Иммунофлуоресцентный анализ образования гранулята после бактериальной выделения клеток млекопитающих

Резюме

Описывается метод качественного и количественного анализа образования гранулятов стенок в клетках млекопитающих после того, как клетки заражены бактериями и рядом различных стрессов. Этот протокол может быть применен для исследования реакции гранулы клеточного стресса в широком диапазоне хост-бактериальных взаимодействий.

Аннотация

Флуоресцентная визуализация клеточных компонентов является эффективным инструментом для исследования взаимодействия хозяев-патогенов. Патогены могут влиять на многие различные особенности инфицированных клеток, включая ультраструктуру органелл, организацию цитоскелетной сети, а также клеточные процессы, такие как образование стресс-гранулы (SG). Характеристика того, как патогенные процессы разрушают хост-процессы, является важной и неотъемлемой частью поля патогенеза. Хотя переменные фенотипы могут быть легко видны, точный анализ качественных и количественных различий в клеточных структурах, вызванных проблемой патогенов, необходим для определения статистически значимых различий между экспериментальными и контрольными образцами. Образование SG является эволюционно консервативным стрессовым ответом, который приводит к антивирусным ответам и уже давно изучается с использованием вирусных инфекций ¹ . SG также влияет на сигнальные каскады и может иметь другой, еще неизвестный консек² . Характеристика этой реакции стресса на патогены, отличные от вирусов, такие как бактериальные патогены, в настоящее время является новой областью исследований ³ . На данный момент количественный и качественный анализ образования СГ еще не используется обычно даже в вирусных системах. Здесь мы опишем простой способ индуцирования и характеризации образования SG в неинфицированных клетках и в клетках, инфицированных цитозольным бактериальным возбудителем, который влияет на образование СГ в ответ на различные экзогенные стрессы. Анализ формирования и состава SG достигается с использованием ряда различных маркеров SG и плагина детектора детектирования ICY, инструмента анализа изображений с открытым исходным кодом.

Введение

Визуализация взаимодействия хозяин-патоген на клеточном уровне является мощным методом получения информации о патогенных стратегиях и идентификации ключевых клеточных путей. Действительно, патогены могут использоваться в качестве инструментов для определения важных клеточных целей или структур, поскольку патогены развились, чтобы разрушить центральные клеточные процессы как стратегию их собственного выживания или распространения. Визуализация клеточных компонентов может быть достигнута путем рекомбинантного экспрессии флуоресцентно-меченых белков-хозяев. Хотя это позволяет проводить анализ в реальном времени, генерация клеточных линий с специфически меченными протеинами хозяина очень трудоемка и может привести к нежелательным побочным эффектам. Более удобным является обнаружение клеточных факторов с использованием специфических антител, поскольку одновременно можно проанализировать несколько факторов хозяина, и один из них не ограничивается конкретным типом клеток. Недостатком является то, что только статический вид может быть захвачен, поскольку анализ иммунофлуоресценции требует фиксации клетки-хозяинаион. Однако важным преимуществом иммунофлюоресцентной визуализации является то, что она легко поддается количественному и качественному анализу. Это, в свою очередь, может быть использовано для получения статистически значимых различий, чтобы дать новое представление о взаимодействиях хозяина-патогена.

Программы анализа флуоресцентного изображения являются мощными аналитическими инструментами для выполнения 3D и 4D-анализа. Однако высокая стоимость программного обеспечения и его обслуживание делают методы, основанные на бесплатном ПО с открытым исходным кодом, более привлекательными. Тщательный анализ изображений с использованием программного обеспечения для биоанализа ценен, поскольку он обосновывает визуальный анализ и при присвоении статистических значений повышает уверенность в правильности данного фенотипа. Ранее SGs анализировались с использованием бесплатного программного обеспечения ImageJ, что требует ручной идентификации отдельных SG ⁴ . Здесь мы предлагаем протокол для индукции и анализа клеточного SG-образования в контексте bacС использованием бесплатного программного обеспечения для анализа биоизображений с открытым исходным кодом ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Программное обеспечение для анализа биоизображения имеет встроенную программу обнаружения пятен, которая очень подходит для анализа SG. Он позволяет осуществлять точную настройку процесса автоматического обнаружения в определенных регионах интереса (ROI). Это устраняет необходимость в ручном анализе отдельных SG и устраняет смещение выборки.

Многие экологические стрессы вызывают образование SG, которые представляют собой фазовые плотные цитозольные, непембранные структуры диаметром от 0,2 до 5 мкм в диаметре ^5,6 . Этот клеточный ответ эволюционно сохраняется у дрожжей, растений и млекопитающих и возникает, когда глобальный перенос белка ингибируется. Он включает в себя агрегацию застопоренных комплексов инициации трансляции в SGs, которые считаются местами для трансляционно-неактивных мРНК, позволяя избирательный перевод подмножества клеточных мРНК.При удалении стресса растворы SGs и глобальные показатели синтеза белка возобновляются. SG состоят из факторов инициации трансляции элонгации, белков, участвующих в метаболизме РНК, РНК-связывающих белков, а также белков и факторов леса, участвующих в передаче сигналов хозяина ² , хотя точная композиция может варьироваться в зависимости от применяемого напряжения. Факторы окружающей среды, которые индуцируют образование SG, включают в себя голодное голодание, ультрафиолетовое облучение, тепловой шок, осмотический шок, стресс эндоплазматического ретикулума, гипоксию и вирусную инфекцию ^{2 , 7 , 8} . Значительный прогресс был достигнут в понимании того, как вирусы индуцируют, а также разрушают образование SG, в то время как мало известно о том, как другие патогены, такие как бактериальные, грибковые или простейшие патогены, влияют на этот ответ на клеточный стресс ^{1 , 7} .

ShigeLla flexneri - грамотрицательный факультативный цитозольный патоген человека и возбудитель тяжелой диареи или шигеллеза. Шигеллез является основным бременем общественного здравоохранения и ежегодно приводит к 28 000 смертей среди детей в возрасте до 5 лет ^{9 , 10} . S. flexneri заражает кишечный эпителий и распространяет клетку-клетку путем захвата цитоскелетных компонентов хозяина ^{11 , 12} . Инфекция эпителия поддерживает репликацию S. flexneri в цитозоле, но инфицированные макрофаги умирают в результате процесса воспаления клеточной смерти, называемого пироптозом. Инфекция приводит к массивному набору нейтрофилов и сильному воспалению, которое сопровождается теплом, окислительным стрессом и разрушением тканей. Таким образом, в то время как инфицированные клетки подвержены внутренним стрессам, вызванным инфекцией, такими как нарушение Гольджи, генотоксический стресс и перекрестная цитоскелетная перегруппировкаС, инфицированные клетки также подвергаются воздействию окружающей среды из-за воспалительного процесса.

Характеристика влияния инфекции S. flexneri на способность клеток реагировать на стрессы окружающей среды с использованием ряда маркеров SG продемонстрировала, что инфекция приводит к качественным и количественным различиям в составе SG ³ . Однако мало известно о других бактериальных патогенах. Здесь мы опишем методологию заражения клеток-хозяев цитозольным патогеном S. flexneri , стресс клеток с различными воздействиями окружающей среды, маркировку компонентов SG и качественный и количественный анализ формирования и состава SG в контексте инфицированных И неинфицированные клетки. Этот метод широко применим к другим бактериальным патогенам. Кроме того, анализ изображений SG-образования может быть использован для инфицирования вирусами или другими патогенами. Он может использоваться для анализа SGОбразование при инфицировании или влияние инфекции на образование SG в ответ на экзогенные стрессы.

протокол

1. Подготовка бактерий и клеток-хозяев

1. Передача стеклянной крышки на 12 или 14 мм соскальзывает в 24-или 12-луночные планшеты, соответственно, стерильным пинцетом, считая одну лунку на экспериментальное состояние. Стерилизовать их путем УФ-обработки в капюшоне для тканевой культуры в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Включите контрольные лунки для бактериального заражения и индукции SG посредством экзогенных стрессов.
2. Для 24-луночного планшета с покровным стеклом 12 мм высевают 1 × 10 ⁵ клеток млекопитающих ( например, клетки HeLa) на покровные стекла; Надавите покровные стекла стерильным наконечником пипетки. Пусть клетки прилипают в течение ночи при 37 ° С в инкубаторе с тканевой культурой с 5% СО ₂ в культуральной среде, подходящей для каждого типа клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Пластинчатые клетки, так что слияние клеток составляет от 40 до 60% на следующий день.
   1. Для клеток HeLa инкубируйте в модифицированной среде Dulbecco с модифицированной орлиной средой (DMEM) с несущественными аминокислотами (NEAA) и 10% разведенной сывороткой плодного теленка (FCS).Декомпозицию FCS путем нагревания в течение 30 минут на водяной бане с температурой 56 ° C, закручивая сыворотку один раз через 15 мин.
3. Чтобы вымыть бактерии, используйте стерильный наконечник пипетки, чтобы удалить небольшое количество из бактериального глицерина (20% глицерина), хранящегося в морозильнике -80 ° C, и поместить его на этикетку. Используйте стерильную петлю для распространения бактерий примерно на 10% от пластины. Используйте новую стерильную петлю и протащите ее через мазок, чтобы сделать 3 параллельные линии, половину пластины. Проведите через эти линии, покрывающие остальную часть пластины. Инкубируйте пластину O / N при 37 ° C.
   1. Выберите одну бактериальную колонию ( например, S. flexneri ) из свежесобранной пластины. Избегайте работы с бактериальными колониями старше 1 недели.
   2. Для штамма S. flexneri M90T инокулируют красную колонию из свежесваренной трипсиновой соевой агара-0,1% Конго-красного агара в 8 мл триптического соевого бульона в пробирке объемом 15 мл; Затяните крышку и инкубируйте, встряхивая при 222 об / мин, O / N при 306; С.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Не используйте большие белые колонии, поскольку они потеряли плазмиду вирулентности и не являются инфекционными.

2. Бактериальная проблема клеток-хозяев

1. Подготовьте бактерии, чтобы максимизировать инфекционный потенциал.
   1. Для S. flexneri , субкультурные бактерии, добавляя 150 мкл O / N культуры к 8 мл триптического соевого агара и инкубации, встряхивая 222 об / мин при 37 ° C до поздней экспоненциальной фазы (~ 2 часа), чтобы индуцировать экспрессию гена вирулентности и усиливать инфекцию.
      1. Когда культура имеет оптическую плотность от 0,6 до 0,9 (измеренную при 600 нм), перенос 1 мл культуры в пробирку объемом 1,5 мл. Бактерии гранул в течение 2 мин при 8000 мкг и ресуспендируют в инфекционной среде (DMEM с NEAA, без FCS) при OD ₆₀₀ = 1. Таким образом, если OD ₆₀₀ составляет 0,85, ресуспендируют в 850 мкл.
         ПРИМЕЧАНИЕ. Для S. flexneri, при OD ₆₀₀ = 1, будет 8 x 10 ⁸ бактерий на мл, еслиКультивировали в 8 мл среды. Множественность заражения (МВД) 20 подходит. Для других патогенов количество бактерий на мл при OD ₆₀₀ и соответствующее МВД необходимо определить эмпирически.
   2. Для усиления взаимодействия бактерий-хозяев покрывают бактерии поли-L-лизином (PLL).
      ПРИМЕЧАНИЕ: PLL-обработка S. flexneri не влияла на динамику SG. Другие патогены необходимо оценить для их пригодности к лечению PLL.
      1. Чтобы покрыть бактерии PLL, центрифугируют 1 мл бактериальной культуры в течение 2 мин при 8000 × g, а затем ресуспендируют гранулу в 10 мкг / мл PLL в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) при OD ₆₀₀ = 1.
      2. Добавьте бактериальный раствор в маленькую тарелку, такую ​​как лунку в 12-луночный планшет, и инкубируйте при комнатной температуре (~ 20 ° C) в течение 10 минут с осторожным перемешиванием на шейкере.
      3. Бактерии гранул в течение 2 мин при 8000 xg, удалите избыток PLL. Ресуспендируют гранулу в 1 мл PBS иD повторите эту операцию промывки дважды. После окончательной промывки ресуспендируют в инфекционной среде при OD ₆₀₀ = 1.
         ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь инфекционная среда для S. flexneri представляет собой среду клеток-хозяев с 20 мМ HEPES без FCS.
2. Подготовьте клетки для бактериального заражения.
   1. Удалите среду из клеток HeLa млекопитающих с помощью всасывающего насоса. Добавить 500 мкл среды RT HeLa для мытья клеток, завихрения, удаления среды с помощью всасывающего насоса и заменить 500 мкл RT соответствующей инфекционной среды ( например , среду клеток-хозяев с 20 мМ HEPES без FCS).
   2. ПРИМЕЧАНИЕ. Для всех этапов мытья быстро работайте и обрабатывайте только до 4 покровных покрытий за раз, чтобы избежать высыхания клеток.
3. Вызовы подготовили клетки HeLa с бактериями для инфицирования 20-50% клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Соответствующее время и МВД необходимо определить для каждого вида бактерий. Как правило, хороший старт составляет 30 мин при 37° C с МВД 10.
   1. Для S. flexneri выявить клетки клеток HeLa, используя один из двух методов (шаг 2.3.1.1 или 2.3.1.2).
      1. Спиновые не-PLL-обработанные бактерии (20 мкл OD ₆₀₀ = 1 / лунка 24-луночного планшета в среде 500 мкл) на клетки в течение 10 минут при 13000 x g.
      2. Добавьте бактерии, покрытые PLL (15 мкл OD ₆₀₀ = 1 / лунка 24-луночного планшета в среде 500 мкл) в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы бактерии могли оседать на клетки.
   2. Позвольте инфекции произойти, поместив клетки с поселенными бактериями в инкубатор для культивирования ткани 37 ° C в течение 30 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В течение коротких временных интервалов синхронизируйте инфекцию S. flexneri , помещая пластины в водяную баню с температурой 37 ° C в течение 15 минут, а не в инкубатор для тканевой культуры.
4. Остановите инфекцию путем мытья клеток.
   1. Чтобы промыть клетки и удалить лишние бактерии, удалите среду с помощью всасывающего насоса, добавьте 1 млСвежую предварительно нагретую (37 ° C) культуральную среду HeLa (DMEM, 10% FCS, NEAA). Переверните среду, удалите и замените свежей средой. Повторите дважды и оставьте свежую среду на ячейках.
      1. Для S. flexneri или других внутриклеточных бактерий, после инфицирования клеток HeLa и моющих средств, замените среду стандартной средой для тканевой культуры, содержащей 50 мкг / мл гентамицина, чтобы убить внеклеточные бактерии и предотвратить дальнейшее вторжение клеток.
         ПРИМЕЧАНИЕ. Не добавляйте антибиотики в среду для внеклеточных бактерий.
5. Инкубируйте бактерии с клетками в течение требуемого количества времени в инкубаторе тканевой культуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для S. flexneri инфекция может достигать 6 часов в зависимости от типа клетки. Для клеток HeLa пусть инфекция протекает в течение 1,5-2 часов, прежде чем добавлять экзогенные стрессы, чтобы индуцировать образование SG. Для инфекций Caco-2, при которых Shigella распространяется клетка-клетка, инфицируйте в течение 30 мин до 6 ч, прежде чем добавлять экзогенный стресс. CeLls могут быть зафиксированы в этой точке без добавления экзогенных стрессов для оценки образования SGs в результате бактериальной инфекции (в этом случае перейдите к разделу 4).

3. Индуцирование образования гранулятов путем добавления экзогенных стрессоров

1. Удалите среду из инфицированных и неинфицированных клеток HeLa с помощью всасывающего насоса, замените среду на 500 мкл соответствующей среды с или без стрессора и инкубируйте.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Условия, вызывающие стресс, включают следующее (см. Ниже). Для дополнительных обработок см. Kedersha et al . ¹³ .
   1. Для обработки теплового шока используйте обычную среду, содержащую 20 мМ HEPES, и поместите пластину на водяную баню 44 ° C в течение 30 минут.
   2. Для лечения клотримазола (индуцирует митохондриальный стресс) используйте обычную среду без FCS с 20 мкМ клотримазолом и инкубируйте в инкубаторе для тканевой культуры в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Храните одноразовые аликвоты 20 мM клотримазола в диметилсульфоксиде (ДМСО) при -20 ° С в течение 4 месяцев. Используйте автомобиль DMSO для контрольных ячеек.
   3. Для лечения арсенита (индуцирует окислительный стресс) используйте обычную среду с 0,5 мкМ арсенита и инкубируйте в инкубаторе тканевой культуры в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Храните одноразовые аликвоты в количестве 0,5 мМ арсенита при -20 ° C в течение 6 месяцев.
      ВНИМАНИЕ: Клотримазол и арсенит вредны и опасны для окружающей среды и должны быть утилизированы соответствующим образом.
   4. Для лечения Des-Methyl Des-Amino (DMDA) -патеамина (ингибирует инициацию трансляции эукариот) используют обычную среду с 50 - 200 нМ DMDA-патеамина и инкубируют в инкубаторе с тканевой культурой в течение 1 часа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Храните DMDA-патеамин при -80 ° C. Храните реагенты в виде небольших аликвот, чтобы избежать замораживания оттаивания.

4. Фиксация и анализ иммунофлуоресценции образования гранулята

ПРИМЕЧАНИЕ. Обработайте контроль иЭкспериментальные покровные стекла в то же время, чтобы избежать различий окрашивания, которые могут повлиять на анализ изображений на последующих этапах. Контрольные образцы не включают инфекции и без SG-индуцирующей терапии, а также инфицированные образцы с и без SG-индуцирующего лечения.

1. Удалите среду полностью с помощью всасывающего насоса и зафиксируйте образцы, добавив 0,5 мл RT 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: PFA вредно для обработчика и окружающей среды. Соблюдайте надлежащую меру для защиты обработчика и утилизации химических отходов.
   ПРИМЕЧАНИЕ. В качестве альтернативы, зафиксируйте в течение 15 минут, а затем замените метанолом -20 ° C с предварительной обработкой в ​​течение 10 минут, чтобы сохранить большую цитоплазматическую локализацию маркеров SG ¹³ .
2. Удалите PFA с помощью пипетки и утилизируйте жидкость в соответствующем контейнере для отходов. Промывают покровное стекло 1 мл трис-буферного солевого раствора (TBS: 25 мМ Трис, pH 7,3, 15 мМ NaCl). Инкубируйте покровное масло в течение 2 мин с осторожным встряхиваниемНа шейкере во время стирки.
3. Полностью удалите TBS с помощью всасывающего насоса и добавьте 500 мкл 0,3% Triton-X100 в TBS в течение 10 минут для проницаемости клеток.
4. Удалите пермеабилизирующий раствор с помощью всасывающего насоса. Замените 1 мл TBS, осторожно закрутите пластину, удалите TBS путем всасывания и добавьте 1 мл блокирующего раствора (5% FCS в TBS) в течение 1 часа при комнатной температуре.
5. Подготовьте первичный раствор антител (разведение 1: 300) в 5% FCS в TBS. Рассчитайте 50 мкл на 12 мм покровное стекло и сделайте достаточно для всех покровных в одной партии.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Общие первичные антитела, которые используются, предназначены для целевых G3BP1, eIF3b и TIA1.
6. Пятно 50 мкл первичной смеси антител на пластиковую парафиновую пленку (парафильм) прочно наклеивают на скамью или в камеру.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Список канонических SG-маркеров приведен в Таблице материалов , но состав SG может зависеть от применяемого напряжения. Другие маркеры SG перечислены в Kedersha et al. ¹³ Ожидаемые результаты для ряда маркеров SG для инфекции S. flexneri приведены в таблице 1 .
7. Возьмите покровное с помощью пинцета, нанесите край покровного на ткань, коротко отпустите пинцет, чтобы удалить лишнюю жидкость, и аккуратно положите лицо вниз на каплю. Инкубируйте покровные вещества в течение 1,5 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С во влажной камере.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы подготовить влажную камеру, поместите предварительно уложенные ткани по краям плотно закрытой камеры, облицованной пластиковым парафилом.
8. Перенесите каждое покровное стекло пинцетом в лунку новой 24-луночной планшеты, заполненной 1 мл TBS; Инкубировать с осторожным встряхиванием на шейкере в течение 5 мин. Всасывание TBS в каждой лунке с использованием всасывающего насоса, замените 1 мл TBS и положите обратно на шейкер на 5 минут. Повторите промывку еще раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Повторное использование парафильма путем удаления избыточной жидкости с помощью ткани и промывки поверхности водой. Убедитесь, что парафиновая пленка полностью сухая перед введениемГ для последующего окрашивания.
9. Подготовьте раствор вторичных антител в TBS (разведение 1: 500-1: 2000). Чтобы окрасить ядро ​​и бактерии, добавьте 2 мкг / мл DAPI в смесь. Чтобы окрасить актин, добавьте флуоресцентный фаллоидин. Внесите 50 мкл вторичного антитела на пластиковую парафиновую пленку.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Использование высокоочищенных перекрестно абсорбированных ослиновых вторичных антител рекомендуется для исследований с коалокализацией различных маркеров SG, когда используется G3BP1 (козьи антитела). Выбирайте флуоресцентно меченные вторичные антитела с неперекрывающимися спектрами. EIF3b явно окрашивает цитоплазму клеток и поэтому является хорошим маркером для определения клеток. Пятна актина дополнительно помогают очерчивать клетки в местах контакта клеток с клетками и в областях бактериального входа.
10. Возьмите покровное с помощью пинцета, нанесите край покровного на ткань, коротко отпустите пинцет, чтобы удалить лишнюю жидкость. Осторожно положите покровное лицо на каплю и инкубируйте покровные стеклаВ темноте в течение 1 часа при комнатной температуре.
11. Используйте пинцет, чтобы поместить покровное в 24-луночные планшеты, наполненные свежей 1 мл PBS. Убедитесь, что покровное покрытие полностью покрыто PBS. Промыть клетки 3 раза мягким встряхиванием в течение 5 минут каждый.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Храните пластину во время промывки под крышкой для защиты от света, поскольку флуорофоры вторичного антитела чувствительны к свету.
12. Кратко окуните покровное в деионизированную воду, чтобы удалить соль, нанесите сухую краю на ткань и установите покровное стекло на 5 мкл флюоресцентной монтажной среды на стеклянном слайде. Запечатайте покровное стекло до получения изображений с помощью лака для ногтей. Храните слайды при температуре 4 ° C в течение короткого времени (неделя) или при -20 ° C для хранения в течение длительного времени (месяца).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Избегайте пузырьков воздуха при герметизации, так как это может повредить качеству изображения.

5. Флуоресцентная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ. Для оптимизации настройки обратитесь к руководству пользователя микроскопа.

1. Приобретайте изображения, используя конфокальный микроскоп, используя либо масляный иммерсионный объектив 40 или 63X. Выберите желаемые флуоресцентные каналы для получения изображения. При использовании нескольких флуоресцентных каналов выберите режим последовательного сбора.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Начните с экспериментальных образцов, где SGs были вызваны наиболее сильными, чтобы избежать чрезмерного воздействия на последующие образцы. Удостоверьтесь, что не были переэкспонированы SG на всей глубине ячейки.
   1. Установите размер бит 12 или выше в настройках микроскопа, чтобы обеспечить точность анализа изображения.
   2. Установите стеки изображений, чтобы покрыть всю глубину ячейки. Проверьте различные каналы и различные маркеры SG, чтобы убедиться, что весь диапазон включен. Установите начало стека в основании ячеек и верхнюю часть стеков на высоте в верхней части ячеек, где не наблюдаются более сильные метки.
   3. Приобретите стек. Держите высоту стека одинаковой для всех изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ.Изменить настройки сбора данных между контрольными и экспериментальными образцами, которые будут использоваться для последующего сравнения.

6. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь описывается анализ SG на свернутых пакетах с использованием бесплатного ICY. Анализ изображений 3D-реконструкций также может быть выполнен с использованием другого специализированного программного обеспечения. Обнаружение SG может выполняться посредством полностью автоматизированного рабочего процесса, установленного для этого протокола (см. Http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Чтобы использовать этот протокол, ядра должны быть окрашены пятнами ДНК для программного обеспечения, чтобы найти центр каждой ячейки, и кромки клеток должны быть отмечены либо цитоплазматическим маркером (таким как eIF3b), либо актиновым пятном для программного обеспечения Для идентификации границ ячеек. Автоматический рабочий процесс может использоваться для проверки результатов, полученных вручную, или непосредственно для анализа, когда границы ячейки обнаруживаются с высокой степенью уверенности, что будетЗависит от плотности клеток и маркера, используемого для обнаружения границ клеток.

1. Используя ImageJ или Fiji, сверните стеки изображений (Изображение> Стеки> Проецирование Z) и сохраните как .tiff файлы.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Создайте новую папку для каждого изображения, поскольку программное обеспечение для анализа изображения свяжет свои результаты с сайтом исходного изображения.
2. Загрузите контрольное и экспериментальное изображение .tiff на платформу анализа изображений (File> Open). Войдите в окно Sequence. Прокрутите вниз в «Таблице поиска» до параметров канала.
3. Деактивируйте все каналы, установив флажок для всех вкладок каналов. Нажмите на канал 0, а затем выберите предпочтительный цвет, нажав на панель цветов выше. Увеличьте интенсивность канала по мере необходимости, чтобы увидеть все структуры, щелкнув и двигая линию в поле интенсивности. Повторите это для всех каналов.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Деактивируйте каналы, которые не требуются для заданной задачи, чтобы свести к минимуму смещение в анализе выборки.
4. манускриптИ на вкладке Canvas увеличьте примерно до 10 ячеек на поле, отрегулировав вкладку масштабирования.
5. Используйте инструменты функций многоугольника (в верхней панели), чтобы очертить границы ячеек на изображении. Используйте пятно актина или цитозольный маркер для определения границы ячейки ( например, eIF3b).
   1. Нажмите кнопку «Многоугольник» в инструментах «Файл и ROI». Начните разграничение, щелкнув по ячейке, а затем продолжите линию, сделав якоря через повторный щелчок по границе ячейки. Чтобы завершить ROI, щелкните еще раз на функции многоугольника в инструментах «Файл и ROI».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Определите подгруппы зараженных зараженных клеток. Образец состоит из смеси зараженных и неинфицированных клеток. Для идентификации бактерий используйте окрашивание DAPI или флуоресцентные бактерии (такие как GFP-экспрессирующие бактерии). Увеличьте интенсивность, чтобы убедиться, что все бактерии видны.
   2. Чтобы назвать ROI, перейдите в окно ROI справа и cliCk в интересующей ячейке изображения. Это отобразит соответствующий ROI на вкладке ROI. Дважды щелкните по имени ROI и измените имя ( например, зараженную ячейку # 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если одно изображение используется для анализа как зараженных, так и неинфицированных ячеек, проще сохранить изображение в двух отдельных папках и разделить зараженные и неинфицированные ячейки отдельно, создавая две разные электронные таблицы, что облегчит анализ позже.
6. Откройте приложение детектора пятна на вкладке «Обнаружение и отслеживание» (верхняя панель). На вкладке «Ввод» будет выбрано текущее изображение. Ничего не меняйте. На вкладке «Предварительная обработка» выберите канал для анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ. В любой момент времени можно анализировать только один канал. Пакетный анализ можно выбрать здесь, если вы используете полностью автоматизированную последовательность анализа, параметры которой были проверены, чтобы дать удовлетворительные результаты.
   1. На вкладке «Детектор» выберите «DeTect яркие пятна на темном фоне ", затем выберите подходящую шкалу и чувствительность. Сделайте это, проверив различные настройки и перекрестное обнаружение пятна как в контрольном, так и в экспериментальном образцах.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Для изображения с разрешением 2048 x 2,048 и размером пикселя 0,12 мкм ² порог уровня 2 с чувствительностью 25-100, как правило, подходит, но каждый маркер SG должен испытываться эмпирически. Настройте обнаружение пятна так, чтобы в необработанном контрольном образце пятна не были обнаружены, а в экспериментальной выборке с SGs учитывались все малые и большие SG.
   2. На вкладке ROI выберите предлагаемый ROI из последовательности. На вкладке «Фильтрация» выберите «Нет фильтрации». На вкладке «Вывод» выберите соответствующий выход.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Выбор параметра Включить конкретный файл полезен для сохранения различных условий обнаружения или разных каналов. Выбор для экспорта двоичного изображения и исходного изображения с ROI и обнаружение - это helДля анализа контроля качества.
   3. Выберите «Удалить предыдущие точки, отображаемые как ROI». Выберите папку для сохранения файла, нажав кнопку «no file selected». На вкладке «Экран» выберите нужные параметры. Нажмите «Начать обнаружение».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Будет создана папка с именем и выбранным местоположением, которая содержит экспортированные параметры обработки изображений. Эти изображения будут перезаписаны для каждого тестируемого нового состояния. Чтобы сохранить изображения, переименуйте папку, чтобы создать новую папку или перенести изображения из папки сохранения в новую папку. Для контроля качества изображений полезно выбрать метку обнаружения дисплея, номер обнаружения ROI и номер ROI и имя.
7. Консолидируйте и сохраните данные для разных параметров, используя созданную электронную таблицу для каждого тестируемого изображения или условия.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Параметры для анализа включают количество SG на ROI, площади поверхности SG и максимум SGImum, средняя и минимальная интенсивности.
8. Перенесите данные и проанализируйте с помощью программы анализа, способной анализировать, отображать и определять статистическую значимость.

Результаты

Чтобы объяснить и продемонстрировать протокол, описанный в этой рукописи, мы охарактеризовали изображение индуцированных клотримазолом SGs в клетках HeLa, инфицированных или не имеющих цитозольного патогена S. flexneri . Схема схемы представлена ​​на рисун...

Обсуждение

Описанный здесь протокол описывает индукцию, локализацию и анализ СГ в неинфицированных клетках и клетках, инфицированных цитозольным патогеном S. flexneri, в присутствии или отсутствии экзогенного стресса. Используя бесплатное программное обеспечение для обработки изображений, пр?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primary Antibodies
eIF3b (N20), origin goat	Santa Cruz	sc-16377	Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300
eIF3b (A20), origin goat	Santa Cruz	sc-16378	Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300
eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal)	Cell Signaling	3411	Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800
eIF4AI, origin goat	Santa Cruz	sc-14211	Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200
eIF4B, origin rabbit	Abcam	ab186856	Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300
eIF4B, origin rabbit	Cell Signaling	3592	Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100
eIF4G, origin rabbit	Santa Cruz	sc-11373	Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300
G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal)	BD Biosciences	611126	Widely used SG marker. Dilution 1:300
Tia-1, origin goat	Santa Cruz	sc-1751	Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300
Alexa-conjugated Secondary Antibodies
A488 anti-goat , origin donkey	Thermo Fisher	A-11055	Cross absorbed. Dilution 1:500
A568 anti-goat, origin donkey	Thermo Fisher	A-11057	Cross absorbed. Dilution 1:500
A488 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A-21202	Dilution 1:500
A568 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A10037	Dilution 1:500
A647 anti-mouse, origin donkey	Thermo Fisher	A31571	Dilution 1:500
A488 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A-21206	Dilution 1:500
A568 anti-rabbit, origin donkey	Thermo Fisher	A10042	Dilution 1:500
Other Reagents
Shigella flexneri			Available from various laboratories by request
Tryptone Casein Soya (TCS) broth	BD Biosciences	211825	Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth
TCS agar	BD Biosciences	236950	Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth
Congo red	SERVA Electrophoresis GmbH	27215.01	Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth
Poly-L-Lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	P1274	Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G1397	Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection
HEPES	Life Technologies	15630-056	PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	31885	Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture
Fetal Calf Serum (FCS)	Biowest	S1810-100	5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Life Technologies	11140	1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650	Reagent diluent, application - cell culture
Sodium arsenite	Sigma-Aldrich	S7400	Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer
Clotrimazole	Sigma-Aldrich	C6019	Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer
Paraformaldehyde (PFA	Electron Microscopy Scences	15714	4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization
A647-phalloidin	Thermo Fisher	A22287	Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining
Parafilm	Sigma-Aldrich	BR701501	Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining
Prolong Gold	Thermo Fisher	36930	Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
24-well cell culture plate	Sigma-Aldrich	CLS3527	Standard tissue culture plates, application - cell culture
12 mm  glass coverslips	NeuVitro	1001/12	Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support
forceps	Sigma-Aldrich	81381	Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting
Programs and Equipment
Prism	GraphPad Software		Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis
Leica SP5	Leica Microsystems		Confocal microsope, application - image acquisition
Imaris	Bitplane		Professional image analysis program, application - data analysis
Excel	Microsoft		Data analysis and graphing program, application - data analysis