Целенаправленный и избирательный лечение плюрипотентных стволовых клеток тератомы, используя внешний пучка излучения в модели малого животных

Резюме

Исследования по стратегиям тератомы плюрипотентных стволовых клеток лечение имеет важное значение для клинической перевод стволовых клеток. Здесь мы описываем протокол к, во-первых, генерировать стволовых клеток тератомы мышей и, затем, чтобы выборочно целевого и лечить эти опухоли в естественных условиях, с помощью малых животных облучателя.

Аннотация

Растущее число жертв «туризма стволовых клеток, «нерегулируемого трансплантация стволовых клеток по всему миру, выразили обеспокоенность по поводу безопасности трансплантации стволовых клеток. Хотя пересадка продифференцированы вместо недифференцированных клеток является обычной практикой, тератомы могут по-прежнему возникают от присутствия остаточных недифференцированных стволовых клеток во время пересадки или от спонтанных мутаций в продифференцировано клетки. Потому что терапия стволовой клетки часто поставляются в анатомически спецобъектов, даже небольшие опухоли может быть клинически разрушительным, что приводит к слепоте, паралич, когнитивные нарушения и сердечно-сосудистой дисфункции. Хирургический доступ на эти сайты также могут быть ограничены, оставив больных с несколько терапевтические возможности. Контроль за недостойное поведение стволовых клеток, таким образом, решающее значение для клинической перевод стволовых клеток.

Внешний пучка излучения предлагает эффективным средством доставки таргетная терапия уменьшения бремени тератома при сведении к минимуму травмы в окружающие органы. Кроме того этот метод позволяет избежать генетические манипуляции или вирусный трансдукции стволовых клеток, которые связаны с дополнительных клинических безопасности и эффективности. Здесь мы описываем протокол для создания плюрипотентных стволовых клеток тератомы мышей и применять внешние пучка лучевой терапии, чтобы выборочно удалять эти опухоли в естественных условиях.

Введение

Развитие терапии стволовой клетки для регенерации тканей столкнулся с рядом барьеров в последние несколько десятилетий, препятствуют усилиям по эффективной клинической развертывания. Эти препятствия включают бедных ячейки хранения на участках поставки, иммуногенность стволовых клеток и неопластические потенциал формы тератомы¹. Tumorigenicity вызывает особое беспокойство клинических как он потенциально может нанести вред трансплантации стволовых клеток получателей². Счетов образования опухоли из-за нерегулируемого стволовых клеток инъекции уже сообщалось в нескольких клинических параметров^3,4,5. Потенциал для формирования тератома является наиболее часто цитируется клинических озабоченность в развитии плюрипотентных стволовых клеток (СМБ) и привела к задержки и отмены нескольких громких эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) испытания^6,,78,9. Таким образом существует настоятельная необходимость для трансляционного расследования, выделенные на обеспечение надлежащего лечения, следует эти ятрогенные опухоли возникают.

На сегодняшний день, большинство стратегий для управления стволовых клеток проступок были направлены на сокращение числа ЦОНов с онкогенной потенциальных^2,10. К сожалению только небольшое количество остаточного клеток (например,., 1 x 10-⁴ до 1 x 10⁵ клеток¹¹) необходим для формирования тератома, которая значительно ниже предела обнаружения котируется на имеющихся в настоящее время анализы^{12, 13}. другие ограничения использования этих preseparation методы включают низкую эффективность и высокие расходы, зависимость от одноклеточного суспензий, которые не могут быть подходящими для новых подходов тканевой инженерии и потенциального обесценения ячейки выживание и приживления.

Несколько исследований были рассмотрены варианты лечения, после формирования тератома. Возможно наиболее изученной стратегии является включение «самоубийства» генов в стволовые клетки^14,15. Этот метод предполагает, генетически манипулировать стволовых клеток для включения индуцибельной апоптоз активации генов, который может быть активирован фармакологических стимуляции postinjection, тем самым обеспечивая спасения подход, если вводили клетки производят тератомы. Этот подход, однако, страдает от существенных недостатков, включая эффекты пробить генетических модификаций ЦОНов и потенциал для постепенного развития наркотиков сопротивления¹⁶. Аналогичный подход использует малые молекулы побудить селективного клеточной гибели ЦОНов через ингибирование анти apoptotic пути¹⁷. Другие группы были направлены против смерти клетки ЦОНов с использованием антител против плюрипотентности поверхностных маркеров, такие как podocalyxin белка-1 (PODXL)¹⁸. Сроки доставки мелкомолекулярных или антитело стоит иметь значительное влияние на терапевтический потенциал Чок, если доставлено слишком рано и может отсутствовать терапевтической эффективности, если доставлен слишком поздно. Кроме того системные эффекты малых молекул и антитела, используемые в этой моде не были изучены.

Альтернативный подход к лечению этих опухолей опирается на использование внешний пучка излучения терапии (ДГТ). ДГТ является одним из основных механизмов, в настоящее время работают в лечении солидных опухолей¹⁹. Инновации в ДГТ, включая разработку наведение протонного луча и стереотаксической радиохирургии, позволили расширенной ориентации патологических структур избегая повреждения нормальной ткани, делая конформное ДГТ идеально подходит для решения тератома формирование в анатомически чувствительных структур²⁰. Кроме того этот метод позволяет избежать генетические манипуляции или вирусный трансдукции стволовых клеток, которые оба сопряжено с дополнительных клинических безопасности и эффективности касается¹⁵. Наконец достижения в микро Облучатели позволили применение ДГТ в грызунов²¹.

В этой статье мы продемонстрируем создание малых животных модели формирования тератома путем инъекций человеческого iPSCs в мышах. Затем показано, как применять ДГТ выборочно искоренить эти опухоли в естественных условиях с минимальным ущербом для окружающих тканей. Этот подход обеспечивает таргетная терапия для СМБ производные тератомы избегая пробить последствий системных доставки биологических молекул и пептиды и генетические манипуляции Чок. Для исследуемого целей мы предлагаем необязательный шаг передавать стволовых клеток с генами репортер отслеживать через биолюминесценции изображений (BLI) опухоли ответ к лучевой терапии.

протокол

Этот эксперимент животных была одобрена и выполняются институциональных Наблюдательный Совет и административный Группа на лабораторных животных уход в Стэнфордском университете.

1. клеточной культуры iPSCs

1. Расти человеческого iPSCs, получаемых лентивирусные перепрограммирования на 6-ну пластины с покрытием с базальной мембраны матрица (например, matrigel, называется матрица расписка).
2. Ежедневная смена СМИ iPSCs с обогащенной питательной среды (см. Таблицу материалы) инкубации при 37 ° C и 5% CO₂.
3. После того, как клетки достичь слияния 80 – 90% (примерно каждые 4 дня), добавьте 1 mL рекомбинантных клеток диссоциации фермента (см. Таблицу материалы) в хорошо и инкубировать при 37 ° C за 5 мин.
4. После 5 минут отмежеваться клетки из колодца, дозирование, передавать их на 15 мл и центрифуги на 300 x g.
5. После центрифугирования, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в обогащенных питательной среды (см. Таблицу материалы) обогащенный ингибитор Y27632 на 1:1,000 разрежения.
6. Выполните клеток, количество диссоциированных клеток и replate на ячейки матрицы покрытием 6-ну пластины на плотности тарелок⁵ 2 x 10-4 x 10⁵.

2. трансдукции iPSCs с двойной фьюжн Репортер ген

1. Прохождение iPSCs в 6-ну плиты в соответствии с обычной и добавить обогащенного питательной среды (см. Таблицу материалы) содержащий 6 мкг/мл hexadimethrine бромида.
   Примечание: Размер идеально колонии — 200 – 400 клеток/колонии для получения максимальной эффективности трансдукции.
2. Концентрат самостоятельно инактивирующего человека, перевозящих Светлячок Люцифераза и Зеленый флуоресцентный белок (флуктуации eGFP) обусловлен человека убиквитин promotor-C центрифугированием отложений с ротором SW-29 на 50 000 x g втечение 2 ч при 4 ° C.
3. Добавить вирусный концентрат iPSCs в 6-ну пластины на разносторонности инфекции (МВД) 10 и инкубировать на ночь при 37 ° C на 5% CO₂.
   Примечание: Обилие инфекции определяется выражением мономерных флуоресценции белков анализируемой флуоресценции активированный ячейку Сортировка сканирования (СУИМ).
4. Следующий день, удалите вирус центрифугированием iPSC 6-ну плит на 300 x g 6 мин при комнатной температуре.
5. Изменить средства массовой информации ежедневно с обогащенной питательной среды (см. Таблицу материалы) и проход в соответствии с протоколом. Используйте микроскопом для определения эффективности приблизительное трансдукции для eGFP флуоресценции.
6. КПД 30 – 40% является достаточным для сортировки СУИМ. Перейти к FACS hiPSCs, выражая eGFP, если по крайней мере 30 – 40% клеток выразить eGFP.
7. Для подтверждения активности флуктуации ex vivo, плиты клетки, выражая GFP, отсортированных по СУИМ на плотности тарелок 5 000 ячеек на хорошо.
8. Инкубировать transduced клетки и не преобразованы клетки (которые будут служить в качестве отрицательного контроля) с репортером биолюминесценции зонд D-Люциферин (100 мкмоль/Л) для 6 h. измерения биолюминесценции с spectrofluorometer Гонав.

3. трансплантация ЦОНов в спинной бочку для формирования тератома иммунодефицитных мышей

1. Добавьте 1 mL рекомбинантных клеток диссоциации фермента смеси на 6-ну пластину, содержащие человеческого iPSCs, преобразованы в культуре (см. раздел 2) с двойной фьюжн Репортер ген (флуктуации-GFP) и инкубировать в течение 5 мин.
2. После инкубационного периода разогнать клетки пипеткой аспирации и выражения. Добавить равное количество питательной среды и затем центрифуги на 250 x g на 4 мин.
3. После центрифугирования, аспирационная супернатанта решение, Ресуспензируйте Пелле клеток в 30 мкл матрицы и поместите его на льду сохранять свою жизнеспособность до инъекции. Подтвердите урожай 1 х 10⁶ клеток с помощью Горяева.
4. Если используя двойной фьюжн Репортер ген transfected клеток, приостановите двойной положительных клеток СУИМ (раздел 2) в 30 мкл матрицы.
5. Побудить анестезии в неделю 8-10 Атинические обнаженной мышей с использованием isoflurance 2% кислорода 1 Л/мин и затем использовать обслуживания 2% изофлюрановая с 1 Л/мин кислорода.
6. С помощью шприца 28,5 G, вставки ячейки/матрица смеси (см. Таблицу материалы) подвеска в подкожной пространство на фланге, направленных для инъекций в всего 5 x 10³ -5 х 10⁶ клеток (примерно 100 ul на инъекцию).
7. Рассмотрим более хвостового инъекции сайт, если вы планируете сохранить мышей для длительного периода времени и прогнозирования роста большой опухоли.
8. Наркотизированных животных разрешено восстановить на площадку с подогревом до амбулаторных (обычно < 1h) с мониторинг частоты дыхания, кожи цвет ног до амбулаторно.

4. биолюминесценции, Визуализация (BLI) пересаженные клетки для оценки выживаемость клеток и рост тератома

1. На нужную timepoints после прививки выполните внутрибрюшинной инъекции (IP) 375 мг/кг репортер зонда D-люциферин в мышей.
2. 10 мин после инъекции IP, изображение биолюминесценции сигнал на наркотизированных животных (выполняется, как описано в разделе Шаг 3.5) 30 мин, с использованием windows приобретение 1 мин интервалом 5-мин.
   Примечание: Рекомендуется загрузок изображения приобретений. Анестезия сохраняется во время визуализации, обеспечивая вдыхании изофлюрановая через носовой конус.
3. Для анализа данных нарисуйте региона интерес (ROI) над BLI сигнала и, затем, нормализуют время приобретения для количественного определения выбросов в единицах максимальная фотонов в секунду на квадратный сантиметр за стерадиан (/sr фотоны/s/см²).

5. тератома облучения с помощью доклинических изображение руководствуясь облучателя (рис. 1)

1. Анестезировать мышь в нокдаун коробку с помощью 2% изофлюрановая в 100% кислорода со скоростью потока 1 Л/мин. После того, как мышь полностью под наркозом, передача его в постели образ руководствуясь доклинические облучатель (см. Таблицу материалы). Поддержание анестезии на 2% изофлюрановая непрерывно через носовой конус.
2. Получить микро CT изображения как набор 400 проекции изображений свыше 360°, с использованием 40 kVp, 2 мА рентгеновского пучка и восстановить их в объемных изображений с изотропной пикселя размером 0,2 мм.
3. Планирование лучевой терапии с помощью микро КТ изображений с помощью программного пакета RT_Image (http://rtimage.sourceforge.net/) и выполнить лечение.
   Примечание: План лечения, используемый состоит из двух 225 kVp рентгеновских лучей, ориентированные пройти через поверхностные целевой тератома плинтуса поверхности остальнои мыши и щадящие базовой внутренностей. Время экспозиции для балок корректируются на основе ежеквартальных системы калибровки данных так, что доза в центре целевой опухоль была 6 гр.
4. Повторите процесс лечения на три дня подряд доставить целевых опухоли в общей сложности 18 гр.
5. Поддерживать стандартные после лечения, ухода за животными.

Результаты

Обычно вводится мышей продемонстрируют тератома роста формирования после 4 – 8 недель, как это подтверждается BLI изображений (рис. 2). Опухоли будет резко сокращаться при облучении с суммарной дозы 18 гр, один месяц после родов клеток, что приводит к значи?...

Обсуждение

Доклинические данные и анекдотические случаи от жертв «стволовых клеток туризма» подтверждают, что риск развития тератомы является серьезным недостатком, связанные с лечения PSC²³. Таким образом, развитие внимательного подхода для предотвращения и лечения опухолевой риск,...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Induced Pluripotent Stem Cell Control Line	Stanford University	Nguyen Lab	Cell culture of iPSC
Corning matrigel basement membrane matrix 354234	Fisher Scientific	CB-40234	Cell culture of iPSC
Essential 8 culture medium	ATCC-The global bioresource center	30-2203	Cell culture of iPSC
Tryple E	Gibco	12605-036	Cell culture of iPSC
Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)	Fisher Scientific	S104950MG	Cell culture of iPSC
Lentivirus	Cyagen	P170721-1001cjn	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Polyrbrene Infection/Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter	Stanford University	Sam Gambhir lab	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
D-luciferin	Perkin Elmer	122799	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI
Flow cytometer (BD FACSARIA III)	BD Biosciences	FACSAria	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)	Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA	GM2000	Transduction of iPSC with double fusion reporter gene
Xenogen IVIS 200	Perkin Elmer	124262	BLI
Isoflurane	Sigma-Aldrich	CDS019936	irradiation
X-Rad SmART image-guided irradiator	Precision X-ray Inc., North Branford, CT	X-Rad SmART	irradiation
RT_Image software package	Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)	RT_Image v0.2β	Irradiation