Подготовка, очистки и использования липосомы, содержащие жирные кислоты

Резюме

Липосомы, содержащие одно цепь amphiphiles, особенно жирных кислот, проявляют различные свойства, по сравнению с тех содержащие diacylphospholipids из-за уникальных химических свойств единой цепи amphiphiles. Здесь мы описываем методы для приготовления, очистки и использования липосом, состоит в части или всех этих amphiphiles.

Аннотация

Липосомы, содержащие одно цепь amphiphiles, особенно жирных кислот, проявляют различные свойства, по сравнению с теми содержащие diacylphospholipids из-за уникальных химических свойств этих amphiphiles. В частности жирные кислоты липосомы повысить динамический характер, из-за относительно высокой растворимости сингл цепи amphiphiles. Аналогичным образом липосомы, содержащие свободные жирные кислоты более чувствительны к соли и двухвалентной катионов, из-за сильных взаимодействий между карбоновые кислоты головы групп и ионов металлов. Здесь мы показываем техники для приготовления, очистки и использования липосом, состоит в части или всего amphiphiles единой цепи (например, олеиновой кислоты).

Введение

Липосомы, или пузырьки – отсеков, окруженная бислоя мембраны состоит из липидов амфифильных - нашли применение в многочисленных биомедицинских приложений как средства доставки лекарственных препаратов, модели клеточных мембран и для разработки синтетических клетки. Мы и другие использовали липосомы как модели примитивных клеточных мембран в начале жизни. ^{1 , 2 , 3 , 4} как правило, в таких системах, мы используем сингл цепь amphiphiles, содержащие только один липидов хвост углеводородов (например, олеиновая кислота), как эти молекулы проще синтезировать без использования закодированных белка ферментов, которые используют современные клетки.

Липосомы, состоит из одного цепь липиды, аналогичны образуются из diacylphospholipids (например, 1-Олигопептид-2-диацилглицерол -sn- glycero-3-фосфохолин, или POPC) в том, что граница состоит из бислоя мембран. Липосомы формируются из любого класса липидов можно сохранить растворенных полезной нагрузки и могут быть уменьшены и очищается от различных методов. Несколько важных отличий в результате уникальных химических характеристик сингл цепь липидов. Везикулы, образованный фосфолипиды являются стабильными над широким рН, в то время как жирные кислоты везикулы стабильны только на нейтральной мягко основных рН (ОК. 7-9), которая требует определенных буфер рН для приготовления, пузырек. Большую часть времени, этот буфер может также содержать конкретные растворимых молекул для инкапсуляции везикул, который может быть либо функциональных материалов (например, РНК) для разобщенным биохимических реакций или простой Краски люминесцентные, флуоресцентные (например, Флуорексон ) для характеризации везикул.

Наличие только одного углеводородной цепи производит мембраны, которая как более проницаемыми для растворов, а также более динамичным. Кроме того карбоновые кислоты головы Группа присутствует в результатах жирных кислот в пузырьки, которые более чувствительны к присутствию соли и двухвалентной катионы (например, мг^{2 +}). Магний является одним из наиболее важных двухвалентной катионы для катализатора биохимических реакций в protocells для исследования происхождения жизни. В начале жизни, до эволюция сложных белков-ферменты РНК может были доминирующей полимер, из-за своей двойной возможности размножаться и выполнять катализа. Один представитель пример магния требуя РНК связанных что реакция неферментативного РНК копирование, впервые продемонстрирована в 1960-х годов. ⁵ когда химически активации РНК нуклеотидов (т.е. 2-methylimidazolide нуклеотидов) привязки к ранее существовавшие комплекс грунт шаблон, 3'-гидроксильной группы праймера нападения 5'-фосфат прилегающих активированные мономера сместить оставляя группы (т.е. 2-метил) и формы новый Фосфодиэфирная связь. Эта РНК копирование химии требует высокой концентрации мг,^{2 +}, которая должна быть хелатные для того, чтобы быть совместимым с жирной кислоты protocells. ⁶ другой мг^{2 +}-зависит от реакции является то, что катализируемой молот рибозима, которая является, пожалуй, наиболее характерны каталитического РНК. Этот рибозима, который может быть преобразован из двух коротких олигонуклеотиды, выполняет self расщепление реакции, что удобно контролировать смену гель. Таким образом он часто используется как модель рибозима в исследования происхождения жизни. ⁷ из-за требование этой рибозима для unliganded магния, липосомы обычно построены смесь жирных кислот и глицерина эфиры жирных кислот, которые являются более устойчивыми к магния. ^{8 , 9} в настоящем Протоколе, мы представляем методов мы разработали для подготовки, манипуляции, характеристика этих пузырьков и продемонстрировать применение этих пузырьков как protocells для пребывания неферментативного РНК копирование и молот рибозима катализ.

протокол

1. везикул подготовка

1. Подготовка тонких пленок
   1. Использование газа туго шприцы для передачи определенное количество липидов, как описано в таблице 1.1 хлороформ в стеклянный флакон.
   2. Испарится полученный раствор под струей азота или аргона в зонта.
   3. Результате тонкопленочных подвергайте дом вакуума по крайней мере 2 h удалить остатки хлороформ. Липидов можно оставить под вакуумом на ночь на данный момент.
2. Регидратации пузырьки
   1. Подготовка 10 мл 5 мм Флуорексон 250 мм трис HCl рН 8,0 гидратации буфера, растворяя 31 мг порошка Флуорексон в 2,5 мл буфера рН 8,0 трис HCl 1 M и добавив еще один 7,5 мл деонизированной воды (DI).
   2. Пипетка 250 мкл выше гидратации буфера в пустую пробирку и мкл 1,875 10 M NaOH для окончательного 75-мм базы (½ эквивалент всего жирных кислот). Решение передать тонкопленочных сухой липидов в виде пузырьков с общей липидные концентрации 0,15 М.
   3. Использование высокоскоростных (> 3000 об/мин) Вортекс для вихря получившаяся смесь для 4-5 сек.
   4. Оставьте смесь липидов буфер на низкой скорости (ОК. 30 об/мин.) вращающейся шейкер увлажняет, по крайней мере на ночь.
3. Размеры пузырьков (опционально)
   1. С помощью пинцета, применять один фильтр поддержки для каждой внутренней поверхности шприца портов экструдера.
   2. Мокрые поддержка каждого фильтра с 250 мм трис-HCl, рН 8.
   3. С помощью пинцета, применить один трек травленная 100 Нм поликарбоната мембраны к одному из экструдера O-кольца и фильтр поддерживает. Заботясь, чтобы не сорвать или прокола мембраны, аккуратно вставьте уплотнительное кольцо таким образом, чтобы сделать хороший контакт между двумя поверхностями мембраны.
   4. Соберите экструдера, стараясь не вытесняют мембраны и фильтр поддерживает.
   5. Заполните шприц экструдера с ОК. 0,5 мл трис 250 мм-HCl, рН 8. Вставьте этот шприц в одну сторону экструдера.
   6. Вставьте пустой шприц в другой стороне экструдера.
   7. Вручную толкать поршень шприца, содержащий буфер медленно (≤ 50 мкл/s) и убедитесь, что ощущается сопротивление, о том, что трек травленная мембраны находится на месте и нетронутыми. Это полезно практиковать этот шаг без мембраны в место для того, чтобы оценить ожидаемый уровень сопротивления.
   8. Снимите и удалите два шприцы. Это не нужно очистить два шприцы на данном этапе, так как они содержат буфер одинакового состава для подготовки липосом.
   9. Загрузите липосом подготовки в один из двух шприцы.
   10. Соберите экструдера с шприц, содержащий образец везикул на левой стороне и пустой шприц на правой стороне.
   11. Вручную толкать поршень шприца, содержащий образец везикул очень медленно (10-25 мкл/s).
   12. Тщательно соблюдайте шприц на правой стороне экструдера; ясно, буфер будет первоначально ввести в правой части экструдера (ОК. 50 мкл, это объясняется внутренний объем экструдера), следуют небольшой шлейф экструдированные липосом. Немедленно остановить, нажав на данный момент, удалите шприц на правой стороне экструдера и отменить это решение.
   13. Заменить шприц на правой стороне экструдера и выдавить до левой шприц пуст.
   14. Изменить ориентацию экструдера и повторите шаг 13. Продолжить для требуемого числа циклов (обычно 7, 9 или 11); нечетное число всегда используется для обеспечения ООН экструдированные липосомы не собираются от первоначально содержащей предварительное сокращение липосом подготовки шприц.
   15. Аккуратно распределить содержимое правой шприца в трубу Eppendorf и поместить трубку на низкой скорости (ОК. 30 об/мин.) вращающейся шейкер для около 0,5 ч.
   16. Продолжите с очисткой везикул, как описано в разделе 2. Экструдированные везикулы следует использовать в течение 24 ч или повторно экструдированный перед следующий использования времени.

2. везикул очистки

1. Подготовка везикул очищение мобильные
   1. Подготовьте 5 мл, 250 мм трис HCl рН 8 гидратации буфера, добавив 1,25 мл 1 М трис HCl рН 8 буфера, 3,75 мл воды ди по 15 мл трубки сокола. Затем добавьте 37,5 мкл 10 M NaOH (½ эквивалент базы относительно неэстерифицированных жирных кислот) буфер гидратации. Пипетка 235 мкл чистой олеиновой кислоты непосредственно в трубу Falcon результате везикул решение с 0,15 М всего липидов.
   2. Использование высокоскоростных (> 3000 об/мин) Вортекс для вихря смесь для 4-5 сек, затем падение на низкой скорости вращения шейкер для по крайней мере 2 ч. Подготовка липидов может остаться на ночь на вращающейся шейкер на данный момент. Фильтр мобильных фазы через 0,22 мкм шприц фильтр перед использованием, чтобы удалить любые потенциальные агрегатов.
2. Очистка везикулы на Sepharose
   1. Удаление ca. 5 мл спиртового раствора 4B Sepharose из бутылки с помощью пипетки. Применяется к столбцу хроматографии одноразовые 10 мл.
   2. Позволяют потока через этанола и навозной поселиться до этанола приближается к верхней части ионита.
   3. Применить 5 мл обессоленной воды в верхней части смолы и пусть потока через чтобы смыть остатки этанола.
   4. Применить 250 мм трис-HCl, рН 8 в части 1-2 мл в верхней части смолы, применяя новую порцию каждый раз, когда уровень жидкости приближается к верхней части ионита. Повторите эти действия для 3 - 5 раз.
   5. Зажим столбце на стенде реторты, а затем подключите кончик столбца с разъемом кран и трубы в коллектор фракций. Добавьте другую часть буфера для очистки труб, закрыть кран, когда уровень жидкости в колонке приближается к верхней части смолы.
   6. Применить экструдированный везикулы из раздела 1 в верхней части смолы с помощью дозаторов 200 мкл, заботясь, чтобы применять препарат пузырьков как можно равномернее смолы, не касаясь стены кровать или столбец смолы.
   7. Откройте запорный начать поток и начать сбор фракций в 96-луночных плиту. Применить везикул очистки мобильных фазы в верхней части ионита в 0,5-1 мл части как буфер истощает, заботясь, чтобы не позволить ионита высохнуть. Собирают в пяти падение фракций, собирая по крайней мере 36 скважин (три строки 96-луночных плиты).
3. Характеристика флуоресценции очистки фракций
   1. Возьмите 96-луночных плиты из предыдущего раздела и прочитать его на тарелку читатель (λ_ex= 485 Нм, λ_ет= 515 нм).
   2. Участок результирующие данные флуоресценции как флуоресценции против номер дроби. Везикулы элюировать во-первых, следуют том дроби (рис. 1).
4. Repurification пузырьки для мониторинга утечки везикул
   1. Повторите шаги очистки и характеристика в разделах 2.2 и 2.3. Пузырьки, которые сохранили их содержимое будет экспонат не пик том растворимое (или один очень маленький ОК. 5-10% от интенсивности везикул пик).

3. Использование везикулы присутствии магния

1. Использование unliganded магния
   1. Подготовить и очистить везикулы, как описано в разделах 1, 2.1 и 2.2.
   2. Подготовка 1 мл 50 мм MgCl₂ решения в 250 мм трис HCl рН 8,0 буфера путем добавления 250 мкл буфера рН 8,0 трис HCl 1 M и 50 мкл MgCl 1 М₂ 700 мкл ди воды. Вихрь хорошо перемешайте.
   3. Чтобы придать желаемый магния концентрации 5 мм, смешать 0,9 мл очищенной везикулы и 100 мкл раствора магния и перемешать быстро свести к минимуму нарушения везикул воздействием переходных пузырьков высокой местные концентрации магния.
      Примечание: Быстрое смешивание раствора магния имеет решающее значение для стабильности везикул. Если магния и везикулы не смешиваются быстро немедленного vortexing, некоторые пузырьки будут подвергаться более высокие концентрации магния, что приводит к непоследовательным результатам от образец.
   4. Оставьте везикул образца на стакан для по крайней мере 30 минут до repurification, как описано в 2.4 для проверки утечки содержимого. Добавьте такой же концентрации магния как везикул образца к этапу мобильных repurification.
2. Использование liganded магния
   1. Подготовить и очистить везикулы, как описано в разделах 1, 2.1 и 2.2.
      Примечание: Используйте ½ эквивалент Кох вместо NaOH до deprotonate жирных кислот; было установлено, что это производит более стабильной липосомы в хелатной MgCl₂ систем.
   2. Готовят раствор цитрат калия 2M и скорректировать рН 8,0 с Кох.
   3. Премикс MgCl₂ и калия цитрат в указанный коэффициент (ОК. 1:4 для стабильной олеиновой кислоты везикулы) в буфер рН 8,0 трис HCl 250 мм.
   4. Добавление готовые магния цитрата везикул, кратко вихря.
      Примечание: Всегда премикс магния и лигандом решение. Никогда не подвергайте везикулы unchelated магния решение самостоятельно.
   5. Оставьте везикул образца на стакан для по крайней мере 30 минут до repurification, как описано в 2.4. Добавьте такой же концентрации магния и цитрат как в образце везикул этапа мобильных repurification.

4. неферментативного РНК, копирование в пузырьки

1. Подготовка монодисперсных РНК инкапсулированные пузырьки
   1. Подготовьте фильм сухой олеиновой кислоты, как описано в разделе 1.1.
   2. Подготовьте везикул регидратации буфер с 50 мкм флуоресцентные помечены РНК-праймер, 150 мкм РНК шаблон и 250 мм трис HCl pH 8.0 содержащие ½ эквивалент Кох относительно олеиновой кислоты.
   3. 250 мкл буфера регидратации к фильму липидов и следуйте шаг 1.2.2 и 1.2.3 сделать пузырьков с общей концентрации липидов 0,15 М.
   4. Для того, чтобы сделать небольшие однослойных везикул монодисперсных, следуйте раздел 1.3 для экструзии везикул.
2. Цитрат магния дополнение и везикул очистки
   1. Премикс запасов магния и цитрат и затем смешивать это с образцом везикул для окончательного липидные концентрации 0,1 М.
   2. Очищайте везикулы Sepharose 4B размер исключения столбца, с 250 мм трис HCl pH 8.0, 0,1 М липидов и магния и цитрат как подвижная фаза.
   3. Собирайте пузырьки фракций в следующем разделе 2.3.
3. Грунтовка расширения реакции
   1. Подготовьте раствор 2-MeImpG (гуанозина 5'-монофосфат 2-methylimidazolide) 200 мм с 250 мм трис HCl pH 8.0. (Примечание: следовать ранее опубликован протокол¹⁰ для синтеза 2-MeImpG.)
   2. Инициировать грунтовка расширения реакции, передавать 450 мкл пример везикул до конечной концентрации липидов 75 мм и 50 мм активация мономером 150 мкл 2-MeImpG раствор. Запуск таймера и держать реакции образец упасть все время.
   3. (Необязательно) Для непрерывного свежие мономера кормления, передачи 300 мкл раствора реакции в одной палате диализатор лаборатории построен в малообъемной липосом¹¹ и положил 300 мкл подачей раствора в другой камере. Кормления решение должно содержать все ингредиенты на такой же концентрации как реакция решение, за исключением замены РНК, содержащие везикулы с пустыми везикулы. Каждый раунд диализа занимает 1-24 ч, в зависимости от аналита и мембраны используется.
   4. Кинетические исследования взять 100 мкл аликвота в каждый момент времени и repurify Алиготе через Sepharose 4B размер исключения колонку с 250 мм трис HCl pH 8.0 как подвижная фаза.
   5. Соберите везикул фракций в 1,5 мл Эппендорф.
   6. Пипетка Тритон везикул дроби к окончательному около 0,1% v/v.
   7. Добавить 0,5 мл холодного этанола в трубку и инкубировать в-20 ° C в течение не менее 2 ч.
   8. Центрифугуйте образцы на 16,1 × 1000 РПРС (16.1 × г) за 10 мин и аккуратно пипетку из жидкости. Мыть, РНК гранулы с холодной на 70% спирте и центрифуги снова на 5 мин отменить жидкости и положил трубку с РНК окатышей на блок 80 ° C тепла для 2 мин испаряться остаточного этанола. Растворяют гранулы в 50 мкл 8 М мочевины с 1xTBE загрузки буфера.
4. Анализ страницы
   1. Подготовка 20% гель страницы путем смешивания 200 мл UreaGel системы концентрат, 25 мл разбавителя, системы UreaGel 25 мл 10xTBE буфера, 80 мкл TEMED и 250 мг Персульфат аммония. Быстро залить смесь гель между пластинами зажимается гель (35 × 45 см) и вставьте гребень. Подождите, по крайней мере 30 минут до полной полимеризации.
   2. Соберите пластину на стенде гель гель и заполнить ящики гель с 1xTBE гель работает буфер. Возьмите расческу и Промыть лунки шприц. Предварительно запустите гель с 60 Вт для 30 мин.
   3. Тепла образцы на 80 ° C тепла блоке на 2 мин и загрузить 5 мкл каждого образца в колодец.
   4. Включите блок питания гель и гель работает с постоянным Вт 60 Вт для 2,5 ч.
   5. Разберите пластину гель гель стенда, протрите стекло и положить целую тарелку в гель сканера, чтобы начать сканирование геля.
   6. Количественно гель с ImageQuant TL 1D анализ. Участок натуральный логарифм коэффициента количество грунтовки, оставаясь на данный момент первоначальное количество грунтовки против времени, подходят к линии и вычислить скорость реакции псевдо-первого порядка (рис. 2).

5. молот расщепления Self РНК в пузырьки

1. Подготовка и очистка рибозима, инкапсулированные в пузырьки
   1. Подготовить липидов тонкой пленки (OA: ГМО = 9:1) в разделе 1.1 с компонентами как в Таблица 1.2. Примечание: теплый ГИО по крайней мере 60 ° c для полного плавления перед использованием.
   2. Подготовьте везикул регидратации буфер с 5 мкм каждой стренги рибозима молот и 250 мм трис HCl рН 8.0.
   3. 250 мкл буфера регидратации к фильму липидов и выполните шаги 1.2.2 и 1.2.3 сделать пузырьков с 0,15 М общей концентрации липидов.
   4. Для того, чтобы сделать небольшие однослойных везикул монодисперсных, следуйте раздел 1.3 для экструзии везикул.
   5. Очищайте везикулы Sepharose 4B размер исключения столбца, с 250 мм трис HCl рН 8,0, 0,15 М смешанные липиды как подвижная фаза.
2. Молот рибозима self расщепление реакция
   1. Готовят раствор магния и смешать с очищенной везикулы, как описано в разделе 3.1 инициировать self расщепление реакции.
   2. Кинетических исследований взять 100 мкл смеси в каждый момент времени и непосредственно repurify этот Алиготе через Sepharose 4B размер исключения колонку с 250 мм трис HCl pH 8.0 как подвижная фаза. Соберите везикул дроби.
3. Анализ страницы
   1. Выполните шаги 4.3.6 для 4.3.8 подготовить РНК загрузки образца.
   2. Место коммерчески литая гель 15% КЭ-мочевины в гель коробку и заполнить поле гель с 1xTBE гель работает буфер.
   3. Тепла образцы на 80 ° C тепла блока за 1 мин и загрузить 5 мкл каждого образца в колодец.
   4. Побегите гель с постоянным 200 V около 1 ч.
   5. Сканировать геля.
   6. Количественную оценку гель с помощью анализа программного обеспечения, как TL ImageQuant 1D, чтобы измерить степень расщепления путем сравнения интенсивности оставшихся субстрата группа РНК и рассеченного РНК фрагмент группа (рис. 3).

6. Гигантские жирных кислот пузырьки для микроскопии

1. Подготовка везикулы гигантских жирных кислот
   1. Следите за раздел 1.1 и Таблица 1.3 подготовить олеиновой кислоты тонкой пленки с 0,2 моль % дневно обозначенные липидов для лучшего наблюдения мембраны.
   2. Увлажняет липидной пленки с 500 мкл 250 мм трис HCl рН 8,0 сделать липиды 10 мм образца везикул в общей сложности. Буфер может содержать флуоресцентных красителей или молекулы РНК, при желании. Оставьте, везикул образца упасть на ночь.
   3. Подготовка 150 мл чистого жирных кислот диализа буфера с 10 мм общих липидов, смешивая 470 мкл олеиновой кислоты и 150 мл, 250 мм трис HCl рН 8.0 содержащие ½ эквивалентные NaOH.
   4. Выдавливание везикул образца через 10 мкм поликарбоната мембраны для удаления крупных агрегатов.
   5. Передача везикул образца в 1 мкм большие поры диализа кассеты, как описано ранее. ¹²
   6. Место кассеты диализа в 100-мл стакан, содержащие 30 мл диализа буфера. Агитируйте стакан осторожно на столешнице шейкер на 80-100 об/мин.
   7. Измените диализа буфера каждые 30 мин в 5 раз удалить бесплатно красители или РНК и небольшие пузырьки.
   8. Тщательно удалите образец везикул из кассеты диализа с шприц и передачи для трубки Эппендорф.
2. Микроскопия наблюдения
   1. Пипетка 10 мкл везикулы на чистой стандартных микроскопа и поместите стекла Крышка выскальзования образца. Уплотнение крышки стекла с прозрачным лаком.
   2. Отмечать везикулы с 60 X нефти дисперсии или аналогичные цели, конфокальная микроскопия, используя соответствующий лазерный источник для дневно меченых мембраны, РНК или инкапсулированные краситель (рис. 4).

Результаты

Мы обычно выполняют липосом очищения на размер исключение столбцов. Типичный липосом препараты содержат Флюорофор какой-то. Когда липосомы генерируются и экструдированные, вид должен быть инкапсулирован присутствуют как внутри, так и за пределами липосомы. Очищая липосомы на размер исключение смолы (Sepharose 4B), том растворенных веществ сохраняются в поры смолы, а больше липосомы не элюировать первой (рис. 1A). Сбор фракций и заговоре флуоресценции против номер дроби (рис. 1B) обычно урожаи след двух пик, с раннего элюирующие фракций, соответствующий липосомы, которые затем собираются и используются в последующих приложений.

Мы часто изучить nonenzymatic грунтовка расширения реакции, которые были вероятно средства репликации РНК до появления рибозима и на основе белок РНК-полимеразы. Эти реакции обычно используют дневно обозначенные праймер (рисунок 2A), который продлевается на активированные мономеров. Эти реакции могут контролироваться электрофорезом геля (рис. 2B), и полученный electropherograms интегрированы для получения константы скорости для состояния данной реакции (рис. 2 c).

Чтобы продемонстрировать, что РНК может функционировать внутри protocells, мы используем молот рибозима self расщепления (Рисунок 3А) как модель РНК каталитической реакции. Эта реакция требует свободного мг^{2 +} для облегчения катализа, и поэтому мы использовали OA/ГИО везикулы, поскольку они являются стабильными в присутствии 5 мм Mg^{2 +}. Подобно грунтовка расширения реакции, молот рибозима self расщепление реакции также может быть мониторинг электрофорезом геля (рис. 3B) и впоследствии проанализированы приобрести константа скорости при определенных условиях (рис. 3 c).

Мы изображения липосомы, используя оба флуоресценции и переданы свет. Липосомы могут быть помечены с помощью флуоресцентных липиды, которые дают метку мембраны (рис. 4A), или флуоресцентные растворимое в пределах их просвет (рис. 4В). Пропускаемого света может также использоваться для наблюдать везикулы (также показан на рис. 4B).

Таблица 1.1 чистый олеиновая кислота в хлороформе
Компонент		Фондовая	Сумма
Олеиновая кислота		> 99%	11.7 МКЛ
Хлороформ			1 мл
Таблица 1.2 олеиновой кислоты и глицерол моноолеат (9:1) в хлороформе
Компонент		Фондовая	Сумма
Олеиновая кислота		> 99%	10.5 МКЛ
Глицерин моноолеат		> 99%	1.4 МКЛ
Хлороформ			1 мл
Таблица 1.3 олеиновой кислоты с 0.2mol% родамин-PE в хлороформе
Компонент		Фондовая	Сумма
Олеиновая кислота		> 99%	1,6 МКЛ
Родамин-PE в хлороформе		10 мм	20 МКЛ
Хлороформ			1 мл

Таблица 1. Жирные кислоты хлороформ решения.

Рисунок 1. Везикул очищения и флуоресценции характеристика очистки фракции. A. разделение везикулы, содержащие Флуорексон от свободного Флуорексон по столбцу 4B Sepharose. Б. везикул и обнаружения пик бесплатно Флуорексон путем построения флуоресценции в каждой скважине против хорошо номер после часть коллекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Non ферментативный репликация РНК внутри везикул О.А. A. схема неферментативного выдвижение праймера РНК. B. изображение страницы грунт расширения реакции внутри чистой олеиновой кислоты везикулы, с условиями как в разделе 4. C. линейной подходят натурального логарифма соотношения количества грунт оставшиеся на данный момент на первоначальный количество грунтовки против времени свыше 30 ч. скорость реакции, рассчитывается от склона ln (₀P/P) против времени, -0,058 h^-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Молот расщепления рибозима в ОА/ГИО везикулы. A. схема молот расщепления рибозима стренги дневно обозначенные субстрата (вверху). Изображение страницы в б. молот расщепления рибозима внутри везикул OA/ГИО с 5 мм Mg^{2 +}. C. активность рибозима внутри пузырьков. Линейной аппроксимации натурального логарифма соотношения количества субстрата, оставаясь на данный момент времени для первоначального количества субстрата против время в первые 4 ч. реакция, рассчитывается от склона ln (0/л) против времени, составляет 0.36 h^-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Везикулы гигантские жирных кислот для микроскопии. A. конфокальная микроскопия изображения PE родамин помечены олеиновой кислоты везикул, шкалы бар 10 мкм. B. конфокальная микроскопия образ олеиновой кислоты везикул, содержащих Alexa488 помечены РНК с мембраной, показано в канале передачи детектор (TD), шкалы 5 мкм.

Обсуждение

Липосомы формируются из жирных кислот было предложено многими в качестве потенциальной модели для примитивных клеток из-за их высокой проницаемостью и динамических свойств. Карбоновые головной группы одной цепи жирных кислот только позволяет самостоятельной сборки в мембраны в диапазоне pH ограничен, и результате мембраны весьма чувствительны к присутствию соли. В результате жирные кислоты везикулы требуют иной подготовки и обработки методы по сравнению с фосфолипидные везикулы.

В настоящем Протоколе, хотя мы используем олеиновой кислоты в качестве примера для формирования липосом, другие длинные цепи ненасыщенных жирных кислот (C14) и их производные (ОК. миристолеиновая кислота, Пальмитолеиновая кислота и соответствующего спирты и эфиры глицерина) также образуют пузырьки следующий после метода регидратации тонкой пленки, пока общая липидные концентрации выше cmc и гидратации буфер рН близок pKa жирные кислоты в пределах мембраны. Помимо буфера tris-HCl используемые в настоящем Протоколе, другие буферные системы (ОК. bicine, фосфатов, боратов) сообщалось в поддержку формирования пузырьков жирных кислот, хотя везикулы, образованная в буфер фосфата или Борат, как правило, довольно Дырявый¹³. Результате везикулы жирные кислоты после регидратации являются полидисперсных и multilamellar, но легко преобразуются в небольших монодисперсных однослойных везикул экструзией как описано. По сравнению с sonication качестве альтернативного метода для создания мелких пузырьков, экструзии предоставляет больше параметров для элемента управления размер пузырьков, применяя различные поры мембраны размер. Везикулы после экструзии обычно немного больше, чем размер поры мембраны, но путем увеличения числа циклов экструзии, пузырьки с более узкий гранулометрический и средний размер недалеко от поры мембраны могут быть получены.

Чтобы синтезировать функционального protocells, жирные кислоты везикулы необходимо хост конкретных биохимических реакций, обусловленных инкапсуляции РНК или других строительных блоков. Тонкая пленка регидратации метод обеспечивает простой способ для формы везикулы, содержащие нужную инкапсулированные материалы. Однако эффективность инкапсуляции является относительно низким, и большая часть драгоценных материалов, такие как РНК обычно теряются во время процесса очистки. В некоторых случаях инкапсуляции эффективность может быть слегка повышена путем повторного замораживания оттаивания циклов перед экструдированием. Microfluidic методы для подготовки высокодоходных липосомы фосфолипидов позволяют почти 100% герметизация эффективности, однако аналогичные методы еще не разработана для жирных кислот везикулы.

Когда обработка protocells с хелатные или бесплатно мг^{2 +}, очистки после добавления раствора магния и repurification перед каждой точке времени обеспечивает удаление утечка инкапсулированные материалы, которые могут повлиять на точность скорости реакции измерения внутри пузырьков. Поскольку каждый очистки занимает по меньшей мере 10 мин для достижения хорошего разделения и собирать пузырьки фракций, анализ быстрых реакций трудно, и реакция должна быть остановлена до столбца repurification.

Протокол, который мы представляем здесь хорошо подходит для строительства жирных кислот липосомы, содержащие реакции передразнивать те, которые могут возникнуть в примитивные клетки. Наши протоколы также обеспечивают возможности приложений в развитии биореакторов для других биохимических реакций и биомедицинских систем доставки.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
sephorose 4B	SIGMA-ALDRICH INC	4B200
calcein	SIGMA-ALDRICH INC	C0875-10G
tris-HCl pH8.0 1M	LIFE TECHNOLOGIES CORP	AM9851
citric acid	SIGMA-ALDRICH INC	251275-500G
sodium hydroxide	SIGMA-ALDRICH INC	71690-250G
potassium hydroxide	Sigma	30614
oleic acid	Nu-Chek	U-46-A
glycerol monooleate	Nu-Chek	M-239
Liss Rhodamine-PE	LIFE TECHNOLOGIES CORP	L1392
magnesium chloride	Fisher/Thermo Fisher Scientific	AM9530G
sequagel concentrate	National Diagnostics	EC-830
sequagel DILUENT	National Diagnostics	EC-840
15% TBE-UREA GEL	Thermo Fisher Scientific	EC68852BOX
urea	Sigma Aldrich	U6504-500G
titon-100x	SIGMA-ALDRICH INC	T9284-100ML
RNA primer	IDT	5'Cy3-GCG UAG ACU GAC UGG
RNA template	IDT	5'-AAC CCC CCA GUC AGU CUA CGC
hammerhead substrate strand	IDT	5'Cy3-GCG CCG AAA CAC CGU GUC UCG AGC
hammerhead ribozyme strand	IDT	5'GGC UCG ACU GAU GAG GCG CG
vesicle extruder set	AVANTI POLAR LIPIDS	610000
fraction collector	Gilson, Inc.	171041
96-well plates	Fisher	NC9995941/675
plate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3
confocal microscope	Nikon	Nikon A1R MP Confocal
gel scanner	GE Healthcare Life Sciences	Typhoon 9410 scanner