Изучение рибонуклеотид включение: Обнаружение Strand конкретных Ribonucleotides в геноме дрожжей и измерения рибонуклеотид индуцированного мутагенеза

Резюме

Ribonucleotides относятся к числу наиболее распространенных неканонических нуклеотидов, включения в Геном эукариот ядерных репликации ДНК. Если удалены не должным образом, ribonucleotides может вызвать повреждение ДНК и мутагенез. Здесь мы представляем две экспериментальные подходы, которые используются для оценки обилие рибонуклеотид включения в ДНК и мутагенных эффектов.

Аннотация

Наличие ribonucleotides в ядерной ДНК было показано, быть источником геномной нестабильности. Степень включения рибонуклеотид могут быть оценены щелочной гидролиз и электрофорез геля, как РНК, является очень восприимчивы к гидролизу в щелочных условиях. Это, в сочетании с юга блот анализ может использоваться для определения местоположения и прядь в который были включены ribonucleotides. Однако эта процедура является только полуколичественного и не может быть достаточно чувствительным, чтобы обнаружить небольшие изменения в содержании рибонуклеотид, хотя Южная помарка стренги конкретных зондирующего улучшает чувствительность. Как мера одного из самых ярких биологических последствий ribonucleotides в ДНК спонтанного мутагенеза могут быть проанализированы с использованием пробирного вперед мутации. Используя соответствующие репортер генов, редкой мутации, которые приводит к потере функции может быть отдельных и общих и конкретных мутаций ставки может измеряться путем объединения данных из колебаний эксперименты с секвенирования ДНК гена репортера. Assay колебания применимо рассмотреть широкий спектр мутагенных процессов в конкретных генетический фон или условий роста.

Введение

Во время эукариотических ядерных репликации ДНК ribonucleotides включены в геноме всех трех основных replicases ДНК, ДНК полимеразы (Pols) α, ε и δ^1,2. РНКазы H2-зависимых рибонуклеотид иссечение ремонт (³RER) удаляет большинство этих встроенных ribonucleotides.

Рибонуклеотид в ДНК подвержен гидролизу, как 2' гидроксильной группы части молекулы сахара может атаковать прилегающих Фосфодиэфирная связь, выпустив один конец с 2' - 3' циклических фосфата и другой с 5'-OH-⁴. Щелочная среда может значительно ускорить эту реакцию. Таким образом гидролиз встраиваемых ribonucleotides во время инкубации в основной раствор вызывает фрагментацию геномной ДНК, которые могут быть визуализированы щелочной агарозы электрофорез⁵. ДНК может быть передана мембраны и исследован, Южная помарка анализа с помощью зондов нити конкретные, которые позволяют выявлять щелочно чувствительных участков, вызванные ribonucleotides, включены в зарождающейся ведущих - или теплоизоляции strand ДНК, соответственно.

В клетках дрожжей не хватает активности РНКазы H2 удаление ribonucleotides может быть инициировано когда Топоизомераза I (Top1) Никс ДНК на встраиваемых рибонуклеотид^6,7. Однако когда Top1 расщепляет на стороне 3' рибонуклеотид, это генерирует 5'-OH и 2' - 3' циклических фосфат ДНК концы которые огнеупоров для religation. Неспособность ремонт, или аномальным обработка этих «грязные концы» может привести к геномной нестабильности. Кроме того если разрез происходит внутри повторяющихся последовательностей ДНК, процесс восстановления может привести к удаления мутации. Это особенно проблематично для тандемные повторы, где короткие удаления (из между 2 и 5 пар оснований) обычно наблюдается в клетках РНКазы H2-недостаточным. Top1-зависимых пагубные последствия в отсутствие дрожжей РНКазы H2 активности усиливаются в прослушивающем для включения рибонуклеотид во время зарождающейся ведущих стренги синтеза мутант ε ДНК-полимеразы (pol2-M644G).

Обработка ribonucleotides в ДНК приводит к спонтанной мутации и этот мутагенеза можно обнаружить с помощью соответствующих репортер генов, выбрав для сопровождающих фенотипические изменения. Колебания тест или Лурия и Дельбрюк эксперимент является одним из наиболее часто используемых методов для измерения скорости спонтанной мутации, с помощью выбираемых репортер генов^8,9. В дрожжей URA3 и CAN1 генов может использоваться как журналистам в assay вперед мутации, которая позволяет для обнаружения всех типов мутаций, приводящих к потере функции гена. Уровень спонтанной мутации оценивается как средний показатель наблюдается для нескольких параллельных культур, начал с одной колонии без мутации в гене репортер целевой. Дрожжи, RNase H2-недостаточным напрягаться, такие, как rnh201Δ имеет умеренно повышенной скоростью целом спонтанной мутации, во многом вызванные повышенной заболеваемости 2-5 bp удалений в тандеме повторить последовательности. Таким образом чтобы полностью характеризуют мутагенных эффектов ribonucleotides в геноме, скорости конкретной мутации должны определяться. В этом случае URA3 или CAN1 репортер генов может быть усиливается и последовательности для определения типа и местоположения мутаций, и скорости конкретной мутации могут быть рассчитаны. Компиляция мутации, определены в нескольких независимых URA3 или CAN1 мутантов, затем может использоваться для создания спектра мутаций.

протокол

1. щелочной гидролиз и специфичные для Strand Южная помарка (рис. 1)

