JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает использование модели хронической сократительной активности упражнения соблюдать адаптации стимуляции индуцированного скелетных мышц в крыса задних конечностей.

Аннотация

Скелетных мышц является весьма гибкой ткани, как его биохимических и физиологических свойств значительно изменяются в ответ на упражнения хроническом. Для изучения основных механизмов, которые приводят различные приспособления мышц, ряд упражнений протоколов, таких как беговая дорожка, колесо работает и плавательный Упражнения были использованы в исследованиях на животных. Однако, осуществлять эти модели требуют длительного периода времени, чтобы достичь мышцы адаптации, которые также могут регулироваться гуморальные или неврологические факторов, тем самым ограничивая их применение в изучении сужением индуцированной адаптации конкретных мышц. Косвенные низкой частоты стимуляции (10 Гц) вызвать хронические сократительной активности (ОСО) использовался как альтернативная модель для осуществления профессиональной подготовки, как он успешно может привести к мышечной митохондриальной адаптации в течение 7 дней, независимо от системных факторов. Этот документ детализирует хирургические методы, обязаны применять лечение ОСО в скелетных мышцах крыс, для широкого применения в будущих исследований.

Введение

Скелетных мышц может адаптироваться для осуществления профессиональной подготовки путем внесения изменений в его биоэнергетики и физической структуры1. Одним из основных изменений, вызванных выносливости является биогенеза митохондрий, которые можно оценить путем увеличения в выражении митохондриальной компонентов (например, цитохрома с-оксидазы [Кокс] подразделения), а также выражение transcriptional coactivator, PGC-1α2. Растущее количество исследований указали, что множество других факторов, включая митохондриальной оборот и mitophagy, также имеют важное значение для адаптации мышц. Однако, механизмы, который острый или хронический упражнения регулировать эти процессы в скелетных мышцах до сих пор неясны.

Определить пути, которые регулируют мышцы упражнения индуцированной адаптаций, различные упражнения модели широко использовались в грызунов исследований, включая беговая дорожка, колесо бег и плавание упражнения. Однако эти протоколы имеют некоторые ограничения в том, что необходимо соблюдать эти фенотипические изменения3,,45~ 4-12 недель. Как альтернативный экспериментальный метод, низкочастотной стимуляции индуцированного хронический сократительной активности (ОСО) эффективно использовался, как это может привести к мышечной адаптации в значительно более короткий период (т.е., до 7 дней) и его последствия быть сопоставимы с, или даже больше, чем другие протоколы упражнения. Кроме того присутствие гормональные6, температура7и8 неврологические эффекты могут сделать это трудно понять мышц конкретные ответы на упражнения хроническом. Например, гормон щитовидной железы9,10 и инсулина подобный фактор роста (IGF) -1 посредником адаптации обучения индуцированная мышц, которые также может регулировать другие сигнальные пути в скелетных было выявлено11 мышцы. В частности ОСО индуцированные эффекты минимально регулируется системных факторов, позволяя сосредоточиться на прямой ответ скелетных мышц сократительной активности.

Внешний блок для ОАС был впервые введен12Тайлер и Райт и был разработан с изменения12. Иными словами, группа состоит из трех основных частей: инфракрасный детектор, который может быть включен и выключен под воздействием инфракрасного света, генератор импульсов и Импульсный индикатор (рис. 1). Подробная схема дизайн блока стимулятор был ранее описанные13. Подробные и конкретные особенности ОСО можно найти в большей глубины в ряде обзор статей14,,1516,17. В краткой, стимуляции протокол предназначен для активации общего малоберцового нерва низкой частотой (т.е., 10 Гц), и вынуждены контракт на иннервируемые мышцы (передней tibialis [т] и [EDL] Лонг разгибатель пальцев) предопределило продолжительность времени (например, 3-6 ч). Со временем это сдвигает вышеупомянутых мышцы более аэробных фенотип, свидетельствует увеличение плотность капиллярной18 и митохондриальной содержание19,,2021. Таким образом этот метод является проверенную модель для имитации некоторых из основных выносливость обучения адаптации в скелетных мышцах крыс.

