JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает анализ мигает поверхности расширение комбинационного рассеяния вследствие случайного блуждания одной молекулы на поверхность серебра, с помощью силы законов.

Аннотация

С одной молекулы на перекрестке Серебряный nanoaggregate наблюдается мигание поверхности расширение комбинационного рассеяния (Серов). Здесь, представлены протокол о том, как подготовить SERS-активные Серебряный nanoaggregate, запись видео некоторых мигающий пятен в микроскопических изображений и анализа мигающий статистики. В этом анализе власть закона воспроизводит распределения вероятностей для ярких событий по отношению к их продолжительность. Распределения вероятностей для темных событий установлены законом питания с экспоненциальной функции. Параметры власть закона представляют молекулярной поведение в ярких и темных государствах. Может быть оценена модель случайного блуждания и скорость молекулы по всей поверхности серебра. Трудно оценить даже при использовании средние, автокорреляционной функции и суперразрешением SERS изображений. В будущем власть закона анализы должны сочетаться с спектральных изображений, потому что истоки мигает не может быть подтверждено только методом анализа.

Введение

Поверхность расширение комбинационного рассеяния (Серов) является высокочувствительным Рамановская спектроскопия от поверхности благородного металла. Так как спектр Раман предоставляет подробные сведения о молекулярной структуры, основанной на острый пик позиции, через колебательных режимах функциональных групп в молекулах, могут расследоваться информации одной молекулы на поверхности металла с помощью SERS1,2,3. Из серебра nanoaggregate с на уровне одной молекулы адсорбата мигающий сигнал наблюдается1,2,3,4,5,6, 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16и спектр колеблется1,2,3,4,5,6,,78, 9,10,11,12,,1314. Мигание может быть вызвана одной молекулы, что случайно перемещается из расширенной электромагнитное поле (EM) на стыке нанометрового размера серебра nanoaggregate. Поэтому мигает считается простые доказательства для обнаружения одной молекулы, по сравнению с техникой с использованием распределения Пуассона SERS интенсивности и3,Би аналита в2,17. Однако подробные механизмы мигающий и колебания спектра, который может сильно зависеть от молекулярных поведение на поверхности Ag, остается спорным.

В предыдущих исследованиях мигает SERS был проанализирован с помощью автокорреляционной функции, которые можно рассчитать коэффициент диффузии и концентрация молекул, движущихся из расширенной ЭМ поля12,13,14 . Кроме того Оценка нормированное стандартное отклонение, которое представляет нестабильность в общей интенсивности, почерпнута из профиля время сигнала15. Однако эти аналитические подходы могут основываться на поведение нескольких молекул. Напротив в супер-резолюции изображений мигает SERS, сингл молекула поведение в расширенной ЭМ поля может быть определены16. Однако эти методы могут получить такие параметры только в расширенной ЭМ поля. Случайное поведение одной молекулы в широком диапазоне (например, в мигающий SERS) может быть представлено как власть закона, вместо того, чтобы средний4,5,6,7,8 ,9,10,11, похожими на мигающий флуоресценции из одного полупроводниковых квантовых точка (QD)18,19. Используя власть закона анализа4,5,6,7,8,9,10,11, молекулярные поведение может быть оценена в яркие государства (в расширенной области EM) и темное состояние10; то есть можно оценить поведение молекулы на всей поверхности серебра.

Для этой техники, коллоидное серебро nanoaggregates являются используемые в4,5,6,,78,9,10,11. Эти nanoaggregates показывают различные локализованные поверхностного плазмон резонанс (ЛСПР) полос, которые сильно влияют на расширение электромагнитных полей, когда они рады на определенных длин волн. Таким образом можно сразу получить SERS-активные серебряные наночастицы существуют в коллоидной суспензии и некоторые данные. В случае простой наноструктур, которые имеют конкретные размеры, формы и механизмы, ЛСПР зависимость SERS мигает можно скрыть другие зависимости7; а именно если используется хорошо или плохо наноструктур для ЛСПР, параметры будет постоянным, и поэтому другие зависимости будут скрыты. Анализ питания закон был использован для обнаружения различных зависимостей мигающий SERS Серебро коллоидное nanoaggregates4,5,6,,78, 9 , 10 , 11.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Пробоподготовка

  1. Подготовка коллоидных наночастиц серебра 20
    1. Для изготовления коллоидных наночастиц серебра, Растворите 0.030 g нитрата серебра и 0.030 g тринатрия цитрат дигидрат в 150 мл воды в колбу 200 мл круглым дном.
    2. Совместить колбу с Дефлегматоры (Dimroth).
    3. Перемешайте раствор в колбу с баром магнитной мешалкой и перемешать. Затем тепло перемешивания раствора в колбу в масляной ванне при 150 ° C для 60 мин.
      Примечание: Решение повернет желтый, затем молочно-серый.
    4. Cool подвеска при комнатной температуре и держать подвеска в колбе, покрытые алюминиевой фольги в холодильник.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена на данный момент. Используйте наночастицы коллоидных, после хранения в холодильнике, в течение одного месяца.
  2. Подготовка образца для разноцветные мигающие выбросов 11
    1. Готовые микроскопа, вручную мыть стеклянной пластины с мылом и промыть водой.
    2. Добавить 0,1% водный раствор поли L-лизин в стеклянной пластине и удалить решение с вентилятором.
    3. Добавить Серебро коллоидное подвеска в стеклянной пластине и удалите подвеска с вентилятором.
    4. Заключите область на стеклянную пластину с жидким блокатор ручкой.
    5. Падение дистиллированной воды на стеклянной пластине и покрыть ее с другой стеклянной пластины для создания микроскопа и предотвратить испарение воды.
  3. Подготовка образца для монотонный цветные мигающий SERS 7 , 8 , 9 , 10
    1. Готовые микроскопа, вручную мыть стеклянной пластины с мылом и промыть водой.
    2. Смешать Серебро коллоидное подвеска с thiacyanine или thiacarbocyanine краситель (25 или 4 мкм, соответственно) и водный раствор NaCl (10 мм) в том соотношении 2:1:1.
    3. Удалить образец подвеска на стеклянную пластину и удалите подвеска с вентилятором.
    4. Заключите область на стеклянную пластину с жидким блокатор ручкой.
    5. Падение водный раствор NaCl (1 М) на стеклянную пластину для иммобилизации наночастиц серебра и покрыть ее с другой стеклянной пластины для создания слайд плита микроскопа и предотвратить решение от испарения.

2. наблюдение за мигает наночастиц серебра

  1. Освещение образца
    1. Поместите образец стеклянной пластины, подготовлен с использованием протокола 1.2 или 1.3 на сцене инвертированным микроскопом.
    2. Освещения стеклянной пластины образца, используя белый свет через конденсор темного поля и сосредоточиться на различные цветные пятна (синий, зеленый, желтый и красный) на стеклянной пластине с помощью объектива (60 X).
    3. Осветить образца стеклянной пластины с помощью аттенуированные луча, поставлены под углом 30° по отношению к поверхности образца, от диодный лазер накачкой твердого (СППЗ) непрерывном (cw) через фильтр помех.
    4. Чтобы использовать лазерной подсветки для наблюдать Серебряный nanoaggregates как монотонный цветные пятна в одноцветных окружающих, переместить области освещения лазерный центр мнение и сосредоточиться на пятна на стеклянной пластине, регулируя сцену в z направлении.
  2. Наблюдение за мигает
    1. Вставьте фильтр Лонг перевал после объектива и освещать образца стеклянной пластины с помощью DPSS cw лазерный луч, поставлены под углом 30° по отношению к поверхности образца через фильтр помех.
    2. Найти, мигающие пятна, как показано на рисунке 1 (см. также Рисунок S1 в дополнительном материале), перемещая сцене в x - и y направления.
    3. Запись видео мигающий пятен с инвертированным микроскопом, в сочетании с охлаждением цифровой зарядовой (связью ПЗС) камеры, который имеет разрешение время 61-120 мс, за 20 мин.

3. анализ мигает SERS

  1. Дифференцирование время профиля из видео
    1. В программное обеспечение, которое управляет камеры на ПЗС откройте видео файл.
    2. Чтобы выбрать мигающий пятна и темные области, перетащите областей, которые отдельно охватывают регионы с и без пятен на видеоизображении.
    3. Для получения сигнала интенсивности время профили от мигающий пятна и темных областей в видео, выберите Временной анализ в анализеи нажмите кнопку Calculate в окне Временной анализ .
    4. Сохраните данные в текстовый файл.
  2. Анализ времени профиля
    1. Выровнять базовый профиль времени путем вычитания время профиль из темной области и/или установку с полиномиальной функцией, как показано в цифры 2A и 2B.
    2. Оцените усредненной базовых интенсивности, который состоит из примерно 2000 очков, ябазыи стандартное отклонение базовой интенсивностей, σ, как показано в цифры 2 c и 2D.
    3. Отличают яркие события от темных событий с помощью большей интенсивности порога ябазовый + 3σ и записи длительности выполнения каждого события. На рисунке 3, например, записать событие от 0 до 3.5476 s как темное событие (с продолжительностью t = 3.5476 s) и записать событие от 3.5476 до 4.0981 s как яркое событие (с продолжительностью t = 0.5505 s). Повторите процедуру, как показано в таблице 1.
    4. Подсчитать количество ярких и темных событий для каждого срока, как выражено в первой и второй строках Таблицы2.
    5. Сумма за каждый срок, за исключением событий, короче, чем продолжительность tколичество событий. Выраженное в второй и третьей строках таблицы 2, например, сумма количество событий для каждого продолжительности (за исключением события для t = 0.0612 s) как 41 + 18 + 9 +...; результат равен суммирования для t = 0.1223 s, т.е. 103.
    6. Разделите суммированием каждый длительность и выполняет их нормализацию. Как указано в таблице 2, например, разделить суммирования для длительности t = 0.0612 s, s продолжительность 0.0612. В результате получается 3,351.5791. Затем разделите результат на общее число результатов в четвертой строке в таблице 2. Распределение вероятностей является производным быть 0.64494.
    7. Участок распределения вероятностей для ярких событий Pна(t) против их продолжительность t в графе логарифм логарифм и журнал10Pна(t) журнал10 (figure-protocol-6978) вывести власть закона экспоненты αна для конкретного мигает пятно. Если Pна(t) figure-protocol-7164 , линии установлены отклоняется от участков при малых значениях Pна(t), как показано пунктирной линией на рисунке 4A.
    8. Участок распределения вероятностей для темных событий Poff(t) против их продолжительность t в графе логарифм логарифм и установите Log10Poff(t), (10) журнала figure-protocol-7688 вывести власть закона экспоненты αпокинуть и усечения время τ от же мигает пятно. Если Poff(t) figure-protocol-7898 , гладкой кривой отклоняется от участков при малых значениях Poff(t).
    9. Повторите 3.2.1 для 3.2.8 для других мигающий пятна в видео.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Из серебра nanoaggregates с поли L-лизин, подготовленный протокол 1.2 разноцветные мигающий пятна от SERS и поверхности расширение флуоресценции наблюдаются, как показано на рисунке 111. В отличие от монотонной цветные мигающий пятна от SERS наблюдалис?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

От перекрестка Серебряный nanoaggregate выдается SERS. Таким образом нам нужно подготовить nanoaggregates, вместо того, чтобы коллоидных наночастицы, которые покрыты цитрат анионов. Серебряный агрегатов образуются из солить, эффект, созданный путем добавления поли L-лизин, которая -NH-3+ и пр...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Благодарности

Автор благодарит профессор ю. Озаки (Kwansei Гакуин университет) и д-р T. Ито (национального института передовых промышленных наук и технологий) за их плодотворное обсуждение этой работы. Эта работа была поддержана KAKENHI (целевые субсидии для научных исследований C) от министерства образования, культуры, спорта, науки и технологии (№ 16K 05671).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Silver nitrate, 99.8%Wako194-00832
Trisodium citrate dihydrate, 99. %Wako191-01785
Poly-L-lysine aqueous solution, 0.1%Sigma-AldrichP8920
3,3'-disulfopropylthiacyanine triethylamineHayashibara Biochemical LaboratoriesNK-2703a kind of thiacyanine dyes
3,3'-diethyl-5,5'-dichloro-9-methylthiacarbocyanine iodine saltHayashibara Biochemical LaboratoriesSMP-9a kind of thiacarobocyanine dyes
Sodium chloride, 99.5%Wako191-01665
Dimroth condenserIwaki61-9722-22perchased from AS ONE
Magnetic stirrerCorningDC-420D
Oil bathAdvantechOS-220
Glass plateMatsunamiS-1112Microscope slide
BlowerHozanZ-288Air duster
Liquid blocker penDaido SangyoLIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). Ready-to-use hydrophobic barrier pen designed for immunohistochemistry applications
Inverted microscopeOlympusIX-70
Objective lensOlympusLCPlanFl 60×NA 0.7
Dark field condenserOlympusU-DCDNA 0.8–0.92
Cooled digital CCD cameraHamamatsuORCA-AGcontrolled by software Aqua Cosmos
Software for the cooled digital CCD cameraHamamatsuAquaCosmosused for also derivation of the time-profiles from the blinking spots in the video 
Color CCD cameraELMOTNC-C920not used for analysis
DPSS laserRGB laser systemNovaPro532-75λ = 532 nm;
60 mW (corresponds to a power density of 600 W/cm2)
Interference filterSemrockLL01-532-12.5
Long pass filterSemrockBLP01-532R-25
Software for the distinguishment and counting of the bright/dark eventshome-maidprogrammed by C++
Software for the fitting by a power lawLightStoneOrigin6.1

Ссылки

  1. Qian, X. M., Nie, S. M. Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications. Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).
  2. Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering. Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).
  3. Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics. Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).
  4. Kitahama, Y., Ozaki, Y. Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function. Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells. , Wiley. Chichester. Chapter 6 (2014).
  5. Kitahama, Y. Truncated Power Law Analysis of Blinking SERS. Frontiers of Plasmon Enhanced Spectroscopy Volume 1 (ACS Symposium series Vol. 1245). , American Chemical Society. Washington DC. Chapter 4 (2016).
  6. Bizzarri, A. R., Cannistraro, S. Lévy Statistics of Vibrational Mode Fluctuations of Single Molecules from Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. Lett. 94, 068303(2005).
  7. Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Power-law analysis of surface-plasmon-enhanced electromagnetic field dependence of blinking SERS of thiacyanine or thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 7439-7448 (2011).
  8. Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function. Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).
  9. Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths. J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).
  10. Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).
  11. Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law. J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).
  12. Habuchi, S., et al. Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein. J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).
  13. Weiss, A., Haran, G. Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics. J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).
  14. Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS. Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).
  15. Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism. J. Chem. Phys. 136, 024703(2012).
  16. Willets, K. A. Super-resolution imaging of SERS hot spots. Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).
  17. Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).
  18. Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. Power-law intermittency of single emitters. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).
  19. Tang, J., Marcus, R. A. Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots. J. Chem. Phys. 123, 054704(2005).
  20. Lee, P. C., Meisel, D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols. J. Phys. Chem. 86, 3391-3395 (1982).
  21. Krichevsky, O., Bonnet, G. Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications. Rep. Prog. Phys. 65, 251-297 (2002).
  22. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review. Biochemistry. 41, 697-705 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

131LThiacyanineThiacarbocyanine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены