Идентификации Спутниковое клеток скелетных мышц, иммунофлюоресценции с Pax7 и Ламинин антител

Резюме

Точное определение спутниковой клеток имеет существенно важное значение для изучения их функции в различных физиологических и патологических условиях. Эта статья представляет протокол для идентификации Спутниковое клетки на участках взрослых скелетных мышц путем на основе иммунофлюоресценции пятнать.

Аннотация

Иммунофлюоресценции является эффективным методом, который помогает определить различных типов клеток на разделах ткани. С целью изучения населения нужной ячейки, антитела для конкретной ячейки маркеры применяются на разделах ткани. В взрослых скелетных мышц Спутниковое клетки (SCs) являются стволовые клетки, которые способствуют ремонта мышц и регенерации. Таким образом важно визуализировать и отслеживать популяции Спутниковое клеток при различных физиологических условиях. В отдыхая скелетных мышц, СКС находятся между базальной пластинки и myofiber плазматической мембраны. Маркер обычно используется для выявления СКС на myofibers или в культуре клеток — парные поле белок Pax7. В этой статье оптимизированный протокол иммунофлюоресценции Pax7 на скелетных мышц секции представлены который минимизирует неспецифичный пятнать и фона. Другой антитела которое узнает белок (Ламинин) базальной пластинки была также добавлена, чтобы помочь определить SCs. аналогичные протоколы также может использоваться для выполнения двойной или тройной маркировки с Pax7 и антител для дополнительных протеинов интереса.

Введение

Скелетных мышц состоит из многоядерные мышечных клеток, называется myotubes, организованных в myofibers, которые генерируют силы и движения через сокращение. Наиболее скелетных мышц, за исключением некоторых черепно-лицевых мышц, являются производными от временного эмбриональных структура под названием Сомит¹. Клетки-предшественники миогенных расслаиваться из эпителиальных Сомит стать сомитов. Сомитов далее дифференцироваться в миоциты, что предохранитель стать myotubes в форме многосторонних ядерных myofibers. Описанный выше процесс называется ультраструктур и характеризуется височно регулируемой контроля экспрессии генов. Миогенных прекурсоров Экспресс, Pax3 и Pax7, тогда как сомитов Экспресс мёд и/или Myf5 и миоцитов Экспресс^2,myogenin и myosins³. Рост мышц — это процесс, в котором myofibers становится больше, путем включения более myonuclei в существующих волокна (гиперплазия) и увеличение мышечного волокна размер (гипертрофия)⁴. Во время роста мышц является устойчивым источником миогенных клетки, которые имеют свойства стволовых клеток в том, что они могут различать и самостоятельного обновления. Эти клетки называются Спутниковое ячейки, основанные на их физическое местоположение между сарколеммы (клеточной мембраны myofiber) и базальной пластинки⁵. СКС энергично способствовать росту мышц в ювенильной стадии (первые 2-3 недель послеродового мышей), но стать покоя в отдыха взрослых мышцы⁶. Удивительно, они могут быть повторно активирована в ответ на мышцы ранит и дифференцироваться в новых мышечных клеток для восстановления поврежденных мышц⁷.

Стволовых клеток свойства делают исследование СКС для биологии основные мышцы и терапии заболеваний мышц⁸. В результате он был области интенсивного расследования в течение последних десятилетий. Огромный прогресс был достигнут в рассекает генетики и эпигенетики СКС^9,10. Участвующих в изоляции и выявления СКС в situ методы были разработаны и оптимизированы вдоль пути¹¹. Immunofluorescent окрашивание позволяет идентифицировать СКС с помощью специфических антител, в том числе для Pax7. Однако нехватка и малый размер СКС, в сочетании с сильным auto флуоресценции взрослых скелетной мышечной ткани отображения визуализации сложных. Здесь мы описываем immunofluorescent окрашивание протокол оптимизирован для мыши мышечной ткани для Pax7 и на основе существующего метода для данио рерио мышцы¹². Кроме того Ламинин антитело обозначено с различных Флюорофор используется для идентификации базальной пластинки, под которой расположены ГКС. Этот протокол позволяет последовательно визуализации Pax7-позитивных СКС и миогенных прекурсоров всех протестированных физиологических условиях и стадии развития.

протокол

В этом протоколе мышц передней задних конечностей взрослых мышей (2-6 месяцев), передняя tibialis (TA) и разгибателей пальцев Лонг (EDL), были заняты в качестве примера для выполнения иммунофлюоресценции, окрашивания на их СКС. Все шаги обработки мышей и мышечной ткани вскрытия были одобрены животное уход и использование Комитета (ACUC) NIAMS/низ.

1. вскрыть TA/EDL мышцы от мыши задние конечности

1. Усыпить мышь в камере заполненные эвтаназии CO₂ под руководство ACUC низ. При необходимости выполните шейки матки дислокации.
2. Положите мыши лицом вверх на площадку диссекции (лежа). Спрей на ее живот кожи на 70% спирте. Вырезать 1-2 см, открытие горизонтально по центру кожи живота мыши, а затем deskin мыши, потянув за открытие к мыши футов. Разоблачить одной стороне мыши задних конечностей.
3. Используйте две острые щипцы: использовать один провести сухожилий, которые придают TA/EDL лодыжки и использовать другой сломать и сдвига фасции, охватывающих TA/EDL. После того, как снимают фасции, используйте острый кончик щипцы для отсоединения TA/EDL из берцовой кости, запустив отзыв под TA/EDL мышцы.
4. Отрезать сухожилия лодыжки с ножницами пока все еще держащ их пинцетом. Трим мышцы с ножницами вдоль продольной линии TA/EDL от лодыжки до колена во время подъема TA/EDL со стороны голеностопного сустава с щипцами. Вырежьте сухожилия колена стороне для отсоединения весь TA/EDL от голени.

2. крио встраивание TA/EDL мышцы

1. Подготовить ванну жидкого азота в контейнере, например., жидкий азот Дьюара. Залейте methylbutane в небольшой пластиковый стакан (около 20 мл) для наполовину. Затем поставьте стакан в ванну жидкого азота, чтобы заморозить. Через несколько минут Проверьте, что methylbutane является замороженным.
   Примечание: Жидкий азот могут быть заменены ведро сухого льда, но время замораживания медленнее.
2. Заложить расчлененных TA/EDL на плоской поверхности небольшой пластиковый шприц плунжерный. Полностью охватывают TA/EDL с несколькими каплями из оптимальных резки температуры (O.C.T.) соединение (замораживание среднего).
3. Возьмите стакан methylbutane из ванны жидкого азота и размораживать поверхности с теплым объекта (например., ручки ножниц). Быстро Дип O.C.T. покрыты TA/EDL на поршень в растопленный methylbutane оснастки-замораживания тканей.
4. Отсоединение встроенного ткани от поршень с щипцами и положил его в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Место трубку в жидкий азот, чтобы хранить его при обработке образцов.
   Примечание: Встроенный ткани могут храниться при температуре-80 ° C на длительный срок (2 года) или от-20 ° C на короткий срок (6 месяцев).

3. криостата секционирование

1. Добавьте каплю O.C.T. соединение на центре держателя образца криостата. Подождите, пока соединение O.C.T. почти затвердевает. Быстро придерживаться встроенного TA/EDL к O.C.T. комплексу, перпендикулярно с лодыжки стороной вниз и стороне колена вверх.
2. Смонтировать держатель образца на криостат, вырезать ткань интервалом 10 мкм и собирать крио разделы на Мороз покрытием слайды с о разделы 4-8 на одном слайде.
3. Сухие секций при комнатной температуре по крайней мере 3 h для ночевки.
   Примечание: Хотя сушки разделы в морозильную камеру на ночь или дольше является приемлемым, он будет неизбежно расти аутофлюоресценция. Для достижения наилучших результатов сухой разделы для 0,5 ч, затем приступить к фиксации и окрашивание шаги сразу.
4. Собирать слайды в коробке слайд и использовать их сразу же или хранить слайды в-80 ° C или от-20 ° C для последующего использования.

4. Подготовка реагентов для окрашивания иммунофлуоресценции

1. Подготовьте буферов:
   1. Приготовить 2 Л 1 x-фосфатный буфер (PBS) от 10 x PBS.
   2. Подготовить 40 мл параформальдегида 4% (PFA) в однократном ПБС от 16% PFA.
   3. Приготовить 2 Л PBST: 1 x PBS с 0.1% тритон-100.
   4. Подготовка 50 мл PBST-B: PBST с 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА).
   5. Подготовка 10 мл PBST-B-G: PBST с 2% BSA и 5% нормальной козьего сыворотки.
   6. Готовим 1 мл раствора блокировки. Разбавить AffiniPure Fab фрагмента коза анти мыши IgG (H + L) (1:10) в PBST-B.
   7. Подготовка 200 мл буфера цитрата 1 x.
      Примечание: Объемы выше решений являются достаточными для по крайней мере 5 слайдов. Тома должен быть скорректирован согласно количество слайдов и размер контейнеров слайдов.
2. Подготовка антител пятен:
   1. Первичного антитела (рабочие концентрации): подготовить 1,2 мл смеси основного антитела путем разбавления антитела моноклональные мыши Pax7 (IgG1) (1-5 мкг/мл) + Ламинин кролика polyclonal антитела (0,5-2 мкг/мл) + MF20 мыши моноклональные антитела (_bIgG2) (0,5-2,5 мкг / Мл) в PBST-B-G.
      Примечание: MF20 мыши моноклональные антитела (IgG2_b) является необязательным.
   2. Вторичные антитела (рабочие концентрации): подготовить 1,2 мл смеси вторичного антитела путем разбавления коза анти мыши IgG1 кросс адсорбированные вторичное антитело, Alexa Fluor 488 (0,5-2 мкг/мл) + коза анти кролик IgG (H + L) весьма кросс адсорбированные вторичного антитела, Alexa Fluor плюс 555 (0,5-2 мкг/мл) + коза анти мыши IgG2_b кросс адсорбированные вторичное антитело, Alexa Fluor 647 (0,5-2 мкг/мл) в PBST-B-G.
      Примечание: Alexa Fluor 647 является необязательным.

5. иммунофлюоресценции пятнать шаги

1. Увлажняет и исправить крио секции с PFA.
   1. Удалите несколько слайдов TA/EDL крио раздел из окна слайд. Теплый слайды в слайд Холдинг лоток при комнатной температуре.
   2. Использование жидкого блокатор пера (PAP пен) рисовать области, которая включает в себя все крио секции на слайде. Этот круг будет препятствовать решения течет со слайда.
   3. Взять лоток для Зонта лаборатории. 300-500 мкл 4% PFA на слайд в области кружил исправить разделы при комнатной температуре на 10 мин промывают PFA с ПБС по крайней мере 3 x 5 мин в контейнере слайда.
      Предупреждение: PFA-токсичных и опасных отходов; Он должен быть действует с осторожностью и утилизировать в контейнер опасных отходов.
2. Антиген поиска
   1. Заполните еще один слайд контейнер с 200 мл буфера цитрата.
   2. Перенести слайды в контейнер. Переноса контейнера с слайды в скороварке готовить слайды в режиме высокого давления 10 мин.
   3. Охладить в контейнер с слив воды за 10 мин передачи все слайды в новый контейнер с PBST (200 мл), промойте слайды с PBST для по крайней мере 3 x 5 мин.
3. Блокировка
   1. Добавьте пропитанной водой kimwipes лоток держа слайды для создания влажной среде, чтобы избежать высыхания слайды.
   2. Переместить слайды обратно в лоток и 200 мкл преграждая разрешение на каждый слайд. Обложка лоток с крышкой и пусть блокирование развиваться за 30 мин.
      Примечание: Pax7 антитела является моноклонального антитела мыши, так что неспецифические привязку мыши IgG в мыши мышечных тканей, что создает высокий фон. С помощью AffiniPure Fab фрагмента коза анти мыши IgG (H + L) блокирует мышь на неспецифические привязки.
4. Применение основного антитела.
   1. Промойте слайды с PBST один раз в контейнере слайда. Затем переместите слайды обратно окрашивание лоток.
   2. Применить 200 мкл, комплекса основное антитело на каждом слайде, покрытия лоток с крышкой и пусть реакции развивать при комнатной температуре в течение 1 ч или при 4 ° C для ночлега.
      Примечание: Ночь реакции на 4 ° C дает лучший результат, хотя развитие реакции при комнатной температуре дает удовлетворительные результаты. Миозин MF20 антитела могут быть добавлены в смеси для выполнения маркировки тройной (Pax7, Ламинин, MF20). MF20 пятна дифференцированных мышечных волокон. Этот шаг также служит в качестве блокировки шаг с PBST-B-G для уменьшения потенциальных неспецифических привязки от вторичные антитела (антитела козочки) в следующем шаге.
5. Примените вторичные антитела.
   1. Промывают первичного антитела с PBST при комнатной температуре по крайней мере 3 x 5 мин.
   2. 200 мкл вторичное антитело смеси на каждый слайд и позволяют реакции развивать при комнатной температуре по крайней мере 1 час.
      Примечание: Для Pax7 + Ламинин, используйте коза анти мыши IgG1 Alexa 488 и коза анти кролик Alexa 555.
      Для Pax7 + Ламинин + MF20 добавьте козье анти мыши IgG2_b Alexa 647 в смеси.
   3. Промывают вторичные антитела с PBST по крайней мере 3 x 5 мин.
6. Борьбе с пятно DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) и монтаж
   1. Разбавьте DAPI (1:20, 000) в PBST в контейнере слайда, например, 10 мкл DAPI в 200 мл PBST.
   2. Пятно слайды в контейнере DAPI за 3 мин.
   3. Промойте DAPI с PBST для по крайней мере 5 x 5 мин.
   4. Смонтируйте слайды с монтажа средних. Обложка слайды с coverslips.
      Предупреждение: DAPI токсичных и опасных; Он должен быть обработаны с осторожностью и утилизировать в бутылке опасных отходов.

6. Люминесцентная микроскопия

Примечание: Immunofluorescent окрашивание протокол, о которых сообщалось выше позволит СКС визуализации с микроскопом флуоресцентные или конфокальный-поля. Это может быть изначально сложно определить СКС. Вот несколько рекомендуемых шагов, которые могут помочь.

1. Используйте DAPI канала и низкий масштаб задач для визуализации в разделах на слайдах.
2. Переключите масштаб от низкого до высокого. Соблюдать SCs, по крайней мере 20 X цель не требуется).
3. Используйте двойной фильтр куб для 488 (FITC) / 555 (родамин) соблюдать Pax7 и Ламинин сигналов в то же время для определения СКС. Под этот параметр, сигнал Pax7 окрашивания имеет лучшую контрастность фоновый шум.
4. Быстро альтернативный канал из FITC DAPI правильно идентифицировать СКС. Все СКС должна быть Pax7/DAPI-положительный.

Результаты

После выше шагов СКС успешно могут быть визуализированы в взрослого отдыха мышц разделах под микроскопом флуоресцентные (рис. 1). Хотя взрослых мышечной ткани имеет сильные auto флуоресценции в определенный тип волокон, яркие краски серии Alexa может преод?...

Обсуждение

Вышеупомянутый Протокол основан на методе Pax7/MF20 окрашивания данио рерио скелетных мышц¹². Решения используется и преграждать шаги являются идентичными или однородными. Антитела, которые используются идентичны. Скорректированные шаги были основаны на функции мыши мышечно...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
methylbutane	Sigma-Aldrich	M32631
Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound	Electron Microscopy Sciences	62550-01
10x PBS	Gibco, Themo Fisher	70011-044
16% PFA	TED PELLA	50-00-0
Triton-100	Sigma-Aldrich	T8787
Normal Goat Serum	Thermo Fisher	0 1-6201
AffiniPure Fab Fragment Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	115-007-003
20x Citrate Buffer	Thermo Fisher	00 500
Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant)	Developmental Study Hybridoma Bank	N/A
Laminin polyclonal rabbit antibody	Sigma-Aldrich	L9393
MF20 mono-clonal mouse antibody (IgG2b) (supernatant)	Developmental Study Hybridoma Bank	N/A
Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-21121
Goat anti-Mouse IgG2b cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 647	Thermo Fisher	A-21242
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher	A32732
Leica CM1860 cryostat
Leica DM6000 wide-field fluorescent microscope
Leica DMR wide-field fluorescent microscope
Zeiss LSM510 confocal microscope
Zeiss LSM780 confocal microscope
Cuisinart electronic pressure cooker