JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Целью настоящего Протокола является возможность для обнаружения в vivo антиген специфические убийство из целевой ячейки в мышиных модели.

Аннотация

Текущей методологии антиген специфические убийство ограничены для использования в пробирке или использованы в модели инфекционных заболеваний. Однако это не протокол, специально предназначенные для измерения антиген специфические убийство без инфекции. Этот протокол разработан и описывает методы, чтобы преодолеть эти ограничения, позволяя для обнаружения антиген специфические убийство из целевой ячейки, CD8+ T-клеток в vivo. Это достигается путем слияния с традиционной CFSE-меченых целевого убийства пробирного модель вакцинации. Эта комбинация позволяет исследователю оценить потенциал CTL антиген специфические прямо и быстро, как assay не зависит от роста опухоли или инфекции. Кроме того индикация основана на проточной цитометрии и поэтому должно быть легко доступной для большинства исследователей. Главное ограничение этого исследования является определение timeline в естественных условиях , соответствующий гипотеза тестируется. Вариации численности антигена и мутации в Т-клеток, которые могут привести к дифференциальной цитолитических функции необходимо тщательно оценивать определить оптимальное время для клеток урожай и оценки. Соответствующей концентрации пептидные для вакцинации был оптимизирован для hgp10025-33 и OVA257-264, но потребуются дополнительные проверки для других пептидов, которые могут быть более подходящим для данного исследования. В целом этот протокол позволяет быстро оценки убийстве функции в естественных условиях и может быть адаптирована к любой данной антигена.

Введение

Множественные протоколы существуют для оценки цитолитических (CTL) потенциал CD8+ или CD4+ Т-клеток. Эта оценка может быть легко сделано в пробирке в контролируемых условиях1,2,3. Кроме того, модели инфекционных заболеваний, таких как LCMV, классически изучили CTL функции с использованием дифференциально CFSE (5-(and 6)-Карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidyl эфира) помечены клетки-мишени где CFSEПривет-помечены клетки пульсирующий с пептида и CFSEЛо-обозначенные цели, клетки остаются unpulsed. Клетки затем вводят в соотношении 1:1 и оценены за потерю CFSEПривет-обозначены потока цитометрии4импульсных цели. Вакцины и неприятие модели также использовали аналогичные стратегии для оценки в vivo убивает обоих CD8+ и CD4 клеток+ T также, как NK клеток5,6. Это мощный пробирного, но требует использования инфекционных агентов, которые премьер иммунной системы до целевой инъекций.

Этот протокол, с другой стороны, требует не ранее инфекция хоста и вместо этого использует стратегию вакцинации премьер иммунной системы до целевой инъекций. Этот вакцинации состоит из водной основе разработки вакцины пептид, который требует предоставления иммуностимулирующее коктейль называется covax7, состоящая из Толл подобный рецептор 7 (TLR7) агонистов (Имиквимод крем), агонистических анти CD40 антитела и интерлейкин-2 (IL-2), ведущих к синергетического сочетание иммуностимулирующее агентов для выхода грунтование пептид конкретных и надежных иммунной реакции. Таким образом этот assay обеспечивает быстрый индикация CTL функции как вакцина осуществляется наряду с клетки для оценки функции только за три дня до инъекции клеток-мишеней. Кроме того covax грунт достаточно сильны, что убийство потенциала загрунтовать антиген специфические Т-клеток можно увидеть между 4 и 24 ч после инъекции.

Главное ограничение этого протокола является определение шкалы времени в естественных условиях для обнаружения целевого убийства, подходящим для антигена и гипотеза тестируется. Внимательны, что оценки должны быть выполнены, как различия в силу антиген, а также генетические изменения испытывается в Т-клеток может привести к дифференциальной функции CTL, которая потребует различных сроков обнаружения целевого убийства. Кроме того, в то время как соответствующие концентрация пептидный для вакцинации был оптимизирован для человека меланомы антигена гликопептидных 100 (hgp10025-33) и овальбумина257-264 (OVA257-264)8,9 , использование другого антиген модель, которая может быть более подходящим для данного исследования потребует дальнейшей проверки. Из-за ожидаемых различий в целевой антигены способность стимулировать CTL эффекторные функции в сочетании с covax как вспомогательное средство оптимизация IL-2 дозе концентрации дозы и частоты может быть необходимо для достижения желаемой цели. В целом этот протокол позволяет для быстрой оценки убийстве функции в естественных условиях и может быть адаптирована к любой данной антигена.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета Техаса MD Anderson Cancer Center.

1. Подготовка пептида вакцины

  1. Распустить лиофилизированные пептид с фосфат амортизированное saline (PBS) для соответствующей концентрации и вихрь 30 s.
    Примечание: Для hgp10025–33, окончательный концентрация составляет 1 мг/мл и для OVA257–264, конечная концентрация 0,5 мг/мл. Воссоздания пептид до инъекции. Не храните после растворения.

2. изоляция Splenocytes от трансгенные мыши

Примечание: Изоляция клетки от хандры должны выполняться на основе стерильной.

  1. Усыпить OT-1 трансгенные мыши методом утвержденных CO2 удушья и удаление селезенки.
    Примечание: Соответствующие трансгенные мыши используется в этот шаг, специфических для пептида выбора.
    1. Положите мыши на его правой стороне. Спрей с левой стороны мыши с 70% этанола (EtOH). Подтянуть кожу с помощью щипцов и вырезать кожу, используя Ножницы хирургические; Хандра будет видимым в брюшной полости. Аккуратно Разрежьте брюшной полости для доступа к селезенке. Удаление селезенки, используя пинцет.
  2. Дезагрегировать селезенки, поместив его в 70 мкм фильтром в чашке Петри с 2 мл средний A (PBS с 1% плода бычьим сывороточным (ФБС)) и разгрома селезенки с конца поршень.
    1. Сбор splenocytes от Петри блюдо и место в 50 мл Конические трубки. Вымойте Петри с 5 мл среды A дважды, чтобы собрать все клетки. Добавить средних вверх к 25 мл и центрифуги клетки для 5 мин при комнатной температуре на 475 x g.
  3. Аспирационная клетки и Ресуспензируйте в 1 мл / селезенки буфера lysis эритроцитов (РБК). Инкубации при комнатной температуре для 5 минут добавить 10 мл среды A и центрифуги при комнатной температуре на 475 x g. Ресуспензируйте Пелле в 10 мл среды A и удаления мусора путем фильтрации суспензии клеток через фильтр 70 мкм в чистой 50 мл конические.
  4. Подсчитать ячейки, используя Трипановый синий и Горяева. Ресуспензируйте клетки в PBS в конечной концентрации 106 - 1006 клеток/мл. Для OVA257–264 конкретные убийства, Ресуспензируйте на 106 клеток/мл и для hgp10025–33 конкретные убийства, Ресуспензируйте на 1006 клеток/мл.
    1. Спина, остальные ячейки при комнатной температуре в течение 5 мин в 475 x g. аспирационная супернатант и Ресуспензируйте в 15 мл холодной PBS для мытья клетки. Мыть Повторите еще раз. Спина, клетки при комнатной температуре в течение 5 мин в 475 x g. аспирационная супернатант и Ресуспензируйте в холодной PBS согласно окончательный объем, определенный на шаге 2.4.
    2. Передавать одну ячейку подвеска пробки microcentrifuge 1,5 мл и держать на льду до инъекции в получателей C57/BL6 мыши.

3. инъекции Splenocytes от трансгенных мышей

  1. Место получателя C57/BL6 мышь в фиксатор с спинной стороне вверх. Спрей инъекции хвост базовая область с 70% изопропиловый спирт. Управлять 100 мкл одноклеточного подвеска (раздел 2) внутривенно в Вену хвост с помощью иглы 27 G скос стороной вверх.

4. Covax администрация

Примечание: Если клетки вводят в послеобеденное время, covax должно осуществляться следующим утром в течение 18 ч инъекции клеток.

  1. Поместите курсор мыши в поле ясно анестезии с изофлюрановая 1-3%. После того, как мышей полностью наркоз, передать головных конусов, прилагается к коллектору в зале анестезии мышей. Держите мышь сдержанной с спинной стороне вверх.
    Примечание: Анестезии подтверждается щепотку краткий ног для проверки вывода ответа не было получено. Федеральный закон ограничивает использование изофлюрановая по приказу лицензированных ветеринара.
  2. Спрей инъекции хвост базовая область с 70% изопропиловый спирт. Подкожно вводить 100 мкл раствора пептида (раздел 1) с помощью иглы 27 G с шприц, проникая хвост базы региона, скос иглы, стороной вверх 4-5 мм.
    Примечание: В одном фланге с подкожно в основание хвоста10привиты мышей.
  3. Придать 100 мкл анти CD40 антитела (0.5 мг/мл бульона) сбоку место инъекции вакцины.
  4. Осторожно примените имиквимод крем 50 мг/мышь на сайтах вакцинации. Руб имиквимод крем на поверхности до тех пор, пока крем не видна и полностью всасывается.
  5. Придать внутрибрюшинно 100 µL 100 000 МЕ/мл rhIL-2 белка (и.п.) в нижней области живота. Соблюдайте мышей за 5 мин, после того, как они полностью оправиться от анестезии.
    Примечание: Эксперимент приостанавливается в этой точке на 3 дня.

5. изоляция Splenocytes целевой для маркировки с CFSE

Примечание: Изоляция клетки от хандры должны выполняться на основе стерильной.

  1. Усыпить мышей C57BL/6 согласно утвержденным методом удушение CO2 . Удалите spleen(s) как шаг 2.1.1. Дезагрегировать селезенки и мыть splenocytes как шаги 2.2.1 - 2.2.3. Лизируйте красные кровяные клетки как шаги 2.3 - 2.3.2.
  2. Удалить ячейки для подсчета с помощью Горяева и рассчитать конечная концентрация клеток на 106 клеток/мл в растворе CFSE-маркировки (описано в шаге 7). Спиновые оставшиеся ячейки при комнатной температуре за 5 мин на 475 x g. аспирата супернатант.

6. пептидные пульсирующий Splenocytes целевой

Примечание: Пептид пульсирующий должны выполняться на основе стерильной.

  1. Ресуспензируйте клетки на 106 клеток/мл в полной СМИ (средства массовой информации RPMI 1640 с 10% FBS, 1% L-глютамин (L-Gln), 1% пенициллина/стрептомицина (Pen/Strep)). Клетки делят на две пробирки (15 мл конические). Ярлык каждая трубка импульсного или unpulsed.
  2. Добавьте, что пептид для трубки помечены пульсирующий. OVA257–264 пульсирует, добавить 1 мкг/мл и hgp10025–33 пульсирует, добавить 2 мкг/мл.
    Примечание: Unpulsed клетки претерпевают же инкубации как пульсирующий клетки просто без добавления пептида.
    1. Инкубации клеток + пептид при 37 ° C в течение 1 ч.
  3. Добавить 10 мл полной СМИ (RPMI 1640 СМИ с 10% FBS, 1% L-глютамин (L-Gln), 1% пенициллина/стрептомицина (Pen/Strep)) для каждой трубы мыть оба импульсных и unpulsed клеток-мишеней. Спиновые оставшиеся ячейки при комнатной температуре за 5 мин на 475 x g. аспирата супернатант.

7. Подготовка CFSE для маркировки Splenocytes целевой

  1. Готовят раствор CFSE-маркировки во время клетки, промывание в шаге 6,3; пульсирующий клетки будут помечены как CFSEПривет и unpulsed как CFSEЛо. 1 мл раствора CFSE-маркировки подготовиться 106 клеток.
    Примечание: CFSE является светочувствительный и должны быть защищены от света во все времена.
    1. Подготовка CFSEПривет -маркировки СМИ, добавив 1 uL/мл CFSE (Стоковый раствор 5 мм) для окончательного концентрации 5 мкм/мл в СМИ RPMI 1640 с 2% FBS.
    2. Подготовка CFSEЛо -маркировки СМИ, добавив 1 uL/мл CFSE (Стоковый раствор 0,5 мм) для окончательного концентрация средств 0.5 мкм/мл RPMI 1640 с 2% FBS.

8. Маркировка целевой Splenocytes с CFSE

Примечание: CFSE маркировки должны выполняться на основе стерильной.

  1. Ресуспензируйте импульсных и unpulsed целевые клетки (из шага 6.3) на 106 клеток/мл CFSE-маркировки СМИ. Ресуспензируйте импульсного клетки с готовым CFSEПривет-маркировки СМИ и unpulsed клетки с подготовил CFSEЛо-маркировки СМИ.
  2. Сочетание клетки и CFSE-маркировки СМИ нежный инверсии или закрученной. Не следует смешивать с vortexing. Инкубации клеток и CFSE-маркировки СМИ при 37 ° C на 15 мин Remix клетки каждые 5 мин.
  3. Добавьте 10 мл полной СМИ в каждой ячейке подвеска и спин клеток при комнатной температуре в течение 5 мин на 475 x g.
  4. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в 10 мл холодной PBS. Вращайте клетки на 4 ° C за 5 мин на 475 x g.
  5. Повторите шаг 8.4.
  6. Подсчитать ячейки и микс пептид импульсных, CFSEПривет-с unpulsed, CFSEЛо-помечены клетки в соотношении 1:1 для инъекций в получателей мышей. Держите Алиготе 1 х 106 смешанные клетки для базовой оценки потока цитометрии (раздел 11).
    Примечание: Окончательный объем для инъекций-100 мкл на мышь. Окончательный клеток считается 10e6 клетки. Потери объёма в шприц и иглу необходимо принимать во внимание и должно оцениваться в 500 мкл.

9. инъекции клеток-мишеней

Примечание: Держать CFSE-меченых клетки, защищенном от света до и во время инъекции как можно больше.

  1. Место получателя мышей C57BL/6 фиксатор с спинной стороне вверх. Спрей инъекции хвост базовая область с 70% изопропиловый спирт. Администрировать 100 мкл одноклеточного подвеска внутривенно в Вену хвост скос стороной вверх.

10. переизоляция клеток-мишеней

Примечание: Сроки этого шага является критическим и зависят от CTL цитотоксичности и сила антигена для стимуляции. Для оценки убийстве пульсирующий объект264 257–OVA клетки должны быть заготавливаемым 4-6 ч после инъекции. Так как CFSE-меченых клетки легких чувствительных, процесс селезенки в темноте.

  1. Усыпить получателя мышей C57BL/6 согласно утвержденным методом удушение CO2 .
  2. Удалите spleen(s) как шаг 2.1.1. Дезагрегировать селезенки и мыть splenocytes как шаги 2.2.1 - 2.2.3. Лизируйте красные кровяные клетки как шаги 2.3 - 2.3.2.
  3. Ресуспензируйте клеток в 1 мл клеток активированных флуоресцированием Сортировка (FACs) буфера (1% BSA + PBS) для оценки подачей cytometry.

11. стробирования логику для определения активности CTL подачей Cytometry

  1. Выполните оценку активности CTL, используя протокол цитометрии стандартного потока. Приобрести клетки используя FITC канал на проточный цитометр с 488 нм лазер для возбуждения11.
    1. Ворота на живой лимфоцитов с помощью параметров точечной (SSC) стороне против вперед точечной (FSC). Subgate в рамках живой лимфоцитов ворота для всего CFSE-позитивной популяции.
      Примечание: Вводят CFSE-меченых клетки составит небольшое подмножество всего лимфоцитов в селезенке. CSFE-положительных клеток должны появиться как два отдельных популяций на шкале журнала.
    2. Использовать формат гистограммы, чтобы определить процент unpulsed (левый пик, CFSEЛо) и импульсного (правый пик, CFSEПривет) населения. Потеря CFSEПривет клеток указывает на антиген специфические CTL активность.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

До инъекции клеток-мишеней, помечены CFSE смесь 1:1 ячейка запускается на проточный цитометр для определения базовой частоты CFSEПривет и CFSEЛо клеток-мишеней. Рисунок 1 A показывает стробирования стратегии для обнаружения изменений в п?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Хотя этот протокол является простым, есть несколько важных шагов, которые должны тщательно выполняться. Covax грунтовка, после инъекции антиген специфические Т-клеток проходит проверку необходимо увидеть любые убийства импульсного целей. Хотя вполне возможно, что на водной основе covax ва?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа поддерживается низ исследования (A1R03AI120027 (RN) и 1R21AI20012 (RN)), Грант институциональных исследований (RN), начальный Грант (RN) и MD Андерсон CIC семенного предоставлении (RN).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
6 to 12 week old female C57BL/6 mice Charles River027C57 Black 6 mice
OT-1 6-12 week old female mice Jackson Labs003831
hgp10025–33 CPCScientific834139KVPRNQDWL
OVA 257–264 CPCScientificMISC-012SIINFEKL
Imiquimod cream 5% Fougera51672-4145-6Aldara Cream
CD40-specific mAb BioXcellBE0016-2clone FGK4.5
rhIL-2 protein Hoffman LaRoche Inc136Recombinant human IL-2 protein
70% isopropyl alcohol Prep KendallS-17474
PBSLife Technologies10010-023Phosphate Buffered Saline
FBSLife Technologies26140-079fetal bovine serum
RBC lysis buffer Life TechnologiesA10492-01red blood cell lysis buffer
RPMI 1640 MediaLife Technologies11875119
L-Glutamine Life Technologies25030081
Pen/StrepLife Technologies15140122penicillin/streptomycin
CFSELife TechnologiesC345545-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester
Bovine serum albumin (BSA)Sigma A4503
1.5 mL MCT graduated natural Fisher05-408-129microcentrifuge tube
70% ethanolFisherBP8201500EtOH
Trypan blue solution, 0.4%  Life Technologies15250-061
HemocytometerFisher267110
27 gauge needleBD305109
1 mL syringeBD309659

Ссылки

  1. Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
  2. Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
  3. He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
  4. Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
  5. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627(2014).
  6. Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
  7. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
  8. Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
  9. Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
  10. Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
  11. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  12. Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

129CD8 TCFSE

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены