Устьиц ленты пил: Усовершенствованный метод для пробоподготовки гвардии ячейки

Резюме

Этот протокол описывает метод подготовки обогащенного устьиц клеток гвардии, которая является полезной для физиологических и биологических исследований.

Аннотация

Исследование клеток охранник имеет важное значение для знания конкретного вклада этого типа ячейки для общей функции растений. Однако часто бывает сложно изолировать и таким образом, изучая их часто обеспечивает вызов.

Это исследование определяет метод обогащения устьиц клеток гвардии. Протокол использует Скотч изолировать гвардии клетки и извлечения белков из клеток. Этот метод улучшает целостность и доходность гвардии ячейки во время изоляции и обеспечивает надежную образец для изучения клеточных сигналов процессов и как они связаны с устьичного движение фенотипов. В этом методе листья растений были разделены между двумя частями ленты и очищенные врозь, чтобы удалить abaxial сторону. Этот протокол был применен к листовой ткани Arabidopsis изолировать гвардии клеток. Клетки относились с флуоресцеин диацетат (FDA) для определения жизнеспособности и абсцизовой кислоты (АБА) для оценки движения устьиц в ответ на ABA. В заключение этот протокол окажется полезным для подготовки обогащенного устьиц клеток гвардии и изоляции белков. Качество клеток и белков получил здесь включить физиологические и другие биологические исследования.

Введение

Устьиц играют важную роль в общей физиологии и фитнес растений. Эти крошечные завод конкретные структуры формируются две специализированные клетки эпидермиса, известный как охранник клетки и наиболее обильно находятся на abaxial поверхности листьев. Устьиц необходимы для обмен газов между завода и атмосферы, а также контроль за потери воды за счет транспирации. Гвардии клетки регулируют устьиц диафрагмы путем интеграции различных внешних (например, света, влажности, возбудитель контакт, уровни углекислого газа) и внутренние (например., эндогенных гормонов) раздражители^1,2. За последние 20 лет этот тип ячейки стала модель системы для изучения ячейки сигнализации процессы в растениях. Эти клетки составляют небольшую долю общего числа клеток в листа; Таким образом расследовать их уникальных сотовых, биохимических и молекулярных свойств в виде одноклеточных, необходимо изолировать их от других типов клетки листа. В прошлом гвардии клетки исследования часто связан с подготовкой гвардии клеток протопласта (GCP)^3,4,5. Это обычно требует использования большого количества унижающих достоинство ферменты клеточной стенки, и или механические нарушения через смешивания и оказалось, чтобы быть дорогостоящим и трудоемким, поскольку он обычно занимает много времени, чтобы подготовить образец GCP, часто раз с маленькой доходности. Что еще более важно потому что гвардии клетки действуют в качестве полной пары регулировать устьиц диафрагмы, использование GCP можно рассматривать как искусственные системы для изучения клеток гвардии сигнализации.

Здесь мы разработали метод подготовить устьиц, в которых нетронутыми гвардии клетки обогащаются и сохранять физиологические реакции на раздражители. Этот метод был вдохновлен метод, который был использован для изолировать мезофилл клеток протопласта^6,7. В нашем методе устьиц готовятся с использованием четких Скотч сначала отделить большинство клеток мезофилл придает adaxial слой листьев от abaxial слой, содержащий тротуар и гвардии клетки. Это делается путем проставления кусок ленты на каждой стороне листа и пилинг их друг от друга. Клетки из abaxial слоя разрешается взять под свет в буфере устьиц открытия. Позже оставшиеся тротуар клетки удаляются с помощью небольшого количества клеточной стенки, унижающего достоинство ферментов, оставив позади гвардии ячейку, обогащаются на ленте.

В этой простой метод устьичного гвардии клетки, которые являются жизнеспособной и гибкой можно быстро и эффективно быть готовым, принимая менее чем за час для получения обогащенного устьиц клеток гвардии из 50 пилинг с минимальными затратами. Этот метод предусматривает меньший ущерб для растительных клеток, чем предыдущие методы, где готовят протопласта. Кроме того материалы собраны из этого метода доходности желательно белка сумм. Самое главное потому что лист не подвергается смешивания или длительных пищеварение раз и гвардии клетки остаются нетронутыми, результаты исследований более тесно будет отношение к естественной биологии клетки гвардии. С помощью этого метода можно соотнести устьичных движений в реальном времени с изменениями на молекулярном уровне. Таким образом знания, полученные от исследований с использованием этого метода подготовки бы важное значение для более полного понимания гвардии клеток сигнализации.

Мы использовали растение Arabidopsis thaliana как модель; Однако этот протокол может применяться к обогащению устьиц клеток гвардии в других видов растений, таких как рапс с небольшими изменениями в время пищеварения. Как доказательство концепции мы продемонстрировали, что устьичного гвардии клетки, обогащенный через этот метод жизнеспособным и реагировать на раздражители, как показано на флуоресцеин диацетат (FDA) анализа и исследований с использованием абсцизовой кислоты растительный гормон (ABA), соответственно. Кроме того мы продемонстрировали, что высококачественные белки могут быть изолированы от этих клеток гвардии. Здесь мы описываем подробный протокол этого процесса.

протокол

1. Выращивание растений

1. Прорастают семена в заливки смеси. Растут растения в камере роста с интенсивностью освещения 140 мкмоль фотоны m⁻² s ⁻¹ и фотопериода 8 h света при 22 ° C и 16 h темной при 18 ° C в течение 2 недель.
2. Трансплантировать сеянцы аналогичных размеров индивидуально в 4" диаметр кастрюли, содержащие почвы и расти для дополнительных 3 недели в тех же условиях, описанных на этапе 1.1.
   Примечание: Водные растения с водопроводной водой два раза в неделю сохранить влажные почвы.

2. Подготовка обогащенного устьиц

1. Удалите листья 5 - неделя старый A. thaliana растений отдельных с помощью скальпеля.
2. Прикрепите каждый лист на две части ясно скотч, один кусок, придерживаясь abaxial (нижнюю) и другие произведения, придерживаясь adaxial (верхний) стороне листа. Оставьте ленту на листе 5 s.
3. Нежный пилинг врозь двух кусков ленты, используя указательный палец и большой палец на каждой руке для разделения на abaxial стороне с мостовой и гвардии клетки и adaxial сторону с мезофилл клеток.
4. Место, пилинг с abaxial стороны листьев в 60 мл устьиц открытия буфера (50 мм KCl, 10 MES-Кох, скорректированы до pH 6.2 с 1 M Кох) в размере 40 мм × 12мм Петри блюда, как они были собраны.
   1. Повторите описанные выше шаги до тех пор, пока собираются все образцы пилинг.
5. Место Петри, содержащий пилинг в камеру роста легких условиях, заявил на этапе 1.1. Оставьте пилинг под свет за 2 ч до полностью открыть устьиц.
6. Место пилинг в 150 мм x 20 мм Петри, содержащие 50 мл клеточной стенки, усваивая смесь ферментов (0,7% целлюлаза R-10, 0,025% macerozyme R-10, 0.1% (w/v) поливинилпирролидона-40 и 0,25% (w/v) бычьего сывороточного альбумина в основной раствор 55% (сорбита 0,55 М, 0,5 мм CaCl₂, MgCl 0,5 мм₂, аскорбиновая кислота 0,5 мм, 10 мкм х₂PO₄, 5 мм 4-morpholineethanesulfonic кислота (MES) при рН 5,7 скорректирована с 1 M Кох).
7. Встряхните пилинг на взаимные шейкер в чашке Петри на 50 об/мин за 20 мин.
8. Удаление пилинг из ферментов решения с помощью пинцета после 20 мин передачи пилинг в Петри блюдо размер 150 x 20 мм, содержащие 50 мл воды.
9. С помощью пипетки передачи, промойте пилинг для 15 s дважды с 10 мл воды для удаления любого остаточного фермента решения.
10. Место пилинг в 150 мм х 20 мм размер Петри блюдо с 50 мл свежего устьиц открытия буфера, используемый в шаге 2.4 с помощью пинцета. Инкубируйте 1 час в условиях освещенности, заявил на этапе 1.1 разрешить устьиц для восстановления.

3. абсцизовой кислоты (АБА) лечение и пробирного движения устьиц

1. В размер 150 x 20 мм Петри. Инкубируйте пилинг обогащенного устьиц на 30° C в течение 15 мин в 50 мл устьиц открытия буфера или 50 мл устьиц открытия буфера с конечной концентрации 10 мкм ABA для надлежащего лечения время.
2. Место пилинг на шейкер на 50 об/мин за 5, 15 и 30 мин. После каждого интервала удалить кожуру с помощью пинцета и визуализации выполните шаг 3.3.
3. Принимать образы устьиц до лечения Аба и в различные моменты времени после лечения ABA с световой микроскоп.
   1. Взять кожуру и поместите ее на стекло микроскопа.
   2. Поместите слайд на микроскопа и отрегулировать сцене так, что изображение корки могут быть визуализированы.
   3. Отрегулируйте размер штрафа и курс акцент на Микроскоп, чтобы получить четкое изображение гвардии клеток.
   4. Возьмите несколько изображений нескольких устьиц на 40 кратном.
4. Измерьте 60 устьичного отверстия с помощью ImageJ⁸.
5. Вычислить стандартная ошибка и значение в p значение < 0,05 60 измерений устьичной диафрагмы.

4. белка добычу и разъединения SDS-Page

1. Растереть пилинг для 15 s в достаточно жидкого азота для покрытия пилинг с использованием охлажденной ступку и пестик.
2. За 50 пилинги, добавить 3 мл трис насыщенных фенола (рН 8,8) и 3 мл белка добычу буфера (0,9 М сахарозы, 0.1 М трис-HCl, 0,01 М ЭДТА, 0,4% 2-меркаптоэтанол, 10 мкл ингибитора протеазы и фосфатазы 1 мм) с пипеткой с раствором и затем шлифуют пилинг для 5 addi ных минут зонта.
3. Передача с помощью пипетки экстракт и пилинг с использованием металлических Пинцеты для Окридж центрифуга трубки и агитировать на шейкер на 50 об/мин за 1 час при 4 ° C.
4. Удаление пилинг из трубки Окридж центрифуги и центрифуги экстракт на 5000 x g за 10 мин. Затем перенесите Топ фенольные этап новой чистой микро пластиковых пробирок с помощью пипетки.
5. Преципитат фенола извлечены белки, добавив 5 томов ледяной ацетата аммония 0,1 М в 100% метанола. Вихревой кратко и инкубировать на ночь при-20 ° C.
6. Центрифуга на 20000 x g при 4 ° C в течение 20 мин, сцеживаться супернатанта, медленно поливая из трубки и удерживать Пелле белка в трубе.
7. Помыть лепешка белка дважды с Ацетат аммония 0,1 М в метаноле и затем дважды с 80% ацетона и один раз с 100% холодной ацетона.
   Примечание: Моет выполняются путем добавления 10 мл реагента, указанного на трубу белка. Агитируйте на шейкер на 50 об/мин за 5 мин, затем центрифугированием на 15000 x g при 4 ° C на 10 мин. Затем налейте реагент из трубки, сохраняя только белок Пелле.
8. Добавьте 1 мл 100% ацетона, холодные гранулы и вновь приостановить, медленно закупорить вверх и вниз.
9. Передачи подвеска белка через пипетку в 2-мл пробирку микро центрифуги, а затем центрифуги на 20000 x g при 4 ° C за 5 мин.
10. Удалите ацетон, переливание из трубки и сухие гранулы в вытяжной шкаф на 10 мин.
11. Распустить белка в микро пластиковых пробирок с 200 мкл буфера распада (8 M мочевины, 0,5% SDS, 30 мм трис-HCl при рН 8,5) и вихрь 30 мин центрифуги на 20000 x g, при 15 ° С 20 мин и собирать супернатант в новой трубки.
12. Количественно определить концентрацию белка после белка количественной протокол⁹.
13. Используйте образцы протеина для разделения белков электрофорезом геля после протокол¹⁰.

Результаты

Представитель изображение Arabidopsis гвардии клеток до и после переваривание мезофилл и эпидермальных клеток показана на рисунке 1. Жизнеспособность клеток гвардии до и после удаления мезофилл и эпидермальных клеток можно наблюдать с помощью FDA для измер?...

Обсуждение

Гвардии клетки являются модель системы для изучения механизмы трансдукции сигнала в растениях, и важно обеспечить наиболее подходящий ответ на биологические вопросы подготовки проб, используемых в исследовании. Несмотря на растущий интерес к гвардии клеток в рамках исследовательско...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stainless Steel Surgical Scalpel	Feather	NC9999403
Scotch Tape (3M)	ULINE	S-9781
Petri Dish	Sigma-Aldrich	BR455701
Cellulase (Onozuka R-10)	Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.	21560003-3
Macerozyme R-10	Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.	21560003-4
DM6000B Microscope	Leica Microsystems
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails	Thermo Fisher Scientific	PI78443
Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	3119-0030
EZQ Protein Quantitation Kit	Thermo Fisher Scientific	R33200
Fluorescein Diacetate (FDA)	Thermo Fisher Scientific	F1303
Abscisic Acid	Sigma-Aldrich	A4906
Metro Mix 500	BWI Companies	TX-500
Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad	161-0737
Bio-Safe Comassie (G-250)	Bio-Rad	161-0786
Microcentrifuge Tube (2mL)	USA Scientific, Inc.	1620-2700
ImageJ software	National Institute of Health
Tweezers	Sigma-Aldrich	F4017-1EA
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Bio-Rad	456-1043
Microscope slides	Fisherbrand	12-550-A3