1. Геномная ДНК изоляции и рост клеток
   1. Изолируйте дрожжи геномной ДНК с помощью дрожжей ДНК очистки комплект следуя инструкциям производителя. Использование культуры, которые находятся в экспоненциальной фазе роста между (оптической плотностью 0,5) и 1. Ресуспензируйте окончательный Пелле ДНК в 35 мл 1 x TE буфера (10 мм трис-HCl, pH 7.5, 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)).
   2. Добавьте 1 mL 5 мг/мл РНКазы A ДНК и Инкубируйте 30 мин при температуре 37 ° C.
   3. Осадок ДНК, с использованием 0.1 объемов ацетат натрия 3 M (рН 5.2) и 2,5 томов 100% этанола для 20 мин на льду.
   4. Центрифуга на 16000 x g 20 мин при 4 ° C. Удалите с помощью пипетки супернатант.
   5. Помойте лепешка дважды с 500 мл 70% этанола. Удалите с помощью пипетки супернатант.
   6. Сухие гранулы на скамейке и Ресуспензируйте 35 мл 1 x TE буфера.
   7. Quantitate ДНК, используя dsDNA BR Assay комплект fluorimeter (Таблица материалов).
   8. Осадок 5 мг от каждого образца, используя 0.1 томов 3 M ацетат натрия, рН 5.2 и 2.5 тома 100% ДНК EtOH для суммарный объем 200 мл (добавить H₂O, если необходимо, дополнительные 5 мг ДНК необходима, если необходим контроль нейтральных гель). Инкубируйте на льду за 20 мин.
   9. Центрифуга на 16000 x g 20 мин при 4 ° C. Удалите с помощью пипетки супернатант.
   10. Сухие гранулы на скамейке. Ресуспензируйте ДНК в 14 мл H₂O.
2. Щелочной гидролиз и гель электрофорез
   1. Добавить 6 мл 1 м Кох и Инкубируйте на 55 ° C за 2 ч.
   2. Проинкубируйте образцы на льду на 5 мин.
   3. Добавить 4 мл 6 x щелочная ДНК загрузки буфера: 300 мм Кох, 6 мм ЭДТА, рН 8,0, 18% polysucrose (Таблица материалов), 0,15% бромкрезоловый зеленый и 0,25% ксилола cyanol FF.
   4. Литой щелочного гель, который состоит из агарозы 1%, 50 мм NaOH, ЭДТА 1 мм, pH 8.0. Используйте расческу, что позволяет быть загружены на переулок 24 мл образца ДНК.
   5. Побегите гель при комнатной температуре в 1 x буфер электрофореза щелочной: 50 мм NaOH, 1 ЭДТА, рН 8.0. Включать соответствующий маркер размера ДНК.
   6. Спин вниз трубы кратко и загрузить весь 24 мл образца в щелочной агарозном геле. Electrophorese 30 мин в 30 V, а затем 18-20 h 10 V.
   7. Нейтрализовать гель для 2 инкубаций 45 мин при комнатной температуре с нежным агитации в нейтрализации буфера I: 1 М трис-HCl, 1,5 М NaCl.
   8. Пятно ДНК путем замачивания нейтрализованы гель в 200 мл воды, содержащие 1/10000 разрежения золото SYBR пятно втечение 2 ч при комнатной температуре с нежным встряхивания.
   9. Визуализация с помощью УФ transilluminator ДНК. Увеличение щелочно чувствительность приводит к появлению небольших фрагментов ДНК, указывающее плотность неустраненный ribonucleotides в ДНК⁵.
3. Южный передачи
   1. Передать ДНК из щелочного гель мембрана положительно заряженный нейлон капиллярность¹⁰. Пример того, как можно настроить этот перевод предоставляется в Sambrook и Рассела ручной¹⁰.
   2. Замочите щелочного гель для 15 мин при комнатной температуре в щелочной передачи буфера: 0.4 М NaOH, 1 M NaCl.
   3. Влажный нейлон мембраны (нарезанные по размеру геля) кратко с водой, а затем замочить на 5 минут в щелочной передачи буфера.
   4. Настройка трансферной платформе, инвертирование 3 стеклянные стаканы (100 мл) в стакан для выпечки. Это блюдо должно быть немного больше, чем размер геля агарозы. Установите стеклянную пластину поверх них.
   5. Драпировка 2 больших бумажки 3 мм ЦПЧ хроматографии (нарезанные по размеру ширины гель плюс больше сторон, которые могут драпировка над краями в буфер водохранилище) над стеклянной пластиной.
   6. Залить щелочного буфера передачи бумажной хроматографии и наполовину заполнить стеклянную посуду. Зачищают пузыри с помощью пипетки стеклянные 5 мл.
   7. Гель агарозы место на вершине, снова разглаживания пузырьков. Окружают всем краям геля с парафина. Налейте небольшое количество щелочного буфера передачи на геле.
   8. Место предварительно замоченные нейлон мембраны поверх геля. Зачищают пузыри.
   9. Мокрые 2 бумажки нарезанные по размеру геля агарозы. Разместите их на вершине мембраны и сгладить любые пузыри.
   10. Место большой стек бумажных полотенец (вырезать по размеру чуть больше, чем геля агарозы) поверх передачи сэндвич. Осторожно поместите стеклянную пластину поверх бумажные полотенца. Добавьте объект взвешенный на вершину (книга с массой 400 g работает хорошо).
   11. Пусть передачи перейти на ночь при комнатной температуре.
   12. Тщательно разобрать стек передачи и замочить мембрана для 15 мин при комнатной температуре в нейтрализации буфера II: 0.5 М трис-HCl, рН 7,2, 1 M NaCl.
   13. Crosslink ДНК заряженных нейлон мембраны с помощью УФ сшивателя. Мембрана в крест-компоновщик и использовать параметр autocrosslink.
4. Подготовка Южной зонд
   Примечание: Подход, описанный здесь, чтобы обнаружить щелочно чувствительных участков в зарождающейся ведущих-против отстает нити ДНК на основе протокола ранее опубликованы¹¹. Для нашего эксперимента зондирование выполняется на URA3 Репортер ген, который был вставлен в одном из двух направлений (или1 или OR2) рядом с ARS306 репликации происхождения на хромосоме III (рис. 3A). Присутствие щелочно чувствительных участков в геномной ДНК дрожжей является показателем рибонуклеотид включения, что позволяет использовать ribonucleotides как биомаркеров ДНК-полимеразной активности^12,13,14. Этот подход, с помощью целевого объекта последовательности ДНК, прилегающих к эффективной ARS306 происхождение репликации, должны поддаваться других геномной мест и генов-мишеней.
   1. ПЦР усиливают 520-база сегмент пара гена URA3 репортер, используя следующие пары праймера: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) и URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
   2. Выполнить с помощью 10-20 нг дрожжей геномной ДНК как шаблон, 4 мкл каждого праймера (10 мкм бульон), 10 мкл 10 x Ex Taq буфера (мг^{2 +} плюс), 8 мкл dNTP смеси (по 2,5 мм), 0.5 мкл из Ex полимераза дна Taq реакции PCR (5 U/мкл) и окончательного громкость до 100 мкл с H₂O.
   3. Запустите следующую программу ПЦР: 95 ° C за 5 мин; 30 циклов 95 ° C за 1 мин, 55 ° C за 1 мин., 72 ° C на 2 мин; 72 ° C для 10 мин и удерживайте при 4 ° C.
   4. Очистить продукт PCR, используя комплект для очистки ПЦР и элюировать ДНК, используя 50 мл H₂O. Это теперь может использоваться как шаблон в radiolabeling реакции.
   5. Используйте следующие Праймеры для нити конкретных radiolabeling: использование URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) для визуализации ДНК, которая anneals к зонду A. Это соответствует зарождающегося ведущих нити ДНК при URA3 в OR2 и tnascent, отставание нити ДНК, когда URA3 в или1. Использовать URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) для визуализации зарождающейся ДНК, которые anneals к зонду б. Это соответствует зарождающегося ведущих нити ДНК, когда URA3 в или1 и зарождающейся отстающих нити ДНК при URA3 в OR2 (рис. 3).
      1. Выполнить radiolabeling реакции, с помощью 10-20 нг усиленный URA3 фрагмент как шаблон ДНК, 2 мкл грунтовка (10 мкм бульон), 5 мкл 10 x Ex Taq буфера (мг^{2 +} плюс), 4 мкл дНТФ 2,5 мм (минус дЦТФ), 5 мкл (50 МККИ) -³²P-дЦТФ , 0.5 мкл ExTaq ДНК-полимеразы (5 U/мкл) и окончательного громкость до 50 мкл с H₂O. Run следующие программы для radiolabeling: 94 ° C за 5 мин; 25 циклов 94 ° C за 1 мин, 55 ° C за 30 s, 72 ° C в течение 1 мин; 72 ° C за 5 мин и удерживайте при 4 ° C.
   6. Для удаления неинкорпорированных радиоактивных лейбл используйте столбец G-25 спина. Прежде чем добавлять radiolabeled образца, центрифуга столбце 1 мин на 720 x g и removethe буфера, закупорить. Загрузите продукт radiolabeled реакции и центрифуги для 2 мин на 720 x g элюировать помечены зонд.
   7. Инкубируйте на 95 ° C за 5 мин до денатурировать зонда непосредственно перед гибридизации. Прохладный кратко на льду.
5. Южный гибридизации
   1. Roll увлажненный мембраны в гибридизации трубку и добавить 25 мл свежеприготовленные гибридизации буфера: 0.5 M натрия фосфат буфера, pH 7.2, 7% додецилового сульфата натрия (SDS), 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА). Инкубируйте на 65 ° C для 1-2 ч с вращением в печь гибридизации.
   2. Тщательно слейте раствор и добавить 25 мл буфера гибридизации плюс радиоизотопами зонд. Инкубируйте на 65 ° C для 16-18 ч с вращением.
   3. Слейте раствор в контейнер радиоактивных отходов. Выполните 5 моет 5 мин при комнатной температуре с фосфат-SDS стирки решение I: 40 мм натрия фосфат буфера, рН 7,2, 5% SDS, 0,5% BSA, 1 мм ЭДТА, рН 8.0.
   4. Выполнить 2 моет 15 мин при 65 ° C с фосфат-SDS стирки решение II: фосфат натрия буфера 40 мм, pH 7.2, 1% SDS, 1 мм ЭДТА, рН 8.0.
   5. Удаление мембраны из трубки гибридизации с помощью пинцета и место в ограничитель открыл пластиковый рукав. Обложка и подвергать изображений пластины. Попробуйте несколько различных воздействия раз до 4 d 4 h.
   6. При необходимости, полосы и повторно зонд пятно с помощью различных зонда примерно 3 - 4 раза. Раздеться, Проинкубируйте мембрану на 2 ч при температуре 65 ° C 25 мл 50% формамида, 2 x SSPE решения.
      Примечание: 20 x SSPE Стоковый раствор: 3 M NaCl, 0,2 М NaH₂PO₄, 0,02 М ЭДТА, рН 7,4.
   7. Слейте раствор в контейнер радиоактивных отходов. Выполните 2 моет 15 мин при температуре 65 ° C в фосфат-SDS мытья решения II.
   8. Проверьте мембраны с Гейгера и повторите зачистки протокол, если сигнал остается.
   9. Выполнение предварительно гибридизации и гибридизации, как описано выше.

2. Измерение мутации темпы и специфику штаммов S. cerevisiae

1. Подготовить культура клетки
   1. Прививать единую колонию (здоровый дрожжи клетки занимает 2-3 дня при 30 ° C в форме надлежащего размера колоний) вырос на агаре YPD дополнена аденин 100 мг/мл 5 мл YPDA бульон с аденином 250 мг/мл (добавок аденин необходимо, только если штамм используется является аденин auxotroph). Растут в шейкер инкубатор или на вращателе при 30 ° C до тех пор, пока культура достигает насыщения (36-48 h для деформации без дефекта серьезный рост).
   2. Спин вниз клетки на ~ 2000 x g за 5 мин.
   3. Отменить супернатант и вымыть клетки с 5 мл стерильной воды.
   4. Ресуспензируйте клетки в 500 мл стерильной воды.
2. Разбавление культуры клеток и обшивка
   1. -Выбор элементов управления разбавляют клетки в 96-луночных тарелку с коэффициентом 1,600,000 и пластины 100 мл каждой культуры на полную тарелку (COM).
   2. Чтобы выбрать для ura3 мутантов, тарелка 100 мл неразбавленного клеток на 5-фр пластину для штамма (WT) одичал тип. Разбавьте клетки соответственно, если уровень мутации штамма интерес, как ожидается, будет выше, чем в WT штамм.
   3. Чтобы выбрать для can1 мутантов, разбавленные клетки 5 раз и пластины 100 мл на canavanine содержащие пластину (CAN) для штамма WT. Коэффициент разрежения — 0,5.
   4. Инкубируйте пластины при 30 ° C до формы колонии дрождей. Для штаммов без роста дефект 2-3 дня обычно достаточно для COM и может пластины и 3-5 дней для тарелок 5-фр. Чтобы сравнить скорости мутации между разными штаммами, лучше выбрать тот же день роста для подсчета колоний. Храните пластины, готовы быть подсчитанным в холодной комнате (~ 4 ° C).
3. Расчет ставки спонтанной мутации
   1. Количество видимых колоний на каждой пластине и принять к сведению колонии чисел
   2. Рассчитать уровень мутации, Дрейка формуле: μ = f ÷ ln (μNt). f — частота мутаций, определяется количество мутантов, деленное на количество клеток в окончательном культуре. NT-это количество клеток в культуре окончательный и μ является уровень мутации. Это уравнение может быть решена путем итеративный метод как метод Ньютона-Рафсона. Существуют другие методы оценки, включая Леа и Coulson тест, чтобы вычислить стоимость мутации¹⁵.
   3. Вычислите при условии нормального распределения журнала доверительный интервал utation ставок отдельных изолятов. 95% доверительный интервал наиболее часто используется.
4. Анализ спектра мутаций
   1. Выбрать один колонии от каждого 5-фр или может пластины и обновить на YPDA плите.
   2. Выполнять колонии PCR усиливает URA3 или CAN1 гена и последовательности с целью выявления мутаций, с использованием следующих грунтовок: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') и URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') для обоих амплификации PCR и секвенирование гена 800 URA3 ВР; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') и CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') для усиления и CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') и (CAN1-BR 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') для секвенирования 1800 bp CAN1 Репортер ген.
   3. Чтобы выполнить колонии PCR, Ресуспензируйте единую колонию в 5 мкл H₂O и использовать 1 мкл в качестве шаблона. Добавить 1 мкл каждого из грунтовки (5 мкм бульон), 2 мкл (мг^{2 +} плюс) 5 x KAPA2G буфера, 0.5 мкл dNTP (2,5 мм), 0.5 мкл из KAPA2G быстро ДНК-полимеразы, 12 мкл H₂O.
   4. Для амплификации гена URA3 , запустите следующую программу ПЦР: 95 ° C за 5 мин; 5 циклов 95 ° c 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C за 30 сек; 35 циклов 95 ° C 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C за 30 сек; 72 ° C для 2 мин и удерживайте при 4 ° C. Для амплификации гена CAN1 , запустите следующую программу ПЦР: 95 ° C за 5 мин; 5 циклов 95 ° c 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C для 45 s; 35 циклов 95 ° C 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C для 45 s; 72 ° C для 2 мин и удерживайте при 4 ° C.
   5. Совместите результаты секвенирования последовательности ссылку, используя такие программы, как DNASTAR Seqman Pro или Sequencher для выявления мутаций.
   6. Сбор данных мутации мутации типа (рис. 4) или мутация местоположение (рис. 5). Вычислить конкретные мутации ставки по частоте мутаций (количество событий, наблюдается делится на количество мутантов виртуализированных) умножается на общий уровень мутации.

Результаты

Лечение геномной ДНК щелочью, следуют щелочного гель-электрофорез позволяет для полуколичественного определения фрагментацию ДНК из-за обилия стабильно включены ribonucleotides. Рисунок 2 показывает изображения гель дрожжей геномной ДНК относились с или бе...

Обсуждение

Здесь мы описываем протоколы для двух наборов экспериментов, которые часто используются для полу количественно анализа включены во время репликации ДНК и мутагенных эффектов неустраненный ribonucleotides ribonucleotides. Хотя эти подходы включают модель эукариоты S. cerevisiae, эти методы можно лег?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
YPD media			20 g dextrose, 20 g peptone, 10g yeast extract, in deionized H2O up to 1 L, add 20 g Bacto agar for solid media, autoclave.
COM plates			1.3 g SC dropout mix, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar deionized H2O up to 1 L. Adjust pH to 5.8. Autoclave and 30 – 35 ml per plate.
CAN plates			1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 1 L. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 56 °C. Add 6 mL of filter-sterilized 1% canavanine sulfate solution.
5-FOA plates			1.3 g SC-Ura dropout powder, 1.7 g yeast nitrogen base without amino acids or (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dextrose, 20 g Bacto agar, 25 mg uracil and H2O up to 800 mL. Autoclave for 15 mins at 121 °C and cool down to 60 °C. Add 200 mL of filter-sterilized 0.5% 5-FOA solution.
L-Canavanine sulfate	US Biological	C1050
5-FOA	US Biological	F5050
20 mL glass culture tube			Any brand
Culture rotator in 30 °C incubator			Shaker incubator can be used instead
96 well round bottom plates			Sterile, any brand
3 mm glass beads	Fisher Scientific	11-312A	Autoclave before use
12-channel pipettes			Any brand
Ex Taq DNA Polymerase	TaKaRa	RR001
Epicentre MasterPure Yeast DNA Purification Kit	Epicenter	MPY80200
3 M sodium acetate	Sigma-Aldrich	S7899
100% ethanol
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen	Q32866	Newer model available
dsDNA BR Assay kit	Invitrogen	Q32850
KOH	Sigma-Aldrich	221473
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
Ficoll 400	Dot Scientific Inc.	DSF10400
Bromocresol green	Eastman	6356
Xylene cyanol FF	International Technologies Inc.	72120
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
1 M Tris-HCl (pH 8.0)	Teknova	T5080
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S11494
UV transilluminator
Amersham Nylon membrane Hybond-N+	GE Healthcare	RPN303B
3 MM CHR Chromotography paper	Whatman	3030-392
NaCl	Caledon	7560-1
Stratalinker 1800	Stratagene
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28106
G-25 spin column	GE Healthcare	27-5325-01
1 M Sodium phosphate buffer (pH 7.2)	Sigma-Aldrich	NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)
SDS	Sigma-Aldrich	L4522
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
Formamide	Sigma-Aldrich	47671
Geiger counter