JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает перепрограммирования первичных амниотической жидкости и мембраны мезенхимальных стволовых клеток в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием-интеграция episomal подход в полной мере химически определенных условий. Описаны процедуры извлечения, культуры, перепрограммирования и характеристика результате индуцированных плюрипотентных стволовых клеток жесткими методами.

Аннотация

Аутологичные клетки терапии получил на шаг ближе к реальности с введением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Фетальных стволовых клеток, например, амниотической жидкости и мембраны мезенхимальных стволовых клеток, представляют собой уникальный тип недифференцированных клеток с обещанием в тканевой инженерии и для перепрограммирования в iPSC для будущих мероприятий педиатрических и банковских стволовых клеток. Протокола, представленные здесь описывает оптимизированная процедура для извлечения и культивирования первичных амниотической жидкости и мембраны мезенхимальных стволовых клеток и генерации episomal индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из этих клеток в полностью химически определенной культуры условия использования человеческого рекомбинантного vitronectin и среднего E8. Характеристика новых линий, применяя строгие методы – проточной цитометрии, конфокальная томография, тератома формирования и транскрипционный анализ профиля – также описал. Вновь созданный линии Экспресс маркеры эмбриональных стволовых клеток – Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – при отрицательной для маркера SSEA-1. Линий стволовых клеток образуют тератомы ТКИД бежевый мышей в 6-8 недель и тератомы содержат представителя всех трех зародышевых тканей. Транскрипционный анализ профиля линий, представив глобальное выражение microarray данных алгоритм оценки плюрипотентности bioinformatic считаются все линии плюрипотентных и таким образом, этот подход является привлекательной альтернативой для животных тестирования. Новые линии iPSC легко может использоваться в нижнем течении экспериментов, связанных с оптимизации дифференциации и тканевой инженерии.

Введение

Технология индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) приносит потенциал клеточной терапии замены, болезни и развития моделирования и наркотиков и токсикологические скрининг1,2,3. Терапии концептуально может быть достигнуто путем инъекции клеток, in vitro продифференцировано имплантации ткани (например, сердечный патчи), или руководствуясь регенерации с помощью тканевой инженерии. Амниотической жидкости (Канадские) и мембраны стволовых клеток (АМСГ) являются отличным источником клеток для этих мероприятий либо непосредственно4,5,6,7 или в качестве начальной популяции клеток для перепрограммирования в плюрипотентности8,9,10,,1112.

Ранних подходов используется неопределенный культуры систем или перепрограммирования методы, которые требуют предусматривать геномной интеграции конструкции9,10,,1112. Более недавние исследования занятых xeno свободной среде, хотя менее определенной матрицы вложение базальной мембраны (BMM) был использован, для создания iPSC от амниотической жидкости эпителиальных клеток. Однако пробирного формирования тератома не был включен в исследование наряду с богатством in vitro и молекулярных данных. Амниотической жидкости эпителиальные клетки были обнаружены примерно пищеводный перепрограммирования большую эффективность по сравнению с новорожденным фибробластов13. В другом исследовании мезенхимальные стволовые клетки амниотической жидкости были также признаны быть перепрограммированы в iPSC с гораздо более высокой эффективности12.

Плюрипотентных стволовых клеток могут быть дифференцированы в тканях представитель всех 3 зародышевых и таким образом имеют широкий потенциал. Педиатрических больных выиграют от уборки, перепрограммирования и тканевая инженерия их аутологичные стволовые клетки амниотической жидкости пренатально и амниотической мембраны стволовых клеток перинатально. Кроме того относительно низкий уровень дифференциации фетальных стволовых клеток (ниже, чем взрослые стволовые клетки14,15) теоретически могут помочь в решении наблюдается сохранение эпигеномные предвзятости из исходных ячеек в iPSC16.

Здесь мы представляем собой протокол для перепрограммирования амниотической жидкости и мембраны стволовых клеток для плюрипотентности в химически определены xeno бесплатно E8 среднего рекомбинантных vitronectin17 (СТС) с помощью episomal плазмид18. Основным преимуществом амниотической жидкости и мембраны клеток как источник клеток для перепрограммирования заключается в их наличие предварительной и перинатально и таким образом этот подход будет главным образом пользу исследования в педиатрических тканевой инженерии.

протокол

Протокол следует организационные руководящие принципы Комитета по этике для исследований человеческого. Для использования амниотической жидкости для исследований было получено письменного согласия пациента.

Этот протокол следует политике использования комитета университета Южной Алабамы и институциональный уход животных.

1. изоляция и культуре первичных амниотической мезенхимальных стволовых клеток

  1. Обшивка амниотической жидкости клеток
    1. Получите как минимум 2,5 мл амниотической жидкости, найденным в процессе амниоцентез врачом.
      Примечание: Все обработки живых клеток и тканей должны быть выполнены в кабинете стерильные культуры ткани и надлежащего личного защитного оборудования должны быть использованы. Знакомство с основными клеточной культуры и стерилизации не требуется.
    2. Подготовить амниотической жидкости и мембраны клеток (AFMC) культуры среднего: базальной средний EBM-2, 15% плода бычьим сывороточным (ФБС), 20 нг/мл bFGF, 25 нг/мл EGF, 10 нг/мл IGF. Для культуры первичной амниотической жидкости, а также амниотической мембраны стволовых клеток носитель следует дополнить антибиотик противогрибковое решения.
    3. В день 0 Смешайте 2,5 мл амниотической жидкости с 3,5 мл AFMC питательной среды и пластины в T25 колбу. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2 в течение по крайней мере 48 часов спокойно до проверки на наличие колоний.
    4. На 5 день должен присутствовать колоний адэрентных клеток. Встряхните флакон выбить клетки, которые не в полной мере придерживаться нижней и мусора и вакуум аспирата отработанного среднего/амниотической жидкости смеси с помощью пипетки Пастера. Замените с 5 мл свежего AFMC среды.
    5. Культура для еще 5 дней. Изменение среднего каждый день, как описано в шаге 1.1.4.
  2. Изоляция первичного мезенхимальных стволовых клеток из человека амнион
    1. Получите как можно скорее после рождения, в течение 24 часов на самой последней, чтобы максимизировать сотовой целостности плаценты. Вырезать 9 см2 сегмент амнион, удаления сгустков крови и мойте в 50 мл пластиковых пробирок с PBS, дополнена антибиотик противогрибковое решение по 30 мл.
    2. Фарш мембраны, используя пару скальпелей до изысканных штук в стерильные 10 см ткани культуры блюдо. Пищеварение мембраны и извлечение клеток будет достигаться с помощью системы диссоциации ткани. Следуйте производителя протокол.
      Примечание: тонкие кусочки ткани после измельчения, тем выше число клеток оправился после переваривания.
    3. Передача массы ткани фарш мембраны, с помощью лезвия скальпеля в трубу диссоциации одной ткани и смешать с 4,7 мл среды RPMI 1640. Смешайте в диссоциации ферменты (см. Таблицу материалы).
    4. Подключить трубы на ткани диссоциатором и запустить программу «h_tumor_01». Инкубируйте трубы при 37 ° C на качающейся платформе для 30 мин.
    5. Далее, разбавленных суспензиях с 35 мл RPMI 1640 и применить к стрейнер 70 мкм, помещенном над 50 мл Коллекция пластиковых пробирок.
    6. Центрифуги для 5 минут при 200 x g при комнатной температуре, удалить супернатант, Ресуспензируйте гранулы в 5 мл RPMI 1640, подсчитать количество ячеек с помощью hemacytometer и пластина на плотность 10 000 клеток/см2 в культуре ткани лечение сосудов с свежезаваренным подготовлен AFMC средний дополнена антибиотик противогрибковое решения.
      Примечание: В случае неполной пищеварение, небольшие кусочки ткани будет присутствовать и отдельные ячейки будет мало. Спин вниз снова и пластины весь Пелле в одном T75 колбу.
  3. Культура первичный Страхователь и АМСГ
    1. Проход колоний AFSC/АМСГ, вакуум аспирационных провел средних с помощью пипетки Пастера и добавление 2 мл клеток отряд фермента в колбу. Инкубируйте при 37 ° C за 5-8 мин.
    2. Нажмите на колбу помочь выбить клетки и смешать подвеска с равным объемом AFMC среды (антибиотик противогрибковое дополнение не должно быть необходимо с этого момента). Центрифуга на 200 г на 4-5 мин удалить супернатант, используя либо стеклянная пипетка Пастера, или просто путем переворачивать трубки и опорожнения его в контейнер для отходов.
    3. Проведите в нижней части пластиковых пробирок разбить Пелле в одну ячейку подвеска в оставшиеся капли жидкости и смешать с AFMC средством для обшивки. Плита в T-колбы на плотности между 2 500 и 5000 клеток/см2.
    4. Изменение среднего каждый день. Не культура клеточных линий после прохода 6. Для перепрограммирования целей, используйте как низкий проход максимально.
    5. Готовить замороженные запасы AFSC и АМСГ как ИБП back-ups с использованием замораживания средств. Урожай культур с использованием клеток отряд фермента, центрифуги на 200 г на 4 ° C за 5 мин.
    6. Удалите с помощью пипетки Пастера супернатант и Флик в нижней части трубки множественном числе ячеек в гранулы. Ресуспензируйте в полное замораживание среднего на плотности 1 × 106/мл и Алиготе в криопробирки. Хранить в контейнере замораживания на ночь на-80 ° C. Затем переходите к жидким азотом для длительного хранения.

2. перепрограммирование в плюрипотентность

  1. Получить перепрограммирования плазмиды
    1. Приобрести перепрограммирования плазмид через репозиторий некоммерческой плазмиды. Соглашение о передаче материала необходима.
    2. Превратить плазмид в E. Coli сведущие клетки и изолировать плазмид, используя набор для извлечения коммерческих плазмиды. Следуйте инструкциям производителя.
    3. Измерьте концентрацию плазмидной ДНК с помощью спектрофотометра. Цель для высокой концентрации результате плазмида, идеально около 1 мкг/мкл, чтобы избежать разбавления образца во время transfection.
    4. Измерять концентрации индивидуальных плазмиды, с помощью УФ спектрофотометр и Алиготе их индивидуально.
    5. Смешайте 3 мкг, 3 мкг и 2 мкг, EN2K, ET2K и M2L плазмид, соответственно. Это решение перепрограммирования плазмиды. Количество раствора, плазмида достаточно, чтобы transfect 1 x 106 клеток. Подготовьте несколько таких аликвоты.
    6. Хранить все аликвоты-80 ° c.
  2. Подготовить целевой культуры пластин
    1. Покрыть один 6-ну пластину с vitronectin – добавьте 1 mL vitronectin буфера для разведения в каждой скважине и смешайте 40 мкл ВТН Стоковый раствор (1 мкг/см2). Оставьте при комнатной температуре (RT) или в инкубаторе при 37 ° C за 1 час.
    2. Вакуум аспирата решения с помощью пипетки Пастера и заменить 2 мл AFMC среды в каждой скважине. Хранить при 37 ° C, до тех пор, пока клетки должны быть покрытием.
      Примечание: Важно: средний AFMC, используемые на этом шаге не должен содержать любой антибиотик или противогрибковое решения.
  3. Урожай культивированный первичный Страхователь/AMSC
    Примечание: Расширьте AFSC/АМСГ в культуре достаточно, чтобы замороженные запасы на ряд низкий проход и посвятить один T-75 Фляга для перепрограммирования. С как несколько 100000 клеток являются достаточными для эксперимента, направлены на сбор около 500000 клеток для компенсации потерь, и если оптимизации параметров трансфекции или различные культуры условий должны испытываться.
    1. При первой возможности на низкий проход урожай Канадские/AMSC с использованием клеток отряд фермент смесь, как описано в шаге 1.3.1 для 1.3.2. После того, как клетки были центрифугируется, переходите к следующему шагу.
    2. Ресуспензируйте Пелле в 1 мл PBS и перемешать хорошо мыть компоненты сыворотки. Подсчет количества ячеек с помощью hemacytometer. Отрегулируйте плотность клеток до 100000/мл PBS и Алиготе в 1,5 мл пробирок microcentrifuge. Это обеспечивает только минимальное время контакта между ячейками и буфер, используемый для transfection.
    3. Место пробки microcentrifuge поверх 5 мл полистирола трубы (как адаптеры, позволит центрифугирования в очередной качели ротора) и центрифуги на 200 x g 4 мин при комнатной температуре. Инвертировать трубы и удалить супернатант в контейнер для отходов. Не используйте фиксированный угол ротора.
    4. Выполните дополнительные центрифугирования шаг на 200 x g 3 мин при комнатной температуре. Это позволит остальная жидкость от стен трубки собирать внизу. Тщательно удалить все это с помощью пипетки 200 мкл.
  4. Трансфекция с перепрограммирование плазмиды
    1. Для перепрограммирования эксперименты, системы трансфекции (см. Таблицу материалы) будет использоваться для доставки перепрограммирования плазмид в клетки. Место трансфекции советы, transfection трубы, ресуспендирования буфер и электролитический буфера в кабинет министров культуры ткани. Комплект реагентов хранятся в РТ, до тех пор, пока они открыты, то они хранятся при 4 ° C.
      Примечание: Мы используем 10 мкл версию комплекта.
    2. Переместите устройство трансфекции закрыть таким образом, чтобы его станция метро могут быть размещены непосредственно в кабинете. Заполнить один трансфекции трубки с 3 мл электролитический буфера и подключить трубку в станцию, нажав все пути внутри гнезда.
    3. Возьмите перепрограммирования плазмида решение аликвоты, подготовленную на этапе 2.1.5 из-80 ° C для хранения и позволяют им оттепель в РТ в культуре кабинета.
    4. Трансфекция устройства, выберите следующие параметры трансфекции: 950 V, 40 мс и 1 импульса.
    5. Ресуспензируйте гранулы, содержащие 100000 клеток в 10 мкл буфера ресуспендирования. Работать быстро с этого момента на так как буфер ресуспендирования Слаботоксичные и увеличение Выдержка приводит заметно ниже жизнеспособность клеток.
    6. Смешайте в 1/10 перепрограммирования плазмида решения (решения аликвота был подготовлен для в общей сложности 1 х 106 клеток).
    7. Смонтируйте трансфекции наконечник на трансфекции пипеткой.
    8. Аспирационная суспензию клеток в трансфекции наконечник осторожно, избегая образования пузырьков воздуха. Если наблюдаются пузырьки, высылать подвеска и повторите стремление. Пузырьки воздуха будет препятствовать transfection.
    9. Вставьте трансфекции пипетку в трансфекции трубку и нажмите кнопку «Пуск» на экране устройства transfection. Подождите на экране сообщение, информирующее об успехе трансфекции и немедленно выньте дозатор из трубки.
    10. Высылать подвеска в 1 хорошо подготовленных в разделе 2.2 пластины 6-ну целевой. Смешайте в средне-и от соседних хорошо и равномерно подвеска в обеих скважин (результате плотность ячеек будет 50000/хорошо).
    11. Повторите трансфекции для всех microcentrifuge пробирки, содержащие AFSC/AMSC индивидуально. Место пластину в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2.
  5. Культура transfected AFSC/AMSC
    1. Культура transfected клеток для 2-5 дней. Затем переключиться на перепрограммирования среднего, состоящий из E8, дополняется 100 мкм натрия бутират в день 3.
      Примечание: Среднее прохождение может выполняться избежать разрастание источника AFSC/АМСГ. Однако пассированый будет отключить параметр правильно рассчитать перепрограммирования эффективности, если этот параметр имеет интерес.
    2. Измените перепрограммирования среднего каждый день на каждый день в течение 10 дней. Изменение среднего каждый день от дня 10.
  6. Ручной сбор полностью reprogramed колоний клоновых расширения
    1. Полностью перепрограммировать колонии появляются вокруг дней 14. Разрешить колоний расширить размер и стать компактным. Они могут вручную собраны и переданы свежие пластины как день 15-16.
    2. 1 час до процедуры подбора, пальто 24-ну пластины с 8 мкл ВТН в 300 мкл буфера для разведения vitronectin за хорошо (1 мкг/см2) и Инкубируйте на RT или 37 ° C. Замените E8 среднего без натрия бутират решение.
    3. В стерильные культуры кабинета выберите колоний достаточного размера (в идеале более 400 мкм в диаметре). Этап микроскопа контраст или стереомикроскопом может использоваться.
    4. Для комплектации, LCD изображения микроскопа, помещены в кабинете будет использоваться так, как его монитор устраняет необходимость для окуляров. Стерилизуйте микроскопа с 70% этиловом спирте.
    5. С помощью микроскопа культуры клеток очередной этап контраст, выберите, Марк и обратите внимание на количество колоний быть собраны. Это важно, чтобы убедиться, что время не зря этот процесс во время фактической комплектации.
    6. Заполните количество трубок ПЦР, является равным или больше, чем количество колоний выдаются с 30 мкл 0,5 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в PBS. Колонии будут помещены в эти трубы для частичного диссоциации перед обшивкой.
    7. План выбрать 5 колоний в то время из плит с помощью пипетки 10 мкл, равным 2 мкл. удерживая наконечник пипетки на угол на краю колонии и осторожно и постепенно скрести всей колонии от поверхности. Немедленно аспирационная всей колонии в наконечник пипетки и перевести его в одной из подготовленных ПЦР пробирки с ЭДТА.
    8. Повторите с оставшихся 4 колоний. Инкубируйте на RT для 4-6 мин.
    9. Накапайте подвески вверх и вниз, осторожно с помощью больше кончика пипетки с распадаются в колонии на небольшие сгустки. Избегайте создания отдельной ячейки подвеска.
    10. Пластина подвески прямо в цель хорошо 24-ну пластины, подготовленную на этапе 2.6.2. Повторите с оставшихся колоний.
    11. Повторите шаги 2.6.6 через 2.6.10, если больше чем 5 колоний должны быть собраны, но не выбрать более 5 колоний на один раз. Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2.
  7. Клоновых расширения и созревания iPSC
    1. Разрешить колоний расти и стать компактным. 3-6 дней, достаточно. Изменение культуры среднего ежедневно. Используйте между 400 мкл и 1 мл среды E8, основанный на плотность клеток.
    2. Уэллс 24-ну пластины с достаточной плотностью колонии будет расширена в 6-ну пластины. 1 ч до пассированый, покройте 6-ну пластины с СТС (как в шаге 2.2.1). Затем замените раствора в скважине 2 мл среды E8 в колодец.
    3. Аспирационная отработанного среднего от источника скважин с помощью пипетки 1 мл и замените 300 мкл 0,5 мм ЭДТА мыть. Аспирационная немедленно с помощью же наконечник пипетки и заменить с 300 мкл 0,5 мм ЭДТА снова, а затем Инкубируйте на RT на 5 мин аспирационная все жидкости с помощью пипетки 1 мл.
    4. Установите дозатор 1 мл емкость, смонтировать широкий родила подсказка 1 мл на нем и аспирационная E8 среднего из целевого объекта и в кончик. Смыть культуры iPSC исходного потока среды.
    5. Перенесите подвеска в цель хорошо и пипетки вверх и вниз несколько раз, чтобы разрушить колоний в сгустки 20-50 клеток. Убедитесь, что они получают распределены равномерно в колодец нежный качания и покачивая пластину и Инкубируйте на 37 ° C и 5% CO2.
    6. Изменение среднего ежедневно и проход каждые 3 до 4 дней. Любые дифференцирования колоний может быть отмечен под микроскопом фазово контрастной и удаляется с помощью кончика пипетки в культуре кабинета. Это позволяет для выборочного распространения культуры чистого iPSC высокого качества.
    7. 1 ч до пассированый, пальто скважин 6-ну пластины с ВТН как шаг 2.2.1. Затем замените решение 2 мл среды E8 в колодец.
    8. Рутинной пассированый похож на первоначальный пассированый делается с помощью 0,5 мм ЭДТА (шаги 2.7.2 в 2.7.5). Замените отработанного среднего в одной скважине 6-ну плиты с 1 мл раствора ЭДТА мыть и отбросить.
    9. Добавьте 1 mL ЭДТА и Инкубируйте на RT на 5-7 мин для частичной диссоциации. Оптимизировать время инкубации при необходимости, убедившись, что приостановление вокруг 20-50-клеток сгустки производится. Избегайте диссоциации в одиночных камерах.
    10. Отменить решение ЭДТА и аспирационная 1 мл E8 среды с помощью пипетки 1 мл из целевого объекта в наконечник пипетки широкий родила.
    11. Смыть источник iPSC культуры с потоком среды E8 неоднократно до тех пор, пока желаемый часть его был освобожден от поверхности и передачи в цель хорошо. Эта часть представляет собой соотношение Сплит (например, 1/8 культуры могут быть переданы на соотношение 1:8.)
    12. Проход каждые 3-4 дня. Позволяют iPSC линии зрелым путем культивирования их для по крайней мере 15 ходов перед их использованием в нижнем течении эксперименты

3. характеристика и подтверждения плюрипотентность

Примечание: Обратитесь к дополнительные файлы для деталей проточной цитометрии и confocal микроскопии.

  1. Тератома формирования пробирного
    1. Для определения способности iPSC дифференцироваться в тканях представителей всех трех зародышевых путем формирования пробирного тератома, следуйте институциональной политики в отношении ухода за животными и использование, планирование впереди дать время для подачи соответствующий протокол документы. Тератома формирования в мышах займет от 6-10 недель.
    2. Культура 4 скважины 6-ну плиты в iPSC линию на 4 дня. Приблизительное количество клеток, вводят в один фланг мыши — 0,5 до 1 x 106 клеток. Опционально: дополнительный хорошо может быть посвящен определение представителя ячейки номер в хорошо посредством диссоциации одной ячейки с энзимом отряд клетки и подсчета голосов.
    3. Рассчитать объем смеси E8/BMM iPSC сгустки будет приостановлено в: оба фланки мыши вводят, каждый с 150 мкл суспензии комок. Три мыши достаточно для тестирования тератома формирования одной линии iPSC. Включите дополнительно 150 мкл на иглу в результате тома, чтобы компенсировать потерю мертвого объема. используется 1 игла на мышь. Общий объем-таким образом 3 * (150 мкл * 2 + 150 мкл) = 1350 мкл
    4. Частично отделить iPSC колоний с ЭДТА, как если бы они должны были быть пассированной, как описано в шагах 2.7.8 для 2.7.10. Важно, что в колонии быть отделен в кусты и не разделены на отдельные клетки.
    5. Смывают iPSC колоний с 675 мкл среды E8 (половина вычислительного объема от шага 3.3.3), используя широкий родила подсказка. Передача подвеска комок в 5 мл трубку из полистирола. Место на льду.
    6. Объединить с 675 мкл BMM. Сохранить полученный подвеска на льду до инъекции.
    7. Анестезировать мышей, чтобы парализовать их с помощью изофлюрановая. Это следует выполнить или руководствуясь квалифицированным персоналом виварий.
    8. Вихревой полистирола 5 мл трубки кратко и аспирационная комок подвеска (450 мкл на мышь) в один инсулин шприц с иглой 22 G. Придать 150 мкл суспензии клеток подкожно. Этот том содержит приблизительно 1 х 106 клеток (см. шаг 3.1.2).
    9. Придать 3 мыши на линию iPSC. Следуйте практике надлежащего ухода за животными для всех процедур.
    10. Следить за здоровьем мышей ежедневно.
    11. Когда тератомы достигают конечной точки диаметром 1,5-2 см, усыпить мышей, explant тератомы и хранить их в растворе формалина для фиксации ткани за 24 ч.
    12. Принести фиксированным тератомы механизма основные гистология гематоксилином (H & E) эозином. Патологоанатом будет класс наличие тканей всех трех зародышевых.
      Примечание для Karyotyping: живой iPSC культур должны быть отправлены в специализированных цитогенетических лаборатории для тестирования целостности кариотипа. Рекомендуется, что это тестирование выполняется каждые 5 проходов.
  2. Транскрипционный анализ профиля
    1. Культура 2 скважин 6-ну плиты для 3-4 дней, чтобы получить один образец РНК. Используйте только высококачественные культур, мелкие загрязнения с дифференциации клеток могут быть решены путем соскабливания их с помощью кончика пипетки.
    2. Изолируйте РНК от iPSC культур, использование коммерчески доступных комплект после производителя протокол. Отправляем образцы в учреждение специализированных геномной ядро.
    3. Получения глобальной transcriptional профили линий iPSC, используя microarrays (см. Таблицу материалы для поддерживаемых вариантов) или РНК последовательности.
    4. Отправьте файлы «*.idat» для оценки bioinformatic плюрипотентности через веб-интерфейс в институте Coriell. В качестве альтернативы, представить «* .cel» файлы для bioinformatic идентификации типа клеток, включая плюрипотентных стволовых клеток, через веб-интерфейс при Университете Джонса Хопкинса. Смотрите Таблицу материалы сведений о типах данных отдельных bioinformatic анализы согласиться.

Результаты

Обоснованное письменное согласие было получено от пациентов до уборки амниотической жидкости для генетического тестирования и посвятить небольшой Алиготе жидкости для исследования. Согласие не требуется для использования амниотической мембраны в исследованиях ка...

Обсуждение

Первоначальный этап формирования iPSC из фетальных стволовых клеток влечет за собой извлечение исходных ячеек из фетальных тканей, их культуры, расширение и внедрение episomal перепрограммирования плазмид. Этот этап следует период культуры около 14-18 дней до первого полностью перепрограмми...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Тюрингия Medizinische Fonds в Цюрихском университете, Forschungskredit университете Цюриха,Ch SCIEX NMS под 10,216 стипендии и 12.176, Швейцарское общество кардиологии, Швейцарский Национальный научный Фонд под Грант [320030-122273] и [310030-143992], 7-й Рамочной программы, жизнь клапана, Европейской Комиссией в рамках гранта [242008], Ольга Mayenfisch фонд, Фонд EMDO, целевой дотации 2012 больницы университета Цюриха, и внутреннее финансирование института рака Митчелл.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Tumor Dissociation Kit, humanMiltenyi Biotec130-095-929tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes
gentleMACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235tissue dissociation system, dissociator
Thermo Scientific™ Shandon™ Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm)Thermo-Fisher3120032
70 µm cell strainersCorning10054-456
RPMI 1640 mediumThermo-Fisher32404014 
rocking platformVWR40000-300
50 ml centrifuge tubesThermo-Fisher339652
15 ml centrifuge tubesThermo-Fisher339650
EBM-2 basal mediumLonzaCC-3156basal medium for AFMC medium
FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated)Prospec BioCYT-218bFGF, supplement for AFMC medium
EGF Human, PichiaProspec BioCYT-332 EGF, supplement for AFMC medium
LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human RecombinantProspec BioCYT-022IGF, supplement for AFMC medium
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualifiedThermo-Fisher10439024FBS
Antibiotic-Antimycotic (100X)Thermo-Fisher15240062 for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells!
Accutase cell detachment solutionStemCell Technologies07920cell detachment enzyme
CryoStor™ CS10StemCell Technologies07930complete freezing medium
PBS, pH 7.4Thermo-Fisher Scientific10010023 
EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)Qiagen12362for plasmid isolation
pEP4 E02S EN2KAddgene20925EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4
pEP4 E02S ET2KAddgene20927ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4
pCEP4-M2LAddgene20926M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28
NanoDrop 2000c UV-Vis SpectrophotometerThermo-FisherND-2000Cspectrophotometer
Neon® Transfection SystemThermo-FisherMPK5000transfection system, components:
Neon pipette - transfection pipette
Neon device - transfection device
Neon® Transfection System 10 µL KitThermo-FisherMPK1025consumables kit for the Neon Transfection System, it contains:
Neon tip - transfection tip
Neon tube - transfection tube
buffer R - resuspension buffer
buffer E - electrolytic buffer
Stemolecule™ Sodium ButyrateStemGent04-0005small molecule enhancer of reprogramming
TeSR-E8StemCell Technologies05940E8 medium
Vitronectin XF™StemCell Technologies07180VTN, stock concentration 250 µg/ml, used for coating at 1 µg/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer
CellAdhere™ Dilution BufferStemCell Technologies07183vitronectin dilution buffer
UltraPure™ 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo-Fisher15575020dilute with PBS to 0.5 mM before use
EVOS® FL Imaging SystemThermo-Fisher ScientificAMF4300LCD imaging microscope system
CKX53 Inverted MicroscopeOlympusphase contrast cell culture microscope
Pierce™ 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-freeThermo-Fisher28908dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 °C for 1 week
Perm Buffer IIIBD Biosciences558050permeabilization buffer, chill to -20 °C before use
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488BD Biosciences557782isotype control for Oct3/4A, Nanog
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647BD Biosciences557783isotype control for Sox2
Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor® 488BD Biosciences561628
Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor® 488BD Biosciences560791
Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor® 647BD Biosciences562139
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488BD Biosciences401617isotype control for TRA-1-60
Mouse IgGM, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401618isotype control for TRA-1-81
Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor® 488BD Biosciences330613
Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330705
Mouse IgG1, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 488BD Biosciences400129isotype control for SSEA-1
Mouse IgG3, κ Isotype Control, Alexa Fluor® 647BD Biosciences401321isotype control for SSEA-4
Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor® 488BD Biosciences323010
Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor® 647BD Biosciences330407
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 488Jackson Immunoresearch115-606-068use at a dilution of 1:600 or further optimize
Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor® 647Jackson Immunoresearch115-546-068use at a dilution of 1:600 or further optimize
DAPIThermo-Fisher ScientificD21490stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution
Corning® Matrigel® Growth Factor Reduced, Phenol Red-FreeCorning356231basement membrane matrix (BMM)
scid-beige mice, femaleTaconicCBSCBG-F
RNeasy Plus Mini Kit (50)Qiagen74134RNA isolation kit
T-25 flasks, tissue culture-treatedThermo-Fisher156367
T-75 flasks, tissue culture-treatedThermo-Fisher156499
Nunc™ tissue-culture dishThermo-Fisher12-567-650 10 cm tissue culture dish
6-well plates, tissue-culture treatedThermo-Fisher140675
Neubauer counting chamber (hemacytometer)VWR15170-173
Mr. Frosty™ Freezing ContainerThermo-Fisher5100-0001 freezing container
FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5mlCorning3520585 ml polystyrene tubes
Eppendorf tubes, 1.5 mlThermo-Fisher05-402-961.5 ml microcentrifuge tubes
PCR tubes, 200 µlThermo-Fisher14-222-262
pipette tips, 100 to 1250 µlThermo-Fisher02-707-407narrow-bore 1 mL tips
pipette tips, 5 to 300 µlThermo-Fisher02-707-410
pipette tips, 0.1 to 10 µlThermo-Fisher02-707-437
wide-bore pipette tips, 1000 µlVWR89049-166wide-bore 1 mL tips
glass Pasteur pipettesThermo-Fisher13-678-20A
ethanol, 200 proofThermo-Fisher04-355-451
vortex mixerVWR10153-842
chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glassThermo-Fisher155409glass-bottom confocal-grade cultureware
22G needlesVWR82002-366
insulin syringesThermo-Fisher22-253-260
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma-AldrichHT501128-4Lfixation of explanted teratomas
Illumina HT-12 v4 Expression BeachChipIlluminaBD-103-0204expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer
PrimeView Human Genome U219 Array PlateThermo-Fisher901605expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest
GeneChip™ Human Genome U133 Plus 2.0 ArrayThermo-Fisher902482expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest
PluriTest®Coriell Institutewww.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data
CellNetJohns Hopkins Universitycellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data

Ссылки

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Yu, J., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).
  4. Schmidt, D., et al. Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source. Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).
  5. Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth. Placenta. 32, S316-S319 (2011).
  6. Weber, B., et al. Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation. Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).
  7. Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects. Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).
  8. Slamecka, J., et al. Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).
  9. Jiang, G., et al. Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  10. Pipino, C., et al. Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking. Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).
  11. Cai, J., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells. J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).
  12. Ge, X., et al. Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells. Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).
  13. Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).
  14. Kang, N. -. H., et al. Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells. Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).
  15. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  16. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  17. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  18. Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  19. Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).
  20. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  21. Adewumi, O., et al. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).
  22. Müller, F. -. J., et al. A bioinformatic assay for pluripotency in human cells. Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).
  23. Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering. Cell. 158 (4), 903-915 (2014).
  24. Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma. STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).
  25. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  26. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).
  27. Müller, F. -. J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines. Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).
  28. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129iPSCepisomalvitronectin8

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены