Проточная цитометрия оценить стволовых клеток лейкемии в первичных острый миелолейкоз и пациент производные ксенотрасплантатов, диагностики и последующей вверх

Резюме

Мы наметим протокол для обнаружения одновременной выражение маркеров стволовых клеток лейкемии на первичной острой миелоидной лейкемии клеток проточной цитометрии. Мы покажем, как определить количественно 3 прародителем населения и предполагаемым LSC населения с увеличением степени созревания. Мы подтвердили наличие этих групп населения в соответствующих пациента производные ксенотрасплантатов.

Аннотация

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) является неоднородной и если не лечить, смертельной болезни. Это является наиболее распространенной причиной лейкемии связанные смертности взрослых. Первоначально бод-болезнь гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) характеризуется арест дифференциации, последующее накопление лейкозных клеток взрыва и сократил производство функциональных кроветворных элементов. Гетерогенность распространяется на наличие стволовых клеток лейкемии (LSC), с этой ячейкой динамический отсека развивается преодолевать различные отбора давления навязана при лейкемии прогрессии и лечения. Для дальнейшего определения LSC населения, помимо CD90 и CD45RA позволяет дискриминации нормальной СКК и Multipotent с прародителями в отсеке CD34 + CD38-клеток. Здесь мы приводим протокол обнаружения одновременной выражение несколько предполагаемых LSC маркеров (CD34 CD38, CD45RA, CD90) на первичный взрыв клетки человека ОМЛ, многопараметрических проточной цитометрии. Кроме того мы покажем, как определить количественно 3 прародителем населения и предполагаемым LSC населения с увеличением степени созревания. Мы подтвердили наличие этих групп населения в соответствующих пациента производные ксенотрасплантатов. Этот метод обнаружения и количественного определения предполагаемого LSC может использоваться для клинических решений ответ химиотерапии (т.е., минимальной остаточной болезни), как остаточная LSC может привести к бод рецидива.

Введение

Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) является наиболее распространенной причиной лейкемии связанные смертности. Первоначально бод является клоновых болезни гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) характеризуется арест дифференциации, последующее накопление взрыва клеток и сократил производство функциональных кроветворных элементов. Недавно клоновые гетерогенность популяции клеток взрыв был создан по существу с помощью следующего поколения стратегии виртуализации (НГС) и показаны существование внутри клональная эволюция опухолевые клетки¹.

Гетерогенность распространяется на наличие лейкозных стволовых клеток (LSC). Можно предположить, что этот отсек динамических клеток развивается преодолевать различные отбора давления, навязанной при лейкемии прогрессии и лечения. Поэтому LSC должны быть устойчивы к ТЭК химиотерапевтического и посредником рецидива заболевания, с глубоким клинические последствия². Были описаны различные маркеры для характеристики LSC как CD123³,⁴ХЛЛ-1, CD97⁵ или Тим-3⁶. CD34 + CD38-купе взрыва клеток считается обогащаться LSC⁷ , но также включает в себя обычный HSC. CD90 и CD45RA выражение применяется к CD34 + CD38-(P6) отсека (рис. 1) позволяет отделить несколько этапов нормальных и злокачественных кроветворных прекурсоров⁸. В частности, нормальный CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-СКК, Multipotent с прародителями (MPP) как CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-клеток и CD34 + CD38-CD90-CD45RA + клетки-предшественники Multipotent с лимфоидных загрунтовать (LMPP) может быть определена в большинстве ОМЛ случаях^{8 ,9}. Интенсивность средняя флуоресцирования (MFI) CD38 особенно важно рассматривать в отсеке CD34 + клеток. Потому что CD38 интенсивности определяет три новых клеточных компартментов их: CD38 отрицательной (P6), CD38 Дим (P7) и CD38 яркий (P8) (рис. 1). МФО CD38 может определяться с помощью hematogones и/или плазматические клетки как позитивный внутренний контроль как эти клетки решительно выразить CD38.

Иммунодефицитных NOD/SCID/IL2Rγc^{значение null} (ГЯП) мыши модель широко используется для приживления нормальных и злокачественных человека гемопоэтических клеток^10,11. Серийный ксенотрансплантации анализы используются для экспериментально проверить функцию LSC или HSC. Эти исследования были подробно проанализированы больших масштабах последовательности подходов. Тем не менее меньше известно о СОП и HSC иммунофенотип ПФТ взрыва населения прижившимися в ГЯП мышей, по сравнению с его основной AML (рис. 2).

Количество LSC низких таким образом, идентификация и количественная оценка LSC сложной и метод, описанный здесь могут использоваться как assay гранулярных потока на диагностике и клинической следовать для оценки реакции химиотерапии (как остаточная LSC может вызвать рецидив бод). Присутствие LSC может указывать положительное минимальной остаточной болезни (моб). На сегодняшний день, моб мониторинг в AML главным образом полагаться на молекулярные методы (т.е., RT-PCR, NGS)^10,12. Однако в этом протоколе мы обнаружить одновременных белков несколько маркеров HSC/LSC (CD34 CD38, CD45RA, CD90) на первичный взрыв клетки человека ОМЛ многопараметрических потока цитометрии^2,8,9. Эта комбинация антител может применяться в любой лаборатории цитометрии стандартного потока и этот assay MRD потока особенно интересно, когда моб в реальном времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) не представляется возможным, то есть, если лейкемии конкретные молекулярные маркеры не обнаруживаются в образце диагностических бод. Кроме того этот протокол, в дополнение к более чувствительным молекулярных методов моб, как он стремится выявлять и количественно клеток-аномальные гемопоэтических предшественников представляет характеристика функционального клеток (рис. 3).

Мы покажем, как определить три популяции гемопоэтических предшественников и предполагаемым LSC отсек с разной степенью созревания подачей cytometry с антителами, доступных в большинстве клинических лабораторий. Кроме того мы подтвердили наличие этих клеточных компартментов в соответствующий пациент производные ксенотрасплантатов (PDX) и на лечение.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Мы следуем Европейским стандартам для использования животных для научных целей. Это исследование был одобрен Комитетом по этике местных (№ 3097-2015120414583482v3).

1. Пробоподготовка

1. Соберите костного мозга (2 мл) от de novo ПФТ в пробирки, содержащие антикоагулянт Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в концентрации 1,8 мг / мл костного мозга.
2. Выполните Ficoll разделения, плотность градиента разделения изолировать мононуклеарных клеток от красных клеток и гранулоцитов, как следует. Разбавить костного мозга в 3 томах фосфатный буфер (PBS: NaCl 137 мм, KCl 2.7 мм, 10 мм Na₂HPO₄ , KH₂PO₄ 1,8 мм). Тщательно наложение 1 объем Ficoll с 1 объем разреженных костного мозга. Спина 30 минут на 300 x g без тормозов. Перевести белый Баффи слой mononucleated клеток в новую стерильную пробирку.
3. Вымыть клетки дважды в 10 мл PBS) и центрифуги на 300 g x 5 минут, чтобы удалить загрязняющие компоненты сыворотки.

2. Лизис эритроцитов (РБК)

1. Добавить 2 мл буфера lysis (аммония хлорид 0,8%) в ячейку Пелле, вихревой мягко и инкубации при комнатной температуре на 5 мин центрифуги на 300 g x 5 мин.
   Примечание: Если необходимо, повторите этот шаг.
2. Вымыть клетки в PBS как описано выше (1.3.).

3. пациент производные ксенотрасплантатов.

1. Получить взрыв клеток из костного мозга после разделения Ficoll и после истощения лимфоцитов с помощью иммуномагнитная негативный отбор (CD3 T-и CD20 для B-лимфоциты). Следуйте инструкциям производителя.
2. Inject 5 х 10⁶ ПФТ взрыва клетки в Вену хвост безусловный ГЯП мышей. Используйте удерживающего устройства для облегчения инъекции Вену хвост. Держите мышей в обычных условиях и особенно в условиях свободной от конкретного патогена на все времена, с помощью индивидуальных вентилируемых клетки и манипуляции под Ламинарный шкаф. Каждые две недели, принимать 60 мкл крови методом подчелюстной коллекции с использованием гематокрит капилляров. Место капилляров в 5 мл круглая труба внизу. Остановите кровотечение, применяя мягкое давление, используя небольшой стерильной марлевой. Исключать крови с чистой шприца.
3. Добавьте 1ml буфера lysis и инкубировать в течение 5 мин. Затем, центрифуги на 300 g x 5 мин мыть с PBS и centrifugre на 300 x g за 5 минут. Удалить супернатант, добавить 100 мкл PBS с 10% бычьим сывороточным альбумином (БСА) пятно с 3 мкл античеловеческие CD45 FITC и 1 мкл против мышиных CD45-APC и Инкубируйте на 4 ° C на 30 минут.
4. Пелле клеток в мыть два раза в PBS (2 мл) с 10% BSA и центрифуги на 300 x g за 5 мин.
5. Аликвота вплоть до 1 x 10⁶ клеток на 100 мкл PBS в цитометрии расходомерных трубок.
6. Обследования приживления каждые две недели химеризма анализ экспрессии CD45 (человека против мышиных) с помощью проточной цитометрии (рисунок 2A и B).
7. В жертву (периферийных взрыва всего более 70% или серьезных клинических признаков болезни), собирать мононуклеаров взрыва из измельченных селезенки и костного промывкой tibias и бедра с PBS как описано¹³. Усыпить мышей от шейки матки дислокации международных руководящих принципов.
8. Если ячейка Пелле содержит РБК, выполните Лизис эритроцитов с буфера lysis (шаг 2.1).
9. Пелле клетки мыть два раза в PBS (2 мл) с 10% BSA и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
10. Соберите клетки и аликвота 1 х 10⁶ клеток / 100 мкл PBS в цитометрии расходомерных трубок.

4. Окрашивание

1. Добавление конъюгированных антител (см. шаг 4.2) и вихря. Инкубируйте клетки на 15 минут в темноте при комнатной температуре.
2. Используйте следующее полотнище для человека первичной или PDX образцов, состоящий из 10 мкл анти CD36-FITC, 5 мкл анти CD19-ECD, 5 мкл анти CD33-PC5.5, 5 мкл анти CD90-APC, 5 мкл анти CD34-AA700, 5 мкл анти CD45RA-APC-H7, 5 мкл анти CD38-Тихоокеанского синего, 5 мкл анти CD123-PC7 и 2,5 мкл анти CD45-KO.
3. Удалите несвязанные антитела, мытья клетки в 2 мл PBS центрифугированием при 300 g x 5 мин.
4. Вновь приостановите клетки в 450 мкл PBS для анализа гранулярных окончательного потока.

5. стробирования стратегия для анализа потока цитометрии

1. Выполняйте сбор данных (по крайней мере 500 000 клеток) на проточный цитометр оснащены лазерами красный, синий и фиолетовый. Проверка параметров цитометр каждый день для 1) оптическое выравнивание, 2) аэрогидродинамических системы, 3) оптическая чувствительность и 4) стандартизации с помощью флуоросфер
2. Следуйте последовательный стробирования стратегии для определения CD38 выражения (рис. 1).
   1. Для определения hematogones или плазматические клетки, которые будут служить в качестве позитивного управления для выражения CD38 используйте клетки от нормального костного образцов.
      Примечание: этот ворот особенно важна для оценки как последующего предполагаемого LSC населения зависят от его определения.
   2. Определите физиологического прекурсоров (клетки нормального взрыв), CD45dim/SSC (сторона разброс) низкая демографических критериев (рис. 1A). В рамках этого взрыва населения, определить hematogones, который отображает CD38 ++ CD19 + фенотип (рис. 1B) и, наконец, использовать CD36 и CD33 выражение для определения миелобластов, monoblasts и erythroblasts (рис. 1 c). Определите выражение CD34 на hematogones, как показано на (рис. 1E). Оцените несколько субпопуляций прекурсоров внутри клетки взрыва, определяется как P6-P10 (рис. 1 d). Отдельный отсек CD34 взрыва клеток в P6, P7, P8 прародитель субпопуляций, основанные на заданных CD38 ворота. Убедитесь, что отсеке P8 содержит взрывов, которые имеют такой же интенсивностью CD38 как hematogones, что P6 включает в себя клетки, которые являются CD38-на базе CD38 флуоресценции минус один (FMO) управления и что P7 клетки между двумя крайностями: что касается CD38 выражение (рис. 1 d).
3. CD34 + 38-(P6) условным клетки, отдельные HSC от предполагаемого LSC, с помощью выражения CD90 и CD45RA (Рисунок 1F).
   Примечание: HSC фенотипа является CD34 + CD38-CD90 + CD45RA- и Multipotent с прародителями (MPP) определяются как CD34 + CD38-CD90 - CD45RA-. Предполагаемый LSC фенотипа является CD34 + CD38-CD90dimCD45RA + и более незрелых течению населения являются лимфоидных загрунтовать прародителями (LMPP) определяется как CD34 + CD38-CD90-CD45RA +.

6. моб, мониторинг, RT-PCR

1. Контролируйте уровни моб, RT-PCR как описано ранее,¹⁴.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Здесь мы представляем метод для определения прародитель населения в нормальных и злокачественных костного мозга человека образцов. Мы собрали костного мозга и селезенки с успешным PDX и выполняются многопараметрических проточной цитометрии, как описано выше. Мы сравнили несколько суб...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Точные и воспроизводимые оценку мембраны или цитоплазматических маркеров подачей cytometry требует, что инструмент настройки проверяются каждый день для оптических выравнивания, надлежащее функционирование аэрогидродинамических система, оптическая чувствительность и стандартизации с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pancoll	PAN-Biotech	P04-60500
RBC Lysis Buffer (10x)	Ozyme	BLE420301	RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O
NOD/SCID/IL2Rγcnull  (NSG)  mice	JACKSON LABORATORY	Stock No: 005557
PBS	Gibco by life technologies	14190-144
AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer	MACS Buffer Miltenybiotec	130-091-221
Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest)	Beckman Coulter	PN IM0766U
Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest)	Beckman Coulter	B36289
Anti-CD90-APC (clone 5E10)	Biolegend	328114
Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest)	Beckman Coulter	A07770
Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest)	Beckman Coulter	B92417
Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100)	Beckton Dickinson	560674
Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest)	Beckman Coulter	B92396
Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest)	Beckman Coulter	B36294
Anti-CD3-PE	Beckman Coulter	IM1451
Anti-CD20-PE	Beckman Coulter	A07747
Anti-CD123-PC7	Beckman Coulter	B13647
Flow-Set	Beckman Coulter	A63492
Flow-Check	Beckman Coulter	A63493
Navios	Beckman Coulter	DS-14644A
LSR Fortessa X20	BD Biosciences
CST BD	BD Biosciences	655051
FacsFlow	BD Biosciences	336911
Anti-hCD45-FITC	Biolegend	BLE304006
Anti-mCD45-APC	Biolegend	BLE103112
EasySep human PE selection kit	Stem Cell Technologies	18000
EasySep  magnet	Stem Cell Technologies	18551