Этот документ представляет подробную процедуру хирургии имплантации электродов побудить ОАС, так что исследователи можно применить эту модель в их исследованиях упражнения. ОСО является прекрасной моделью для изучения время курс мышц адаптаций, обеспечивая тем самым эффективным инструментом для исследования различных молекулярных и сигнализации событий в обеих точках раннее и позднее время после начала осуществления обучения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры, связанные с животных были рассмотрены и одобрены Комитетом уход животных Йорк университета. По прибытии в объекте животных в Йоркском университете все крысы были переданы акклиматизироваться к их окружающей среде до хирургической процедуры, с питанием ad libitumне менее пяти дней. Хотя этот протокол был применен ранее для других видов по15,17,22, настоящий документ основывается на новаторскую работу Pette и коллег23 и фокусируется на крыс модель, специально.

1. Подготовка группы хронических сократительной активности

  1. С помощью вольтметра проверьте потенциал монета литиевых батарей.
    Примечание: Потенциал каждой батареи должны быть 3.0 ± 0.10 V.
  2. Вставьте два или три батареи в гнездо блока таким образом, чтобы общий потенциал V 6-9.
    Примечание: Это на усмотрение исследователи рассмотреть сколько потенциал (6 или 9 V) поддерживать во время всей экспериментальной процедуры. В зависимости от дизайна исследования и желаемой интенсивности стимула 2 или 3 батареи могут быть использованы.
  3. Убедитесь, что устройство работает правильно через индикатор импульса, предоставляя группе 1 импульса испускаемого Портативный инфракрасный свет вспышки.

2. хирургическая процедура хронической сократительной активности

Примечание: Стерилизуйте все хирургические инструменты перед хирургической процедуры. Во время и сразу после операции температура тела крыс поддерживается грелку. Желательно выполнять хирургические процедуры на хирургические пелерина. Хирург должен носить стерильные хирургические перчатки, а также чистый халате. При необходимости, рекомендуется носить одноразовый респиратор маски.

  1. Анестезировать крыс под 1-3% изофлюрановая ингаляции с кислородом, который управляется системой испаритель газа. Подтвердите, что животное полностью седативные, проверяя щепотка ног задних конечностей и наблюдая дыхательных глубины и скорости. Примените глазные смазки на глаза, чтобы избежать сухости. Применяют подкожно мелоксикама (0.5 мг/мл) 2 мг/кг.
    Примечание: Также рекомендуется иметь мультимодальной применение обезболивания (например, Мелоксикам плюс лидокаина) для сведения к минимуму любой боли во время и после операции.
  2. Аккуратно брить левой задних конечностей, а также полосы вокруг туловища от задней части шеи, около позади передних конечностей и по всей передней грудной клетки. Аккуратно протрите бритая районы с йодом и этилового спирта для дезинфекции.
  3. С животным, лежа на животе, сделать небольшой надрез (~0.5 см) на задней части шеи в центре бритая региона (ощутима район между лопатками) с помощью скальпеля (№ 10 лезвия).
  4. Найдите общего малоберцового нерва.
    1. Roll животных на правый бок и сделать ~ 2-3 см-долго резать в коже левой задних конечностей. Целевые области разрез вокруг Бедро мышечные группы, landmarked между ямочка коленного сустава и обратно недалеко от происхождения хвост.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы не загрязнять области первый разреза при изменении положения тела.
    2. Использование тупой накренилась изогнутые ножницы хирургические, вскрыть подкожной области широко ~3.5 - 4 см, отделяя кожу от базовых мышцы для того чтобы сделать карман между открытой кожи и основные мышцы. Откройте кожи из основной ткани по всей окружности разрез (~1.5 см2).
    3. Сделайте небольшой надрез (менее 0,5 см) на Двуглавая мышца бедра мышцы с Ножницы хирургические, обеспечивая, что советы ножницы вырубка непосредственно через мышцу.
    4. Аккуратно откройте области резки до тех пор, пока внутренние мышечных групп и общего малоберцового нерва являются видимыми (глубина внешних мышечных тканей (то есть, Двуглавая мышца бедра) – вокруг ~0.5 см). С помощью щипцов, аккуратно касания/щепотку видимой нерва и наблюдать ответы целевых групп мышц (например, TA мышцы) и ног (видимые dorsiflexion) для подтверждения, что общего малоберцового нерва является изолированным.
      Примечание: Этот шаг должно быть сделано с особой осторожностью, чтобы избежать резки или повреждения нерва.
    5. Исправьте окно, потянув его открыть с помощью металлических ретракторы, таким образом, что размер окна равен ~1.5 см2 с малоберцового нерва, лежащего в центре окна. Используйте небольшие металлические крючки, прилагается лямки и/или резиновых полос, которые прикреплены к поверхности стола (или хирургии Совет) (рис. 2A).
  5. Подсоедините провод к обеим сторонам нерва.
    1. Подготовить ~ 50-60 см из политетрафторэтилена (ПТФЭ)-покрытием тонкой проволоки из нержавеющей стали и сложить его пополам.
      Примечание: Это может быть полезно подвергать PTFA-покрытием провода под УФ света до операции.
    2. Крючок складчатые часть провода в щель 30 см длиной нержавеющей стальной стержень. Передайте стержень, наряду с провода, подкожно из открытых кармана задних конечностей к области небольшой разрез на задней части шеи, L-образный шаблон вверх ногу и вдоль по центру задней части.
    3. Найти два концы проволоки на задних конечностей. Стриптиз провода, поскольку все провода изолированные PTFE. С помощью скальпеля, тщательно Стрип концы проволоки ~1.5 см. Если провода стать изношен, вырежьте их и повторно Стрип. Оберните концы раздели проволоки вокруг притупляются игла 21 G (5 раз), делая катушки. Когда катушки правильно сделал, отпустите иглу из них.
    4. Используя размер Хирургический Шелковый 6-0, безопасность каждой из катушек по обе стороны от общего малоберцового нерва (рис. 2A).
      1. Сделать узел в самом конце катушки и шов на левой стороне нерва. Убедитесь, что катушки в 1,5-2,5 мм от нерва.
      2. Чтобы обезопасить катушки, применяются два или три дополнительных швов вдоль катушки.
      3. Повторите эти действия на правой стороне нерва.
    5. Применять 2-3 капли раствора антибиотиков (ампициллин в солевых; 132 мг/мл), а затем тщательно шовные окна (то есть, Двуглавая мышца бедра мышечной ткани) с помощью размер 5-0 шелк.
  6. Слабо Ветер оставшиеся слабину проволоки (о диаметре указательный палец) и толкать в подкожной карман выше разрез зашивается Двуглавая мышца бедра мышцы (примерно выше бедра).
  7. Применять 2-3 капли антибиотика решения снова (ампициллин в солевых; 132 мг/мл). Закройте открытые кожи путем сшивания.
  8. Подключите провода (выходит из области разреза шеи) к ОСО стимулятор.
    1. Подключите контактный разъемы с проводами.
      1. Снизить утопленными дужками, выйдя из разрез в верхней части шеи для создания 2 концы проволоки (эти приводят к катушек зашивается с обеих сторон малоберцового нерва).
      2. С помощью скальпеля, сдирать концы проводов на ~0.5 см. Cut off изношен провода, если таковые имеются.
      3. Медленно вставьте раздели части провода в отверстие сокетов, PIN-код и с помощью паяльник, припой провода на контакт розетки.
    2. При необходимости проверьте подключение проводов.
      1. Подключите контакты к блоку стимулятор большой benchtop через крокодил.
      2. Доставить один пульс 9 V (0,1 мс, 10 Гц) для подтверждения, что та мышцы контракты и левой ноги dorsiflexes.
    3. Передайте ПИН связано проволокой заканчивается через стерильный марлевый тампон, который ~ 4 см х 4 см.
    4. Подключите контакты к блоку стимулятор ОСО.
      1. Проходят провода через отверстие в основании окна стимулятор.
        Примечание: Это поле представляет собой самодельные камеру для блока стимулятор ОСО и 3,5 см × 3,5 см × 2,5 см13.
      2. Вставьте штифты в соединительный штуцер на блоке ОСО. Аккуратно вставьте блок ОАС в камеру. Использование липкие галс для обеспечения подразделения ОАС в нижней части камеры.
    5. С помощью спортивная(ый) лентой или пористых хирургические, fix камеры с лентой вокруг бритая туловища. Закрыть в верхней части камеры с тремя слоями лентой и закончить упаковочная лента по бокам окна стимулятором для обеспечения поле (рис. 2B).
  9. Проверить, работает ли ОАС, подвергая подразделения в единый импульс инфракрасного света (спектра волны > 770 нм) который испускается Портативный инфракрасный свет вспышки.
    Примечание: Если ОСО правильно работает, исследователи будет возможность увидеть что задних конечностей мышцы (т.е., TA) являются Договаривающимися в ответ на инфракрасный свет.
  10. Наблюдать крыс и следить за его температурой до тех пор, пока он полностью пришел в сознание. Дом в клетке одного пассажира для предотвращения любого вреда от других животных и не оставляйте любые туннели или пластиковые объекты в клетке на оставшуюся часть исследования для уменьшения риска повреждения стимулятор или травмы животного. Поставка с амоксициллин включена бутылка воды (0,5 мг/мл).
  11. Примените мелоксикам в дозе 1 мг/кг подкожно каждые 24 ч после операции, которая продолжается по крайней мере за 72 ч.

3. хронические сократительная активность

  1. После операции позволяют по крайней мере 5-7 дней для полного восстановления разрез и шовные районов в/вокруг скелетных мышц.
    Примечание: Во время и после процедуры ОАС, тщательно проверьте состояние каждого животного, наблюдая их поведения (например, питание, пить, или перемещение). Кроме того определите любой серьезный стресс или неблагоприятных эффектов, проверяя изменения веса тела до и после процедуры ОАС.
  2. В день ОАС стимуляции, включите ОАС, подвергая стимулятор блок на один импульс инфракрасного света (диапазон длин волн > 770 нм), Портативный инфракрасный свет вспышки.
  3. Примените 3 или 6 h 10 Гц ОСО стимуляции.
    Примечание: Временные рамки для стимуляции зависит от исследователя. Частоту стимуляции никогда не было изменено в этих экспериментах и наблюдались лишь весьма скромные улучшения в митохондриальной адаптации путем расширения стимуляции от 3 до 6 часов в день, в наш опыт. Если возможно проверьте стимуляции и животных каждые 30-60 мин.
  4. После желаемого периода ОАС выключите устройство ОСО через инфракрасных лучей (той же процедуре включения блока).
  5. Если применить несколько дней, повторите шаг 3.2. 3.4.
  6. Определите сроки ткани коллекции. Например Соберите ткани 24 ч после начала заключительный бой ОСО (т.е., 18 h после последнего ОСО стимуляции 6 ч), который проводится под наркозом, как это сделано в ходе хирургической процедуры ОАС. Сразу же после сбора всех тканей, усыпить животных путем иссечения сердце, в то время как животное находится все еще под анестезией.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы показали, что хронический сократительной активности (ОСО) является эффективным инструментом побудить благоприятные митохондриальной адаптации в скелетных мышцах. Крысы, подвергается ОСО (6 ч в день) на 7 дней отображения расширенной митохондриальной биогенеза сти?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Хронический сократительной активности (ОСО) модель упражнения, через низкочастотные мышечной стимуляции в естественных условиях, является прекрасной моделью для изучения мышцы Фенотипическая адаптация осуществлять13,24,25 , ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Мы благодарны Liam Тайрон за его эксперт чтении рукописи. Эта работа была поддержана финансирование от естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ) D. A. Худ. Д. а. капот также является обладателем Канада исследований кафедры физиологии клетки.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Sprague Dawley RatCharles RiverStrain 400
Chronic contractile activity unitHome-maden/a
CCA unit protective box (3.5 x 3.5 x 2.5 cm)Home-maden/aBox should be made of opaque material or covered in an opague tape
Coin lithium ion batteries (3V)PanasonicCR2016
MedwireLeico Industries316SS7/44T
Solder pin (socket)Digi-KeyED6218-ND
Zonas porous tapeJohnson & Johnson5104
Suture silk (Size 5)Ethicon640G
Suture silk (Size 6)Ethicon706G
Curved blunt scissor (11.5 cm Length)F.S.T.14075-11
Curved blunt scissor (15 cm Length)F.S.T.14111-15
Delicate haemostatic forceps (16 cm Length)Lawton06-0230
ScalpelFeather3
Curved forcepsF.S.T.11052-10
Stainless-steel rod (30 cm; 7mm diameter)Home-maden/aRod should have 5 mm slit in one end to hold the wire for tunneling under the skin
Clip applying forcepsKLS Martin20-916-12
Staples (clips)BbraunBN507R
Metal hooks/retractorHome-maden/a
Povidone-iodine (500 mL)Rougier#NPN00172944
Ampicillin sodiumNovopharm#DIN00872644
MetacamBoehringer#DIN02240463
Digital multimeter (voltmeter)Soar CorporationME-501
LED digital stroboscopeLutron Electronic EnterpriseDT-2269

Ссылки

  1. Holloszy, J. O., Coyle, E. F. Adaptations of skeletal muscle to endurance exercise and their metabolic consequences. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 56 (4), 831-838 (1984).
  2. Hood, D. A. Invited Review: contractile activity-induced mitochondrial biogenesis in skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1137-1157 (2001).
  3. Fernandes, T., et al. Exercise training restores the endothelial progenitor cells number and function in hypertension: implications for angiogenesis. J Hypertens. 30 (11), 2133-2143 (2012).
  4. Chabi, B., Adhihetty, P. J., O'Leary, M. F., Menzies, K. J., Hood, D. A. Relationship between Sirt1 expression and mitochondrial proteins during conditions of chronic muscle use and disuse. J Appl Physiol. 107 (6), 1730-1735 (2009).
  5. Lessard, S. J., et al. Resistance to aerobic exercise training causes metabolic dysfunction and reveals novel exercise-regulated signaling networks. Diabetes. 62 (8), 2717-2727 (2013).
  6. Irrcher, I., Adhihetty, P. J., Sheehan, T., Joseph, A. M., Hood, D. A. PPARgamma coactivator-1alpha expression during thyroid hormone- and contractile activity-induced mitochondrial adaptations. Am J Physiol Cell Physiol. 284 (6), C1669-C1677 (2003).
  7. Tamura, Y., et al. Postexercise whole body heat stress additively enhances endurance training-induced mitochondrial adaptations in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 307 (7), R931-R943 (2014).
  8. Mosole, S., et al. Long-term high-level exercise promotes muscle reinnervation with age. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (4), 284-294 (2014).
  9. Irrcher, I., Walkinshaw, D. R., Sheehan, T. E., Hood, D. A. Thyroid hormone (T3) rapidly activates p38 and AMPK in skeletal muscle in vivo. J Appl Physiol. 104 (1), 178-185 (2008).
  10. Lesmana, R., et al. The change in thyroid hormone signaling by altered training intensity in male rat skeletal muscle. Endocr J. 63 (8), 727-738 (2016).
  11. Hokama, J. Y., Streeper, R. S., Henriksen, E. J. Voluntary exercise training enhances glucose transport in muscle stimulated by insulin-like growth factor I. J Appl Physiol. 82 (2), 508-512 (1997).
  12. Tyler, K. R., Wright, A. J. A. Light weight portable stimulators for stimulation of skeletal muscles at different frequencies and for cardiac pacing. J Physiol Lond. 307, 6-7 (1980).
  13. Takahashi, M., Rana, A., Hood, D. A. Portable electrical stimulator for use in small animals. J Appl Physiol. 74 (2), 942-945 (1993).
  14. Ljubicic, V., Adhihetty, P. J., Hood, D. A. Application of animal models: chronic electrical stimulation-induced contractile activity. Can J Appl Physiol. 30 (5), 625-643 (2005).
  15. Pette, D., Vrbova, G. What does chronic electrical stimulation teach us about muscle plasticity? Muscle Nerve. 22 (6), 666-677 (1999).
  16. Pette, D. Historical Perspectives: plasticity of mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 90 (3), 1119-1124 (2001).
  17. Pette, D., Vrbova, G. The Contribution of Neuromuscular Stimulation in Elucidating Muscle Plasticity Revisited. Eur J Transl Myol. 27 (1), 6368(2017).
  18. Skorjanc, D., Jaschinski, F., Heine, G., Pette, D. Sequential increases in capillarization and mitochondrial enzymes in low-frequency-stimulated rabbit muscle. Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), C810-C818 (1998).
  19. Kim, Y., Hood, D. A. Regulation of the autophagy system during chronic contractile activity-induced muscle adaptations. Physiol Rep. 5 (14), (2017).
  20. Memme, J. M., Oliveira, A. N., Hood, D. A. Chronology of UPR activation in skeletal muscle adaptations to chronic contractile activity. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (11), C1024-C1036 (2016).
  21. Ljubicic, V., et al. Molecular basis for an attenuated mitochondrial adaptive plasticity in aged skeletal muscle. Aging (Albany NY). 1 (9), 818-830 (2009).
  22. Schwarz, G., Leisner, E., Pette, D. Two telestimulation systems for chronic indirect muscle stimulation in caged rabbits and mice. Pflugers Arch. 398 (2), 130-133 (1983).
  23. Simoneau, J. A., Pette, D. Species-specific effects of chronic nerve stimulation upon tibialis anterior muscle in mouse, rat, guinea pig, and rabbit. Pflugers Arch. 412 (1-2), 86-92 (1988).
  24. Ohlendieck, K., et al. Effects of chronic low-frequency stimulation on Ca2+-regulatory membrane proteins in rabbit fast muscle. Pflugers Arch. 438 (5), 700-708 (1999).
  25. Brown, M. D., Cotter, M. A., Hudlicka, O., Vrbova, G. The effects of different patterns of muscle activity on capillary density, mechanical properties and structure of slow and fast rabbit muscles. Pflugers Arch. 361 (3), 241-250 (1976).
  26. Skorjanc, D., Traub, I., Pette, D. Identical responses of fast muscle to sustained activity by low-frequency stimulation in young and aging rats. J Appl Physiol. 85 (2), 437-441 (1998).
  27. Kim, Y., Triolo, M., Hood, D. A. Impact of Aging and Exercise on Mitochondrial Quality Control in Skeletal Muscle. Oxid Med Cell Longev. 2017, 3165396(2017).
  28. Callewaert, L., Puers, B., Sansen, W., Jarvis, J. C., Salmons, S. Programmable implantable device for investigating the adaptive response of skeletal muscle to chronic electrical stimulation. Med Biol Eng Comput. 29 (5), 548-553 (1991).
  29. Kern, H., et al. Electrical stimulation counteracts muscle decline in seniors. Front Aging Neurosci. 6, 189(2014).
  30. Zampieri, S., et al. Physical exercise in aging human skeletal muscle increases mitochondrial calcium uniporter expression levels and affects mitochondria dynamics. Physiol Rep. 4 (24), (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

131

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены