Количественная оценка деятельности гипопигментация в пробирке

Резюме

Мы опишем три экспериментальные методы для оценки деятельности гипопигментация химических веществ в пробирке: количественная оценка деятельности и 2) меланина содержание 1) сотовых тирозиназы и 3) измерение меланина сотовой меланина окрашивание и изображения анализа.

Аннотация

Это исследование представляет лабораторных методов для количественной оценки гипопигментация активность в лабораторных условиях. Меланин, основных пигмента в меланоцитов, синтезируется в ответ на несколько клеточных и экологических факторов. Меланин защищает клетки кожи от ультрафиолетового повреждения, но также биофизических и биохимических функций. Чрезмерное производство или накопление меланина в меланоцитов может вызвать дерматологических проблем, таких как веснушки, темные пятна, меланодермия и родинки. Таким образом у людей с клинической или косметических потребностями важен контроль меланогенеза с гипопигментация агентов. Меланин главным образом синтезируется в меланосомы меланоцитов в сложный биохимический процесс, называемый меланогенеза, которая находится под влиянием внешние и внутренние факторы, такие как гормоны, воспаление, возраст и ультрафиолетовых лучей. Мы опишем три метода для определения активности гипопигментация химических веществ или природных веществ в меланоциты: Измерение 1) сотовых тирозиназы активности и содержание меланина 2) и 3) пятная и количественного определения сотовой меланина с изображением анализ.

В меланогенеза тирозиназы катализирует тариф ограничивая шаг, который преобразует L-тирозин в 3,4-Диоксифенилаланин (л-дофа) и затем в допаквинон. Таким образом ингибирования тирозиназы — это основной гипопигментация механизм. В культивированный меланоцитов активность тирозиназы может быть определена количественно, добавляя l-допы как субстрат и измерения допаквинон производства методом спектрофотометрии. Меланогенеза может также измеряться путем количественной оценки содержание меланина. Меланин содержащих сотовой фракция добывается с NaOH и меланина количественно спектрофотометрически. Наконец может быть определена количественно содержание меланина, путем анализа изображений после фонтана-Masson пятнать меланина. Хотя результаты этих анализов в лабораторных условиях не всегда могут быть воспроизведены в коже человека, эти методы широко используются в меланогенеза исследований, особенно в качестве первого шага для выявления потенциальных гипопигментация активности. Эти методы могут также использоваться для оценки активности меланоцитов, роста и дифференцировки. Согласованные результаты с тремя различными методами обеспечения достоверности эффектов.

Введение

Melanin играет решающую роль в физиологии, патологии и токсикологии ряда органов, включая кожу, глаза и мозг¹. Основные функции меланина, Фото скрининг и биохимические эффекты. Меланин поглощает инфракрасный и видимый свет, а также ультрафиолетового (УФ) излучения, с показателями увеличения поглощения при более коротких длинах волн света; Таким образом меланин защищает ткани от повреждения, вызванные видимого света или ультрафиолетового излучения². Меланин является антиоксидантом и обладает сродством для металлов и других токсичных химических веществ; Таким образом он может защитить тканей от окислительного и химического стресса³. Однако чрезмерное производство меланина вызывает Дерматологические проблемы.

Количество и качество меланина в коже и радужки являются наиболее важными факторами, определяющими цвет радужной оболочки и кожу. Люди могут иметь разные кожи цветовые предпочтения; Некоторые пользу загорелой кожи, в то время как другие выступают светлее цвета кожи. В зависимости от этих профилей потребителя гипопигментация косметики были разработаны для удовлетворения индивидуальных рынков для благоприятствования кожи цвета⁴. Соответственно исследования гипопигментация и анти melanogenic деятельности являются важными научно и практически.

Меланогенеза — сложный процесс биосинтеза меланина через ряд ферментных и спонтанное химических реакций в меланоциты. Один меланоцит окружена примерно 36 кератиноцитов и меланоцитов являются заводы синтез меланина, которые распространяют их продукт для соседних кератиноцитов. В коже меланин производятся и хранятся в melanosomal отсеке меланоцитов транспортируется в соседних кератиноцитов эпидермиса через дендритов.

L-тирозин служит первоначальный субстрат для меланогенеза и фермента тирозиназы катализирует два последовательных реакций, которые преобразуют L-тирозин в 3,4-Диоксифенилаланин (ДОПЫ), а затем в допаквинон. Эти реакции являются тариф ограничивая шаг в меланогенеза^5,6. Соответственно деятельность гипопигментация сначала может измеряться путем оценки активности клеточных тирозиназы непосредственно. Чтобы сделать это, экстракты меланоцитов, содержащие тирозиназы инкубируют с ДОПЫ и допаквинон производится на образцах может измеряться методом спектрофотометрии на 475 Нм. Значения нормализованы по концентрации белка образцов и веществ с гипопигментация результат деятельности в формировании меньше допаквинон, по сравнению с контролем.

Во-вторых гипопигментация активность может быть определена количественно измеряя меланина в культивированный меланоцитов непосредственно. После обработки клеток с испытательным материалом, меланин добывается в щелочных условиях и содержание меланина количественно методом спектрофотометрии на 400 Нм. Агент гипопигментация приведет к более низким содержанием меланина, чем элементы управления⁷.

Наконец гипопигментация активность может быть квантифицировано фонтана-Masson меланина окрашивание и последующего анализа. В Fontana-Masson окрашивание, гранулы меланина уменьшить аммиака Серебряный нитрат видимое состояние черный металлик и черные области ячеек в микроскопических изображений представляют количество меланина.

Гипопигментация агент обычно дает результаты, последовательной и сопоставимой с помощью этих трех методов, которая подтверждает, что действие вещества является допустимым. Кроме того это может быть полезно для измерения выражение ключевых генов и белков в меланогенеза в ответ на тест вещество для изучения активности гипопигментация. Помимо тирозиназы важнейших ферментов в меланогенеза⁸являются Тирозиназа связанных белков (ГТО-1) и dopachrome tautomerase (ГТО-2). Транскрипционный фактор фактор транскрипции микрофтальмия связанные (MITF) является основной регулятор меланогенеза и количественная оценка ее уровни выражения гена/белков или промоутера деятельности пробирного также может использоваться для оценки деятельности гипопигментация.

протокол

1. Подготовка среднего, соединений и реагенты

1. Подготовка полного среднего роста B16F10. Дополнение Дульбекко изменение средних орла (DMEM) с 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% пенициллина/стрептомицина (ПЕШТ).
   1. Чтобы сделать 500 мл полного среднего, смешайте 445 мл среды Дульбекко изменение орла (DMEM) с 50 мл FBS и 5 мл вредителей в стерилизованные стеклянные бутылки 1 Л. После смешивания аккуратно, фильтр среды через фильтр верхней бутылки 0,2 мкм для новой стерилизованные стеклянные бутылки и затем хранить при 4 ° C.
      Предупреждение: Все методы культуры клетки должны проводиться в микробиологической безопасности кабинета с помощью асептического технику для обеспечения стерильности.
2. Подготовка буфера lysis: 20 мм трис (гидроксиметил) aminomethane, содержащие 0,1% тритон X-100 (v/v) буфера при pH 7.5 (рН скорректирована с HCl). Этот буфер может использоваться для 3 месяцев при хранении при комнатной температуре (RT). Добавление буфера lysis прямо перед использованием ингибиторов протеазы.
3. Подготовьте ингибитор тирозиназы аналитического буфера. Подготовка 1 M NaH₂PO₄ (монокальций) и 1 М Na₂HPO₄ (двухосновной) акций решения. Смешайте 46.3 мл Na₂HPO₄ и 53,7 мл NaH₂PO₄ подготовить окончательный объем буфера фосфат натрия 0,1 М (рН 6,8).
   1. Разбавьте полученную смесь до 1 Л (окончательный объем) с H₂O. Adjust pH 6.8 окончательного решения. Этот буфер может быть использован для 1 месяц при температуре 4 ° C.
4. Подготовка раствора субстрата тирозиназы: 0.1% 3,4-дигидрокси L-фенилаланин (ДОПЫ, w/v) растворяют в буфере пробирного ингибитор тирозиназы (обратитесь к шагу 1.3).
   ВНИМАНИЕ: Держите на льду во время использования.
5. При необходимости подготовьте 100 ед/мл грибов тирозиназы. Растворите лиофилизированные грибов тирозиназы в буфере пробирного ингибитор тирозиназы. Это решение может быть использован для 2 месяцев при температуре 20 ° с. Гриб тирозиназы деятельность, а также активность тирозиназы сотовой рассчитываются присутствии ячейки материалов.
   Предупреждение: Решение aliquoted до замораживания таким образом повторил, что можно избежать замораживания и оттаивания. Держите решение на льду во время использования.
6. Готовят раствор 1 N NaOH. Весят 4 г NaOH в объемном колбу и растворяют в дистиллированной воды, чтобы сделать 100 мл.
7. Готовят раствор фиксации (формалина 10%). Разбавьте 27 мл 37% формальдегида с 73 мл дистиллированной воды. Подготовьте свежий ежедневно.
8. Подготовьте аммиачный раствор серебра запасов. Подготовьте 5 мл 10% раствора нитрата серебра в объемном колбе. Добавьте раствор гидроксида аммония каплям, до тех пор, пока полностью не растворится осадок. Добавьте 200 мкл раствора нитрата серебра (10%). Решение станет немного облачно.
   Предостережение: Избегайте контакта и ингаляции. Использование вытяжного шкафа.
9. Подготовьте аммиачный раствор серебра рабочих. Разбавьте 2,5 мл раствора аммиачного серебра запасов с 7,5 мл дистиллированной воды. Использовать один раз и затем отменить.
   Предостережение: Избегайте контакта и ингаляции. Использование вытяжного шкафа.
10. Подготовьте хлорид 0,1% золота. Подготовка 1 мл 10% золота хлорида и добавить 99 мл дистиллированной воды в объемном колбе. Подготовьте свежий ежедневно.
11. Подготовьте фосфатный буфер (PBS). Добавьте 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄ и 0,24 г х₂PO₄ 800 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 с HCl. развести получившаяся смесь до 1 Л (окончательный объем) с дистиллированной водой.
12. Подготовьте 5% (w/v) раствора тиосульфата натрия растворяют в дистиллированной воде.

2. клетки культуры и лечение

1. Использование коммерчески доступных B16F10 клеток. Сохраняйте B16F10 клетки в полной среды. Хранить настой культуры клеток в увлажненные, 5% CO₂ атмосферы инкубатора 37 ° c.
2. Подготовка испытания соединений, ингибитор положительный контроль и отрицательных контрольных образцов.
   1. Растворите испытаний соединений в соответствующие растворители. Растворите водорастворимых соединений в двойной дистиллированной воды. Растворять нерастворимые соединения воды в соответствующих органических растворителей, например., ДМСО.
   2. Здесь используйте арбутин, растворенных в двойной дистиллированной воды (125 мкг/мл) как позитивный элемент управления для оценки активности гипопигментация, по сравнению с испытаний соединений или отрицательного контроля. Как негативное (контроль транспортного средства лечение), используйте решения или буферов, используемых в испытательный образец, например, двойной дистиллированной воды, ДМСО, этанола.
3. Заполнение ячеек и лечение
   1. Семя B16F10 клетки на 5 × 10⁴ клетки/также в 24-ну культуры пластины с помощью полного среднего и инкубировать в инкубатор CO₂ на 24 часа. После инкубации аспирационная полного среднего.
   2. Инкубируйте клетки с среде DMEM (без FBS и 1% пенициллина/стрептомицина) содержащий тест соединения, ингибитор управления или отрицательный контроль в CO₂ инкубатора для 72 ч. Проверка клетки каждые 24 ч под микроскопом. После этого шага чтобы выполните шаги 3-5 для дальнейших экспериментов.
      Предупреждение: Смесь из испытываемого вещества и среде DMEM следует процедить через фильтр 0.2 мкм.

3. измерение активности тирозиназы сотовой

1. С помощью метода, описанного в шаге 2, удалите СМИ и промойте клетки дважды 300 мкл холодной PBS.
2. Место пластину культуры клеток на льду. Добавить 300 мкл буфера lysis и инкубировать в течение 5 мин. Затем собрать клетки lysate клетки скребком и передачи lysate клетки пробки microcentrifuge 1,5 мл.
3. Однородный lysate клетки с ячейки гомогенизатор на 14 500 об/мин на 2 сек, 3 раза на льду для получения внутриклеточных тирозиназы. Используйте оптимальное состояние, специфичных для гомогенизатора.
4. Центрифуга для 10 мин на 12 000 × g при 4 ° C и передачи супернатанта клетки пробки microcentrifuge 1,5 мл. Держите на льду во время использования.
5. Передать 70 мкл супернатант 96-луночных ясно полистирола микроплиты.
6. Добавить 140 мкл раствора, содержащего тирозиназы субстрата (ДОПЫ) до 96-луночных ясно полистирола микроплиты, осторожно встряхнуть и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C.
7. Дополнительно, добавить 70 мкл грибов тирозиназы раствора 100 ед/мл для каждой скважины и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C.
8. Измерения активности тирозиназы на длине волны 475 Нм, используя Считыватель микропланшетов.
9. Нормализует активность тирозиназы концентрацию белка каждого образца. Измерьте концентрацию белка каждого образца assay Брадфорд.

4. Измерение содержание меланина

1. С помощью метода, описанного в шаге 2, удалите СМИ и промойте клетки дважды 300 мкл холодной PBS.
2. Место пластину культуры клеток на льду. Добавить 300 мкл буфера lysis и инкубировать в течение 5 мин. Затем собрать клетки lysate клетки скребком и передачи lysate клетки пробки microcentrifuge 1,5 мл.
3. Центрифуги для 10 мин на 12 000 × g при 4 ° C.
4. Передать новые концентрации общего белка трубки и меры для нормализации супернатант. Измерьте концентрацию белка каждого образца assay Брадфорд.
5. Добавить 300 мкл 1 N NaOH в каждом Пелле и Инкубируйте на 60 ° C в течение 1 ч.
6. Центрифуга для растворенных решение для 10 мин на 12 000 × g при 4 ° C.
7. Передать 96-луночных микропланшетов 200 мкл супернатант.
8. Измерить содержание меланина на длине волны 400 Нм.
9. Нормализуют содержание меланина к концентрации белка.

5. фонтана – Masson пятнать

1. Fontana-Masson пятнать
   1. Вымойте клетки дважды 300 мкл холодной PBS.
   2. Добавить 200 мкл формалина 10% для каждой скважины и инкубировать 1 час при 4 ° C.
   3. Промойте с дистиллированной водой.
   4. Добавить 200 мкл подогретым аммиачного серебра рабочего раствора и инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C или до тех пор, пока клетки становятся желто коричневый цвет.
      Предупреждение: Место свежезаваренным смешанные аммиачный раствор серебра рабочих в водяной бане 58 – 60° C и отвести достаточно времени для температуры сбалансировать.
   5. Удалите рабочий раствор аммиачного серебра и смойте дистиллированной водой.
   6. Удаление дистиллированной воды. Добавить 200 мкл хлорида 0,1% золота и проинкубируйте 2 мин на RT.
   7. Удаление 0,1% раствором хлорида золота и смойте дистиллированной водой.
   8. Удаление дистиллированной воды. Добавить 200 мкл раствора тиосульфата натрия (5%, w/v) и инкубировать в течение 2 мин.
   9. Удалить раствор тиосульфата натрия и смойте дистиллированной водой.
   10. Удаление дистиллированной воды. Добавить 200 мкл ядерной быстро красного и инкубировать в течение 5 мин.
   11. Удаление ядерных быстро красный и промыть водопроводной воды.
   12. Удаление водопроводной воды и наблюдать окрашенных клеток под микроскопом.
2. Fontana-Masson окрашивание (порог анализ с использованием ImageJ)
   Примечание: Пример процедуры анализа изображений, с помощью программного обеспечения ImageJ показан в дополнительных материалах.
   1. Откройте программу ImageJ.
   2. Выберите файл | Открытый | Микроскоп изображение.
   3. Выберите изображение, | Отрегулируйте | Цветовой порог.
   4. Измерить область, окрашенных с фонтана – Masson, равным нулю, панель параметров яркости и отрегулировать яркость панели, чтобы найти точку, в которую включены все окрашенные клетки (черный или темно-коричневый).
   5. Выберите анализировать | Анализ частиц. Установите флажок итоги в окне анализ частиц и нажмите OK. Получить резюме результатов и вставить в таблицу.
      Примечание: Описание результирующее поле параметров являются следующие:
      Фрагмент: Название каждого изображения
      Количество: Количество окрашенных клеток
      Общая площадь: Общая площадь подсчет клеток
      Средний размер: Общая площадь/Кол
      % Площади: Витражи Площадь/общая площадь × 100%; Общая площадь вычисляется автоматически.
   6. Рассчитать относительную площадь витражи с меланина, с использованием значения общей площади.
      Относительный меланина, окрашенных области (%) = значение сотовой площадь тестирования образца/Средняя общая площадь управления × 100, т.е.

Результаты

Представитель результаты деятельности гипопигментация арбутин, анти melanogenic соединения, в B16F10, меланоцитов приведены ниже. Рисунок 1A показывает, что арбутин значительно подавлена деятельность клеточных тирозиназы, по сравнению с элементом управления,...

Обсуждение

Мы представили протоколы для оценки гипопигментация активности тестирования соединений с помощью искусственного меланоцитов. Представитель результаты показали гипопигментация эффект арбутин, ингибитор тирозиназы, который препятствует тирозиназы активности и сотовых содержание м?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanine	Sigma	D9628
Ammonium hydroxide solution	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	#10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	#16223	37%
Gold chloride	American MasterTech	AHG0226	0.10%
HCl	Samchun chemical	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0.1% in 5% aluminum sulfate.
Penicillin and streptomycin solution	HyClone	SV30010
Silver nitrate	Duksan Pure Chemicals	#900
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Sodium phosphate monobasic (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Sodium thiosulfate pentahydrate	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Bio Basic Canada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase from mushroom	Sigma	T3824	25 KU