АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает разделение функциональных комплексов транспортной цепи митохондриальных электронов (Cx) IV и их суперкомплексов с использованием нативного электрофореза для раскрытия информации об их сборке и структуре. Нативный гель можно подвергать иммуноблоттингу, в-гель-анализе и очищать путем электроэлюции для дальнейшего характеристики отдельных комплексов.

Аннотация

Транспортная цепь митохондриального электрона (ETC) трансдуцирует энергию, полученную в результате пробоя различных видов топлива в биоэнергетическую валюту клетки, АТФ. ETC состоит из 5 массивных белковых комплексов, которые также собираются в суперкомплексы, называемые респирасомами (CI, C-III и C-IV) и synthasomes (CV), которые повышают эффективность транспорта электронов и производства ATP. В течение более 50 лет для измерения функции ETC использовались различные методы, но эти протоколы не содержат информации о сборке отдельных комплексов и суперкомплексов. В этом протоколе описывается методика электрофореза на основе полиакриламидного геля на месте (PAGE), метод, который был модифицирован более 20 лет назад для изучения структуры комплекса ETC. Нативный электрофорез позволяет разделять комплексы ETC на их активные формы, и эти комплексы затем могут быть изучены с использованием иммуноблоттинга, в-гель-анализах (IGA) и очистки путем электроэлюции. Объединив reSAGE с исходным гелем PAGE с результатами других митохондриальных анализов, можно получить полную картину активности ETC, ее динамическую сборку и разборку и как это регулирует структуру и функцию митохондрий. В этой работе также будут обсуждаться ограничения этих методов. Таким образом, техника нативного PAGE с последующим иммуноблоттингом, IGA и электролечением, представленная ниже, является мощным способом исследования функциональности и состава суперкомплексов митохондриальных ETC.

Введение

Митохондриальная энергия в виде АТФ не только необходима для выживания клеток, но и для регуляции клеточной смерти. Генерация АТФ путем окислительного фосфорилирования требует функциональной транспортной цепи электрона (ETC, Cx-I-IV) и митохондриальной АТФ-синтазы (Cx-V). Недавние исследования показали, что эти крупные белковые комплексы организованы в суперкомплексы, называемые респирасомами и синтасомами 1 , 2 . Трудно проанализировать сборку, динамику и регулирование активности этих массивных комплексов и суперкомплексов. В то время как измерения потребления кислорода, проведенные с помощью кислородного электрода и анализа ферментов, проводимые с использованием спектрофотометра, могут дать ценную информацию о активности комплекса ETC, эти анализы не могут предоставить информацию о составе присутствия, размера и субъединицы белкового комплекса или суперкомплексов. Тем не менее, развитие синего и чистого родного (BN и CN соответственно). СТРАНИЦА 3 создала мощный инструмент для выявления важной информации о сложном составе и сборе / разборке и о динамической регуляции супрамолекулярной организации этих жизненно важных респираторных комплексов в физиологических и патологических условиях.

Сборка этих комплексов в суперкомплексах высшего порядка, по-видимому, регулирует структуру и функцию митохондрий 5 . Например, респираторная сборка повышает эффективность переноса электрона и генерирование движущей силы протона через внутреннюю мембрану митохондрии 5 . Кроме того, сборка синтазомов не только повышает эффективность производства АТФ и перенос энергетических эквивалентов в цитоплазму 2 , но также формирует митохондриальную внутреннюю мембрану в трубчатые кристы 6 , </ Sup> 7 . Исследования суперкомплексной сборки во время развития сердца у эмбрионов мыши показывают, что генерация суперкомплексов Cx-I в сердце начинается примерно с эмбрионального дня 13,5 8 . Другие показали, что количество суперкомплексов, содержащих Cx-I, уменьшается в сердце из-за старения или повреждений от ишемии / реперфузии 9 , 10 или может играть роль в прогрессировании нейродегенеративных заболеваний 11 .

В этом протоколе описаны методы для основного гелевого PAGE, которые могут быть использованы для исследования сборки и активности комплексов ETC и суперкомплексов. Примерную молекулярную массу митохондриальных суперкомплексов можно оценить путем разделения белковых комплексов на полиакриламидные гели CN или BN. CN PAGE также позволяет визуализировать ферментативную активность всех митохондриальных комплексов непосредственно в геле (in-gel assays;ИГА) 12 . Эта работа демонстрирует активность респирасом, выделяя способность Cx-I окислять NADH через IGA и присутствие синтазомов из-за активности АТФ-гидролиза Cx-V с помощью IGA. Множественные комплексы и суперкомплексы, содержащие Cx-I и Cx-V, можно также продемонстрировать путем переноса белков на нитроцеллюлозные мембраны и проведения иммуноблоттинга. Преимущество этого подхода состоит в том, что BN или CN PAGE обычно разделяют белковые комплексы на основе их физиологических размеров и состава; Перенос на мембрану сохраняет эту картину полос. Анализ белковых комплексов в BN или CN PAGE также может быть осуществлен с использованием 2D-PAGE (см. Fiala и др. 13 для демонстрации) или центрифугированием плотности сахарозы 14 , 15 . Для дальнейшего анализа конкретной полосы ее можно вырезать из BN PAGE, и белки из этого белкового комплекса могут быть очищеныD путем электроэлюции их в естественных условиях. Наземная электроэлюция может быть выполнена в течение нескольких часов, что может существенно повлиять на пассивную диффузию (как используется в ссылке 16) белков из геля в окружающий буфер.

Таким образом, эти методы описывают несколько подходов, которые позволяют дополнительно характеризовать высокомолекулярные суперкомплексы из митохондриальных мембран.

протокол

Все эксперименты проводили с использованием сердец у мышей C57BL / 6N (дикий тип). Мышей анестезировали СО 2 до дислокации шейки матки, и все процедуры выполнялись в строгом соответствии с Отделом лабораторной медицины животных в Рочестерском университете и в соответствии с государственным законодательством, федеральным законом и политикой НИЗ. Протокол был одобрен Институтом по уходу за животными и его использованием в Университете Рочестера (Университетский комитет по животным ресурсам).

1. CN и BN PAGE

ПРИМЕЧАНИЕ. Все оборудование, используемое для BN и CN PAGE, должно быть свободным от моющего средства. Для этого промойте все оборудование 0,1 М соляной кислотой, а затем тщательно промыть деионизированным H 2 O.

  1. подготовка
    1. Подготовьте анодный буфер, состоящий из 25 мМ имидазола, pH 7,0, при 4 ° С; Хранить при температуре 4 ° C.
    2. Подготовьте катодный буфер для CN или BN PAGE.
      1. Для CN PAGE используйте 7,5 мМ имидазола и 50 мМ трицина; Добавляют 0,5 г дезоксихолата натрия и 0,2 г лаурилмалтозида на литр буфера. Отрегулируйте pH до 7,0 при 4 ° C и храните при температуре 4 ° C.
      2. Для BN PAGE используйте 7,5 мМ имидазола и 50 мМ трицина и отрегулируйте рН до 7,0 при 4 ° С. Хранить при температуре 4 ° C.
      3. Для светло-голубого BN-катодного буфера используют 7,5 мМ имидазола и 50 мМ трицина. Отрегулируйте pH до 7,0 при 4 ° C и добавьте 20 мг кумасси на литр буфера. Хранить при температуре 4 ° C.
    3. Подготовьте буфер для экстракции (ЕВ) 50 мМ NaCl, 50 мМ имидазола, 2 мМ аминокапроновой кислоты и 1 мМ ЭДТК. Отрегулируйте pH до 7,0 при 4 ° C и храните при температуре 4 ° C.
    4. Подготовьте 3х гель-буфер (используется для гелей BN и CN) с 75 мМ имидазолом и 1,5 М аминокапроновой кислотой. Отрегулируйте pH до 7,0 при 4 ° C и храните при температуре 4 ° C.
    5. Подготовьте загрузочный буфер (LB) 0,01 г Ponceau S, 5 г глицерина и 5 мл H 2 O. Хранить в помещениитемпература.
    6. Подготовьте кумасси синим, добавив 50 мг кумасси к 1 мл 500 мМ 6-аминогексановой кислоты. Отрегулируйте pH до 7,0 при 4 ° C и храните при температуре 4 ° C.
    7. Подготовьте 20 мМ и 200 мМ лаурилмалтозида в H 2 O. Сделайте аликвоты по 200 мкл и заморозьте их. Перед использованием оттереть моющее средство.
От 3% до 8% (мини) От 4% до 10% (максимум)
0,5 геля (светлый) 0,5 геля (тяжелые) 0,5 геля (светлый) 0,5 геля (тяжелые)
AAB (мл) 0,42 1,3 2.5 7,7
Буфер CN / BN (мл) 1,6 1,6 8,5 8,5
H 2 O (мл) 2,7 1.4 14 6,3
Глицерин (г) 0 0,47 0 2.5
Объем (мл) 4,72 4,77 25 25
APS (мкл) 27 27 65 65
TEMED (мкл) 4 4 10 10

Таблица 1: Количество ингредиентов, необходимых для заливки 1 Mini- или Maxi-PAGE. Объемы, используемые в этой таблице, рассчитаны для 1 мини- или 1 макси-гель толщиной 1,5 мм. Объем AAB основан на 40% -ном исходном растворе. Легкие и тяжелые относятся к концентратуИон AAB. APS и TEMED добавляются после того, как каждая колонка градиентного смесителя заполнена раствором AAB.

  1. Заливка и запуск гелей
    ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте градиент 3-8% или 4-10% акриламида / бисакриламида (AAB) для гелей CN или BN соответственно. В таблице 1 приведены количества буфера, AAB, H 2 O, глицерина, аммонийперсульфата (APS) и тетраметилэтилендиамина (TEMED), используемого для мини-геля (толщиной 85 мм x 73 мм с высотой х 1,5 мм) или макси-геля (160 Мм в ширину х 200 мм с высотой х 1,5 мм). Сборка стеклянных пластин с гелями CN или BN может быть охлаждена в мешке с помощью нескольких мл 1x буфера для геля или завернута в бумажное полотенце, смоченное 1x буфером для хранения геля. Гели стабильны для использования в течение недели.
    1. Чтобы вылить гель, поместите градиентный смеситель на повышенную перемешивающую пластину, чтобы гарантировать, что гель будет течь под действием силы тяжести в подготовленную камеру геля.
    2. Заполните выпускную камеру градиентного мешалки 4,77 / 25 мл (Mini / maxi) тяжелого раствора (с более высокой концентрацией AAB).
    3. Аккуратно откройте соединение стопорного крана между тяжелой и легкой камерой и позвольте капле раствора перейти на другую сторону.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это выталкивает пузырьки воздуха из соединительной трубки и стопорного крана, что предотвратит поток между двумя камерами. Это невозможно сделать, если обе стороны уже заполнены, потому что равное давление предотвратит движение пузыря.
    4. Заполните другую камеру градиентного миксера 4,72 / 25 мл (мини / макси) светового раствора.
    5. Поместите мешалку в выпускную камеру с помощью тяжелого раствора и начните перемешивание. Используйте скорость мешалки, которая не вызывает пузыри.
    6. Быстро добавьте APS и TEMED в каждую камеру, чтобы начать полимеризацию.
    7. Откройте соединение между двумя камерами градиентного смесителя и дайте им перемешать в течение нескольких секунд, прежде чем открывать выпускную камеру для заливки геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Гравитация wiСлив обе камеры одинаково, и смешение света в тяжелом растворе будет медленно уменьшать плотность акриламида снизу до верхней части геля. Используйте весь контент, который находится в градиентном смесителе, чтобы вылить гель.
      1. В конце осторожно установите гребенку с лунками внутри геля, чтобы избежать пузырей и смешивания слоев.
    8. Немедленно промойте градиентный смеситель с этанолом, чтобы ополоснуть любой гель. Промойте водой и вылейте второй гель. Пусть гели полимеризуются (обычно менее 20 минут необходимы для мини-гелей).
    9. Чтобы запустить гели, установите их в зажим для электродов и заполните центральную / верхнюю камеру CN или голубым BN-катодным буфером. Подождите несколько минут, чтобы проверить утечки перед добавлением анодного буфера во внешнюю / нижнюю камеру.
      1. Аккуратно вытащите лунки и вымойте лунки с помощью катодного буфера, используя шприц или пипетку.
      2. Запустите гели в холодной комнате (4 ° C) или полностью упакованы во льду.
        1. Для CN-PAGE CN используйте 100 В в течение первого часа и 200 В до окончания, обычно дополнительно 1-1,5 ч. Кроме того, запустите мини-PAGE CN на 30-40 V за одну ночь.
          ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь основное внимание уделяется высокомолекулярным белковым комплексам, поэтому белковые комплексы с молекулярной массой менее 140 кДа выйдут из геля. Для сохранения низкомолекулярных комплексов можно использовать более короткие времена работы для электрофореза.
        2. Для BN maxi-PAGE используйте 100 В и запустите гели в течение ночи (около 18 часов).
          ПРИМЕЧАНИЕ. Ток будет очень низким (<15 мА), поэтому необходим источник питания, который может обрабатывать эти условия. На этом этапе гели могут использоваться для IGA или иммуноблоттинга. В некоторых случаях полосы или дорожки могут быть вырезаны из гелей, используя лезвие бритвы на стеклянной пластине для электроэлюции.
  2. Базовые приготовления
    ПРИМЕЧАНИЕ. Мемотранзиальные суперкомплексы, связанные с мембранами, должны быть извлечены изВнутренняя митохондриальная мембрана. Чтобы сохранить суперкомплексы митохондрий, используйте либо свежеизолированные митохондрии, либо образцы, которые были заморожены и разморожены только один раз. Ниже приведены расчеты / объемы для мини-гелей (лунка 10-луночного гребня в геле толщиной 1,5 мм вмещает до 35-40 мкл) и макси-гелей (колодец 15-луночного гребня вмещает до 200 мкл). Кроме того, сохраните аликвоту каждого образца (обычно 10 мкл) для запуска на денатурирующем геле SDS для обнаружения зависящего от напряжения анионного канала (VDAC) в качестве контроля загрузки.
    1. Поместите соответствующее количество ( например, 10-50 мкг белка для мини-гелей и 50-200 мкг для макси-гелей) изолированных митохондрий или гомогенатов ткани в микропробирки и центрифугируйте при 17000 × g в течение 10-15 минут при 4 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе удаляются некоторые растворимые митохондриальные матрицы и / или цитозольные белки.
    2. Аспирируйте и отбросьте супернатант и добавьте буфер экстракции в желаемое количествоДля загрузки на гель. Аккуратно ресуспендируйте осадок на льду. При желании добавьте в этот момент общую смесь ингибиторов протеазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Основываясь на используемом здесь оборудовании, 30 мкл использовали для мини-геля и 100 мкл для макси-геля, ограничивая отношение белка / буфера до не более 2 мкг белка до 1 мкл буфера.
    3. Добавьте моющее средство ( например, 2 мкг лаурилмалтозида / 1 мкг белка, см. Представительские результаты и обсуждение для получения дополнительной информации).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Обычно используют лаурилмалтозид, но также может использоваться дигитонин.
    4. Инкубируйте на льду в течение 20 мин. Аккуратно перемешайте в начале и иногда во время инкубации путем растирания и / или взбалтывания трубки.
    5. Центрифуга при 17000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С для удаления любых фрагментов мембраны и ткани.
    6. Перенесите супернатант в новую пробирку. Для образцов CN добавьте 1 мкл LB на каждые 10 мкл объема образца; Общий объем выборки должен быть приложениемПримерно 40 мкл для мини-геля и 130 мкл для макси-геля. Для образцов BN добавьте Coomassie к образцам, чтобы отношение красителя к моющему средству составляло 1: 4 (мас. / Мас.).
    7. Загрузите 30 и 120 мкл образцов в лунки мини- или макси-гел соответственно. Используйте оставшиеся 10 мкл из каждого образца для денатурирующего геля SDS для определения VDAC в качестве контроля загрузки.
    8. Для получения маркеров молекулярной массы растворите 1 флакон с высокомолекулярной калибровочной смесью (см. Таблицу материалов для получения дополнительной информации) в 60 мкл буфера BN / CN и добавьте 120 мкл H 2 O и 20 мкл ФУНТ. Загрузите 15 мкл на дорожку.
    9. Запустите гели, как описано в шаге 1.2.9.2.

2. В-гель-анализы для Cx-I и Cx-V

ПРИМЕЧАНИЕ. Анализы проводят при комнатной температуре. Снимайте фотографии, сканирование или изображения разрабатывающих полос для документации. (Важно) Белки не могут быть переданы ontO нитроцеллюлозные мембраны после завершения IGA.

  1. Анализ Cx-I
    1. Подготовка.
      1. Подготовьте буфер для анализа 5 мМ Трис в H 2 O с рН 7,4; Хранить при комнатной температуре.
      2. Растворяют 10 мг NADH в 1 мл буфера для анализа. Хранить в аликвотах по 100 мкл при -20 ° C до использования; Избегайте замораживания и оттаивания.
      3. Взвесьте 25 мг нитроцеллюлозного тетразолия в микротрубочку.
      4. Подготовьте фиксатор, разбавив 5 мл уксусной кислоты в 95 мл H 2 O; Хранить при комнатной температуре.
    2. Выполнение анализа.
      1. Объединить 10 мл аналитического буфера с 25 мг нитроцеллюлозного тетразолия (конечная концентрация: 2,5 мг / мл) и 100 мкл 10 мг / мл NADH (0,1 мг / мл). Добавьте это на весь гель, полосу или область интереса, вырезаемую из геля CN.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Это можно сделать в прозрачном пластиковом или стеклянном контейнере. Обратите внимание, что этот анализ не может быть выполнен после BN PAGE.
      2. Следуйте за развитием синих полос после нежного возбуждения (рокера) в течение> 3 мин.
      3. Исправить гель в 10 - 20 мл раствора уксусной кислоты или промыть в 5 мМ Трис, pH 7,4, чтобы остановить реакцию. Сделайте фотографии для документации (см. Таблицу материалов).
  2. Анализ Cx-V
    ПРИМЕЧАНИЕ. Анализ Cx-V должен проводиться с использованием повторяющихся гелей CN или BN, где один инкубируется с 5 мкг / мл олигомицина (ингибитор Cx-V), чтобы продемонстрировать Cx-V-независимую активность.
    1. Подготовка.
      1. Подготовьте буфер для анализа с 35 мМ Трис и 270 мМ глицина; Отрегулируйте pH до 8,3 при комнатной температуре. Хранить буфер, замороженный в аликвотах по 50 мл, но проверить рН после замораживания и оттаивания.
      2. Подготовьте 1 M MgSO 4 в H 2 O; Хранить при 4 ° C до использования.
      3. Взвесьте 27,28 мг Pb (NO 3 ) 2 в микротрубу.
      4. Взвесьте 60 мг АТФ в микротрубу.
      5. Растворить 1 мг оЛигомицина в 1 мл этанола. Хранить при температуре -20 ° C до использования.
      6. Подготовьте фиксатор путем смешивания 50 мл метанола с 50 мл H 2 O; Хранить при комнатной температуре.
    2. Выполнение анализа.
      1. Инкубируйте гель, полосу или область, представляющую интерес, из BN или CN-геля в течение 2 ч при осторожном перемешивании (качалке) в 10-20 мл буфера для анализа ± 5 мкг / мл олигомицина (50-100 мкл 1 мг / Мл в этаноле) при комнатной температуре.
      2. После инкубации замените буфер на 14 мл свежего буфера для анализа и добавьте по порядку 190 мкл 1 М MgSO 4 (14 мМ), 27,28 мг Pb (NO 3 ) 2 (5 мМ), 60 мг АТФ ( 8 мМ) и 75 мкл олигомицина (при необходимости).
      3. Инкубируйте с осторожным перемешиванием (рокер) и наблюдайте за белым осадком, так как полосы на обработанных олигомицином гелях будут давать не-Cx-V-зависимые полосы.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Внешний вид осадка может занять несколько часов.
      4. Закрепите гель в метаноле-( Например, 50% метанола), потому что кислые растворы растворяют осадок свинца. Фотографируйте результаты.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Осадок свинца не мешает окрашиванию Кумасси гелей.

3. Передача белка в мембраны из нитроцеллюлозы или поливинилидендифторида (PVDF)

  1. Подготовьте буфер переноса 25 мМ Трис и 200 мМ глицина. Отрегулируйте pH до 8,3 и добавьте 0,0005 г / л SDS и 200 мл / л метанола. Хранить при комнатной температуре.
    1. Отрежьте нитроцеллюлозу или PVDF-мембрану (размер пор: 0,45 мкм) с лезвием для бритвы или ножницами до размера, немного большего, чем размер геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Нитроцеллюлозные мембраны позволяют окрашивать Ponceau S для оценки загрузки белка, тогда как мембраны PVDF дают более четко определенные полосы.
  2. Протокол.
    1. Замачивайте нитроцеллюлозную мембрану, фильтровальную бумагу и губки дляНе менее 10 мин в переносном буфере. Поместите мембрану PVDF в 100% метанол в течение 15 с или в соответствии с рекомендацией производителя перед тем, как поместить его в буфер переноса. Поместите открытую кассету комплекта для переноса в плоскую миску с переносным буфером.
    2. Поместите губку и 1-2 слоя фильтровальной бумаги на задней стороне кассеты. Удалите пузырьки.
    3. Поместите гель на фильтровальную бумагу. Укажите ориентацию геля, обрезая угол геля и / или мембрану.
    4. Поместите мембрану поверх геля. Удалите все пузырьки.
    5. Поместите фильтровальную бумагу и губку поверх мембраны. Удалите все пузырьки в этом бутерброд.
    6. Закройте кассету и поместите ее в держатель кассеты комплекта переноса.
    7. Перенесите белки при 25 В в течение примерно 12-18 ч.

4. Иммуноблоттинг

  1. Подготовка.
    1. Приготовить Ponceau Stain (500 мл), добавив 25 млУксусной кислоты и 0,5 г Ponceau S до 475 мл H 2 O; Хранить при комнатной температуре (можно использовать повторно).
    2. Подготовьте трис-буферный солевой раствор (TBS) 200 мМ NaCl, 25 мМ трис-основания и 2,7 мМ KCl. Отрегулируйте pH до 8,0 и сохраните при комнатной температуре.
    3. Подготовьте TBS-tween (TBST), добавив 0,5 мл / л Tween 20 в TBS; Хранить при комнатной температуре.
    4. Подготовьте твердые вещества молока / TBST, растворяя 5 г сухого молока в 100 мл TBST. Хранить при температуре 4 ° C и использовать в течение 3 дней.
    5. Подготовьте BSA / TBST путем растворения 3 г бычьего сывороточного альбумина (BSA, фракция V) в 100 мл TBST. Хранить при температуре 4 ° C и использовать в течение 3 дней.
  2. Протокол.
    1. Когда передача завершена, поместите мембрану в раствор Ponceau S, чтобы визуализировать все перенесенные белки. Обозначьте положение маркеров на мембране карандашом и запишите пленку Ponceau-S путем фотографии или сканирования.
    2. Промойте мембрану 3 раза в течение 10 мин. Каждый wiTh TBS при осторожном перемешивании.
    3. Заблокируйте мембрану твердыми веществами молока / TBST в течение 1-2 часов при комнатной температуре или на ночь в холодной комнате с легким перемешиванием.
    4. Промойте мембрану в течение 10 минут с помощью TBST при осторожном перемешивании.
    5. Инкубируйте с первичным антителом в течение ночи в холодной комнате при осторожном перемешивании. Разбавьте антитело ( например, 1: 1000 для анти-ATP5A и -NDUFB6) в BSA / TBST.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Большинство антител дают лучший сигнал на мембранах из нативных гелей при инкубации в течение ночи.
    6. Промойте мембрану в течение 10 минут с помощью TBST при осторожном перемешивании.
    7. Инкубируйте со вторичным антителом в течение по меньшей мере 60 мин при комнатной температуре, не менее мягкое перемешивание. Разбавьте антитело (от 1: 5000 до 1: 50000) в сухих веществах молока / TBST.
    8. Промойте мембрану 3 раза в течение 10 мин при комнатной температуре, при этом TBEST осторожно перемешайте.
    9. Во время последней промывки подготовьте усиленный хемолюминесцентный (ECL) субстрат в соответствии с инструкциями manufacturer.
    10. Инкубируйте мембрану с субстратом ECL, используя инструкции, предоставленные производителем.
    11. Обнаружение сигнала на пленке с помощью инструкций производителя субстрата ECL.

5. Электроизлучение

  1. Подготовка.
    1. Подготовьте буфер для элюции 25 мМ трицина, 3,75 мМ имидазола (рН 7,0 при 4 ° С) и 5 ​​мМ 6-аминогексановой кислоты.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Всегда надевайте перчатки во время работы с электроэлементом и мембранными колпачками, чтобы предотвратить загрязнение внешних белков.
  2. В день перед использованием электроэлемента для естественного электрооборудования выполните следующие действия:
    1. Замачивайте мембранные колпачки (срезание: 3,5 кДа) в буфере для элюирования в течение 1 часа при 60 ° C. Перенесите колпачки в свежий буфер элюирования и промойте их в течение 12 часов или дольше в холодильнике.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Отключающая молекулярная масса 3,5 кДа предотвращает потерю небольшого pКоторые могут легко диссоциировать из интересующего белкового комплекса.
    2. Промойте электроэлементный модуль, стеклянные трубки, бак и крышку тщательно этанолом. Промойте водой и дайте оборудованию высохнуть.
  3. В день естественного электроэлюции сделайте следующее.
    1. Поместите фритту в нижнюю часть (матовое) каждой стеклянной трубки, которая будет использоваться. При необходимости поместите стеклянную трубку в бункер элюирования и нажмите фритту изнутри на дно трубки.
    2. Вставьте стеклянную трубку с помощью фритты в модуль электроэлемента. Смочите втулку буфером для элюирования и вставьте стеклянную трубку на место. Убедитесь, что верхние части стеклянных трубок ровны с втулкой.
    3. Закройте пустые втулки пробками.
    4. Поместите мокрый мембранный колпачок в нижней части силиконового адаптера и заполните адаптер элюирующим буфером. Медленно пипетируйте буфер в адаптере вверх и вниз, чтобы удалить пузырьки воздуха вокруг диализной мембраны.
    5. Сдвиньте заполненный буфером адаптер к нижней части стеклянной трубки. Удалите все пузырьки, которые появляются на фритте внутри стеклянной трубки.
    6. Заполните каждую стеклянную трубку буфером для элюирования.
    7. Поместите вырезанные полосы BN PAGE в стеклянные трубки (см. Шаг 1.2.9.3). Вырезать большие кусочки на мелкие кусочки. Убедитесь, что высота заполнения в стеклянной трубке составляет около 1 см.
    8. Поместите весь модуль в резервуар.
    9. Добавьте около 600 мл холодного элюирующего буфера в резервуар. Убедитесь, что колпачки переходника из кремния находятся в буфере для предотвращения образования пузырьков на мембране диализа.
    10. Поместите мешалку в нижней части бака.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Перемешивание предотвращает прилипание пузырьков к нижней части диализной мембраны.
    11. Элюируйте белки в течение 4 ч при 350 В в холодной комнате.
    12. После завершения элюирования удалите электроэлементный модуль из буферной емкости и поместите его в раковину или миску.
    13. Если использовали пробку, удалите ееВ верхней буферной камере. В противном случае используйте большую пипетку для удаления буфера.
    14. Удалите буфер из каждой стеклянной трубки и выбросьте. Убедитесь, что силиконовый адаптер остается на месте и что жидкость ниже фритты не потревожена или не встряхивается.
    15. Осторожно удалите силиконовый адаптер вместе с мембранным колпачком со дна стеклянной трубки. Внесите содержимое (около 400 мкл) силиконовой крышки в микротрубочку. С еще 200 мкл буфера для элюирования промойте кремниевый колпачок и добавьте в микротрубу. Повторите все стеклянные трубки.
    16. Поскольку мембранные колпачки можно повторно использовать, сохраните мембранные колпачки, помещая их в буфер элюирования, содержащий 0,5 мг / мл азида натрия. Охладите их.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Элюат имеет низкую концентрацию белка и может быть сконцентрирован с использованием центробежных фильтрующих устройств.

Результаты

Для визуализации суперкомплексов митохондрий использовались свежеизолированные митохондрии у мышей 17 , 18 . Митохондриальные суперкомплексы чувствительны к повторяющимся циклам замораживания и оттаивания, что приводит к их распаду, х...

Обсуждение

Функциональный ETC необходим для генерации митохондриального АТФ. Комплексы ETC способны образовывать два типа суперкомплексов: респирасомы (Cx-I, -III и -IV) 1 и синтазомы (Cx-V) 2 . Сборка каждого комплекса необходима для неповрежденного ETC, в то время как считается, что ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от Аффилированного основателя Американской ассоциации сердца [12GRNT12060233] и Сильного детского исследовательского центра в Рочестерском университете.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Protean II mini-gel chamberBiorad1658004Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gelBiorad1653189Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15VWR95044-704Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gelVWRGM-100Pouring maxi-gel gradients
Transfer kitBiorad1703930Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422Biorad1652976Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass platesBiorad1653308Short plates
Glass platesBiorad1653312Spacer plates
Glass platesBiorad1651823Inner plates
Glass platesBiorad1651824Outer Plates
Power supplyBiorad1645070Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western Thermo Scientific32209Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography filmGE Health care28906845Documentation of Western blots
Film processor CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 CanonNATaking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood Canonshielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamideBiorad161014840% pre-mixed solution
GlycineSigmaG7403
SDS (sodium dodecyl sulfate)Invitrogen15525-017
Tris-baseSigmaT1503Buffer
TricineSigmaT0377
Sodium deoxychelateSigmaD66750Detergent
EDTASigmaE5134
SucroseSigmaS9378
MOPSSigmaM1254Buffer
ImidazoleSigmaI15513Buffer
Lauryl maltosideSigmaD4641Detergent
Coomassie G250Biorad161-0406
Aminohexanoic acidSigmaO7260
Native  molecular weight kitGE Health care 17-0445-01High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
NameCompanyCatalog NumberComments
NADHSigmaN4505
Nitroblue tetrazoliumSigmaN6639
Tris HCLSigmaT3253
ATP  SigmaA2383
NameCompanyCatalog NumberComments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2):Sigma228621
OligomycinSigmaO4876
NameCompanyCatalog NumberComments
Ponceau SSigmaP3504
anti-ATP5AAbcamab14748antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6Abcamab110244antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDACCalbiochem529534antibody to VDAC
ECL HRP linked antibodyGE Health CareNA931Vsecondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagentBiorad170-6404
BSA
sodium chlorideSigmaS9888
potassium chlorideSigmaP9541
EGTASigmaE3889
NameCompanyCatalog NumberComments
Silver staining KitInvitrogenLC6070

Ссылки

  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены