечь другие иммунные клетки к месту инфекции хемотаксиса.

Контроллеры домена могут быть разделены на незрелые дендритные клетки (МССД) и зрелых дендритных клеток (MDCs) ² на основе их морфологии и функции. После распознавания чужеродных антигенов одним из множества распознающих рецепторов (например, Toll-подобные рецепторы, С-типалектины, или дополнять рецепторы) в большом количестве экспрессируется на поверхности клетки, IDCS претерпит серьезные изменения и начинают созревать. Во время этого процесса созревания, рецепторы для захвата антигена вниз регулируется, в то время как молекулы , необходимые для презентации антигена являются повышающей регуляции ^3. Зрелые контроллеры домена до регулировать основных комплексов гистосовместимости I и II (MHC I и II), Co-стимулирующего молекулы, такие как CD80 и CD86, которые имеют важное значение для презентации антигена и активации Т-лимфоцитов. Кроме того, экспрессия рецептора хемокина CCR7 на поверхности клеток индуцируется, что позволяет миграцию контроллеров домена из периферических тканей к лимфатическим узлам. Миграция способствует "прокатки" ДК вдоль хемокинным лиганда 19 (CCL19 / MIP-3b) и хемокина лиганд 21 (CCL21 / SLC) градиента к лимфатическим узлам ^4-6.

После миграции, MDCs представить обработанный антиген наивных CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т - клеток, таким образом , иниtiating адаптивный иммунный ответ против вторгшегося возбудителя ^7. Это взаимодействие с Т - клетками в лимфатических узлах , также связано с распространением вируса ^8. Другие исследования в пробирке показали , что контроллеры домена эффективно захвата и передачи ВИЧ Т - клеток и что это результаты передачи в энергичном инфекции ^9-12. Эти эксперименты подчеркивают , что в естественных условиях РС ВИЧ подвиги , как челноки от периферии к лимфатическим узлам. Во время презентации антигена, контроллеры домена выделяют ключевые интерлейкины, которые формируют дифференциацию эффекторных Т-клеток-хелперов, и, следовательно, исход всего иммунного ответа против микроба определяется при этом самого взаимодействия. Помимо типа 1 (Th1) и типа 2 (Th2) эффекторные Т - клетки, другие подмножества клеток - хелперов CD4 ⁺ Т (например, тип 17 (Th17) и тип 22 (Th22) Т - клетки) были описаны, и их индукция и функции были тщательно исследованы. ДК, кроме того, участвует вгенерация регуляторных Т - клеток (Tregs) ^13,14. Эти клетки являются иммунодепрессивное и могут остановить или понижающей регуляции индукции или пролиферации эффекторных Т-клеток и, таким образом, решающее значение для развития иммунитета и толерантности.

Человеческие обычные контроллеры домена (CDCs) содержат несколько подмножеств клеток с миелоидного происхождения (т.е. клеток Лангерганса (LCS) и кожная и интерстициальные РСУ) или лимфоидной происхождения (т.е. плазмоцитов контроллеры домена (PDCs)). Для экспериментов в пробирке или стратегии вакцинации DC, моноцитов контроллеры домена , которые обычно используются в качестве модели для кожными контроллеров домена. Эти клетки демонстрируют сходство в физиологии, морфологии и функции с обычными миелоидные дендритные клетки. Они генерируются путем добавления интерлейкина 4 (IL-4) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) , моноцитов , выделенных из здоровых доноров ^12,15-18. Дендритные клетки также могут быть непосредственно выделены из дермальных или слизистыми биопсий, или может даже бе развился из CD34 ⁺ гемопоэтических клеток - предшественников , выделенных из образцов пуповинной крови , полученных ех внутриутробного развития. Здесь показано, как моноциты изолированы и стимулировали от анти-свернувшегося крови человека после того, как мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) обогащения центрифугированием в градиенте плотности. После инкубации в течение 5 дней, моноциты человека при определенных условиях дифференцированы в IDCS и готовы к экспериментальным процедурам в доклинических условиях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Этика заявление: письменное информированное согласие было получено от всех участвующих доноров крови Центрального института переливания крови и отдела иммунологические, Инсбрук, Австрия. Использование обезличенных образцов оставшимися в научных целях было одобрено Комитетом по этике Медицинского Университета Инсбрука мимо.

1. Обогащение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)

1. Концентрация МНПК центрифугированием.
   1. Открыть пакет крови и раздвоение кровь в стерильные 50 мл центрифужные пробирки, в зависимости от количества крови, полученной.
   2. При необходимости, отрегулировать громкость до 50 мл на каждую пробирку со стерильной Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (D-PBS).
   3. Место труб в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) без тормоза.
   4. Откачать верхний слой, содержащий плазму и тромбоциты, используя стерильный 10 мл серологические пипетки, оставляя boundarу слоя ненарушенных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если аутологичной плазмы вместо FCS используется в дополнение к культуральной среды, плазма должна быть собрана и термоинактивировали на этом этапе.
   5. Сбор мононуклеарных клеток (пограничные слои) из двух 50 мл центрифужные пробирки и переносят их в одну стерильный 50 мл трубки с помощью стерильной 10 мл серологические пипетки.
   6. Отрегулируйте громкость до 50 мл на каждую пробирку с использованием стерильной D-PBS.
   7. Место труб в центрифугу и вращать их со скоростью 400 мкг в течение 15 мин при комнатной температуре без тормоза.
   8. Откачать верхний слой, содержащий плазму и тромбоциты, используя стерильный 10 мл серологические пипетки, в результате чего пограничный слой нетронутой.
   9. Сбор мононуклеарных клеток (пограничные слои) из центрифужные пробирки по 50 мл и переносят их на две стерильные 50 мл пробирки для сбора с использованием стерильного 10 мл серологические пипетки.
   10. Отрегулируйте громкость до 50 мл на каждую пробирку со стерильным D-PBS.
2. разделениеМНПК путем центрифугирования в градиенте плотности (рис 1).
   1. Подготовьте четыре 50 мл пробирки и пипетки 15 мл градиента плотности среды в каждую пробирку.
   2. Возьмите 25 мл объединенном клеток / крови из коллекторной трубки (этап 1.1.10) и тщательно наложения градиента плотности среды.
   3. Место труб в центрифугу и вращать их со скоростью 700 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре без тормоза.
3. Сбор и очистка МНПК.
   1. Откачать верхний слой, содержащий плазму и тромбоциты, используя стерильный 10 мл серологические пипетки, оставляя слой РВМС без помех.
   2. Соберите интерфазу РВМС из всех трубок и объединить клетки в двух стерильных 50 мл пробирки с помощью стерильной 25 мл серологические пипетки.
   3. Отрегулируйте громкость до 50 мл на каждую пробирку со стерильным D-PBS. Место труб в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 15 мин при 4 ° C с тормозом.
   4. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливатьКлетки в стерильном D-PBS. Объединяют клетки с обеих трубок и регулировать объем до 50 мл стерильной D-PBS.
   5. Место труб в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
   6. Аспирируйте супернатант и повторно приостанавливать клетки в стерильном D-PBS. Настройка громкости до 50 мл стерильной D-PBS и 50 мкл в 1,5 мл пробирку, содержащую 450 мкл D-PBS.
   7. Вихревой 1,5 мл трубки энергично и подсчета клеток в камере Neubauer или любой другой инструмент подсчета клеток.
   8. Поместите 50 мл пробирки в центрифугу и вращать их при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.

2. Выделение моноцитов с помощью анти-CD14 человека магнитных частиц

1. Маркировку МНПК с магнитными частицами.
   1. Отрегулируйте концентрацию РВМС до 8 × 10 ⁷ клеток / мл с использованием буфера изоляции.
   2. Вихревые магнитные частицы CD14 против человеческого thoroughlу и добавить 50 мкл частиц на каждые 1 × 10 ⁷ МНПК.
   3. Смешайте суспензии клеток-частиц тщательно и инкубировать ее при комнатной температуре в течение 30 мин.
2. Разделение положительных и отрицательных фракций.
   1. Отрегулируйте объем до 12 мл с использованием буфера изоляции.
   2. Подготовьте шесть стерильных круглым дном пробирки и пипетки 2 мл клеточной суспензии частиц в каждую пробирку.
   3. Немедленно поместить пробирки на магните. Выдержите их в течение 10 мин при комнатной температуре.
   4. Держите трубки на магнит и осторожно оттянуть супернатант. Супернатант содержит негативную фракцию.
   5. Снимите трубку от магнита и добавьте 2 мл буфера изоляции.
   6. Аккуратно повторно приостанавливать клетки пипетированием вверх и вниз.
   7. Поместите трубки обратно на магнит. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре.
   8. Держите трубки на магнит и осторожно оттянуть супернатант. Супернатант содержит негативную фракцию.
   9. Удалить труб из магнита и добавляют 2 мл буфера изоляции в каждую пробирку. Аккуратно повторно приостанавливать клетки пипетированием вверх и вниз.
   10. Перенести положительную фракцию в стерильный 50 мл трубки и регулировать громкость до 50 мл с помощью стерильного D-PBS.

3. Стимуляция изолированных моноцитов с IL-4 и GM-CSF

1. Поместите пробирку в центрифугу и вращать его при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
2. Аспирата супернатант и повторно приостанавливать клетки в 50 мл D-PBS.
3. 50 мкл в 1,5 мл пробирку, содержащую 450 мкл D-PBS. Vortex 1,5 мл трубки энергично и подсчета клеток в камере Neubauer или другого счета сотового инструмента.
4. Поместите 50 мл пробирку в центрифугу и вращать его при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если отрицательная фракция, содержащая лимфоциты периферической крови (PBL,), также требуется, выполнить промывку и подсчета шагов похож на тшланг положительной фракции (шаги 3.1-3.5).
5. Регулировка концентрации клеток до 1 × 10 ⁶ / мл с помощью подогретого культуральной среды (RPMI 1640 , дополненной 10% инактивированной нагреванием FBS и 1% L-глутамина раствор) и пипеткой 3 мл / лунку на 6-луночных планшетах.
   Примечание: При использовании инактивированной нагреванием аутологичной плазмы, заменить 10% FCS с 1-5% аутологичной плазмы, в соответствии с экспериментальной установки.
6. Стимулируют моноцитов с рекомбинантного человеческого ИЛ-4 (250 ед / мл) и рекомбинантного человеческого GM-CSF (1000 ед / мл) с помощью пипетки цитокины непосредственно в культуральную среду. Инкубируют при 37 ° С и 5% СО _2.
7. Повторно стимулируют клетки ИЛ-4 (250 ед / мл) и GM-CSF (1000 ед / мл) через 48 ч пипеткой цитокины непосредственно в культуральную среду.
   Примечание: Если есть какие-либо признаки подкисления, показанные индикатором рН в среде, заменить половину среды с подогретого культуральной среды.
8. Урожай незрелых дендритных клеток на 5-й день в течениевниз по течению экспериментов пипетированием культивируемые клетки из 6-луночного планшета и в 50 мл центрифужные пробирки после пипеткой культуральной среды вверх и вниз несколько раз.
9. Граф клеток и окрашивать образец изолированных моноцитов с анти-человеческим антителам против CD11b, CD11c, и, DC-SIGN / CD209, вместе с жизнеспособность клеток красителя. Для того, чтобы избежать неспецифического связывания антител во время окрашивания поверхности, настоятельно рекомендуется использование рецептора Fc блокирующих реагентов или бычий сывороточный альбумин (БСА) буферы.
10. Анализ образца, используя жизнеспособность клеток краситель, в соответствии с протоколом производителя, выполняя проточной цитометрии для оценки чистоты и жизнеспособность генерируемых IDCS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

После центрифугирования анти-свернувшейся крови , используя подушку сахарозы, одноядерные клетки периферической крови (РВМС) обогащены в интерфазе на верхней части градиента плотности среды (рисунок 1). После того , как МНПК отсасывают, анализ FACS выполняется ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает генерацию моноцитов дендритные клетки (MDDCs) через изоляцию человеческих моноцитов из анти-свернувшейся крови с использованием магнитной наночастицы на основе анализа. В этом протоколе, этапы центрифугирования выполняют перед процедурой выделения клеток, что ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19	BD Biosciences	555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e	BD Biosciences	551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles	BD Biosciences	557769
BD Imagnet	BD Biosciences	552311
BSA (Albumin Fraction V)	Carl Roth	EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates	Costar	3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Bio-Sciences	17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Falcon 10 ml Serological Pipet	Corning	357551
Falcon 25 ml Serological Pipet	Corning	357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube	Corning	352070
Falcon Round-Bottom Tubes	Corning	352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a	BD Biosciences	555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent)	Tonbo biosciences	13-0870
GM-CSF	MACS Miltenyi Biotec	130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America)	Gibco	10500-064
Hettich Rotanta 460R	Hettich	---
IL-4 CC	PromoKine	C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x)	BD Biosciences	552362
L-Glutamine solution	Sigma-Aldrich	G7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin	VWR	211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2	BD Biosciences	555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46	BD Biosciences	551265
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0	Invitrogen	15575020