Поколения клеток человека первичных зародышевых клеток как на поверхности Embryoid органов от загрунтовать плюрипотентности индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Резюме

Первичных зародышевых клеток (PGCs) являются общие прекурсоров спермы и яйца. Человеческих эмбриональных PGCs указаны от плюрипотентных клеток Эпибласт через взаимодействия цитокинов. Здесь мы описываем протокол 13-дневный заставить клетки человека transcriptomally, напоминающие PGCs на поверхности embryoid органов от загрунтовать плюрипотентности индуцированных плюрипотентных стволовых клеток.

Аннотация

Первичных зародышевых клеток (PGCs) являются общие прекурсоров всех клеток микрофлорой. Эмбрионов мыши основателей население ~ 40 PGCs индуцированной из плюрипотентных клеток Эпибласт организовали подверженности цитокинов, включая костный морфогенетический белок 4 (Bmp4). В человеческих эмбрионов ранние PGCs были определены на стенках эндодермы желточного мешка примерно в конце 3-^й недели беременности, но мало что известно о процессе человеческого PGC спецификации и их раннего развития. Чтобы обойти технические и этические барьеры изучения человеческих эмбриональных PGCs, суррогатной клетки культуры модели были созданы недавно от плюрипотентных стволовых клеток. Здесь мы описываем 13-дневный протокол для надежной производства клеток человека PGC-Like (hPGCLCs). Человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSCs) поддерживается в состоянии загрунтовать плюрипотентности инкубировали в 4i наивными, перепрограммирование среднего за 48 часов, отделить в отдельные ячейки и упакованы в microwells. Длительное поддержание hiPSCs в состоянии плюрипотентности наивно вызывает значительные хромосомных аберраций и следует избегать. hiPSCs в microwells поддерживаются на дополнительные 24 часа в средне 4i формы embryoid органов (EBs), которые затем культивировали в низкой присоединение пластик под условие качания в среде индукции hPGCLC, содержащие высокую концентрацию Рекомбинантный человеческий BMP4. EBs далее культивировали на срок до 8 дней в качания, non сторонник условие для получения максимальной урожайности hPGCLCs. По иммуногистохимия hPGCLCs легко обнаруживаются как клетки, решительно выражая OCT4 в почти всех EBs исключительно на их поверхности. Когда EBs ферментативно отделить и подвергнут обогащению СУИМ, hPGCLCs могут быть собраны в CD38 + клетки до 40-45% доходность.

Введение

Первичных зародышевых клеток (PGCs) являются общие прекурсоров всех микрофлорой клеток в обоих полов. Большая часть наших знаний о развитии PGCs в млекопитающих эмбрионы были получены путем изучения лабораторных мышей^1,2. В эмбриональных день 6,0-6,5 зародышей мыши 6 или аналогичных небольшое количество прекурсоров PGC расположены в Эпибласт и основателей население ~ 40 PGCs индуцированной из них образом зависит от костных морфогенетических белков БМП2 и Bmp4, выделяется из прилегающих клетки. Ранних человека PGCs, пока установлено в эмбрионы были на стенках эндодермы желточного мешка в примерно в конце третьей недели гестации³. Потому что это то же место, как перенос PGCs наблюдаются в мыши эмбрионов, вполне вероятно, что наблюдаемое человека PGCs были на пути миграции, но не основателей населения. Однако, исследования, отслеживания обратно ранних стадиях PGCs или PGC пропали прекурсоров в человеческих эмбрионов.

Доступ к человеческих эмбриональных PGCs является сложной задачей из-за технических и этических препятствий. Чтобы преодолеть эти препятствия, PGC-подобных клеток культуры модели были созданы недавно от человеческих плюрипотентных стволовых клеток (Чок). Плюрипотентности является сотовой возможность дифференцировать в микрофлорой и три эмбриональных зародышевых⁴. Тогда как человека ЦОНов поддерживается в mTeSR1 среде (готовые к использованию, коммерчески доступных средний, разработаны для поддержания человеческого ЦОНов в государстве загрунтовать плюрипотентности) на блюда с белков внеклеточного матрикса покрытием имеют загрунтовать государство плюрипотентность ⁴, в 2013 году Якоб Hanna лаборатории показали, что загрунтовать плюрипотентности клетки могут быть преобразованы в состоянии плюрипотентности наивно, подвергая наивно носитель стволовых клеток человека (NHSM), содержащий химических ингибиторов протеинкиназы ERK1/2, GSK3, JNK, рок, Петропавловск, и p38 MAPK, а также факторы роста LIF, TGF, bFGF⁵. От человека ЦОНов наивно плюрипотентности в 2015 году исследовательская группа, возглавляемая Ханна и Azim Surani осуществляется первый надежный производство клеток человека PGC-Like (hPGCLCs) от Чок⁶. Позже несколько других лабораторий, в том числе наша, сообщил поколения hPGCLCs от Чок, используя несколько различных протоколов^7,8,9,10. Наше исследование представил доказательства того, что hPGCLCs, созданный с использованием различных протоколов (которые резюмируются в таблице S1 из наших ранее опубликованные исследования¹⁰) являются transcriptomally аналогичны друг другу¹⁰. Имеющиеся доказательства подтверждают сходство человека PGCLCs в ранней стадии человеческих эмбриональных PGCs до глобальной эпигеномные стирания⁷ или¹⁰эозинофилов миграции.

Исследования мыши эмбриональные PGCs, мыши PGCLCs и человека PGCLCs (но с лишь весьма ограниченный доступ к человеческой PGCs) показали, что молекулярные механизмы PGC спецификации значительно отличаются между мышью и человека^{1,6, 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ,17}. Например Prdm14 играет важнейшую роль в спецификации PGC в эмбрионов мыши, но его роль в человека PGC спецификации кажется ограниченное^1,15. В отличие от индукции SOX17 на EOMESODERMIN имеет важное значение для PGC Спецификация^6,11,14, в то время как эти факторы транскрипции показаться необязательным для мыши PGC спецификации¹⁵. Эти первоначальные успехи исследований с использованием hPGCLCs решительно поддерживают важность этой модели культуры клеток как суррогат человеческих эмбриональных PGCs.

Недавно опубликованные исследования с участием нашей лаборатории глубокую последовательности оценки геномной ДНК копии номер анализа, показали, что длительное ведение ЦОНов в государстве плюрипотентности наивно значительно увеличивает риск хромосомной нестабильности и структурные аномалии. Это явление было отмечено с мыши¹⁸ и человека¹⁹ УИК. Исходный протокол производства hPGCLC, сообщает Ханна/Сурани был разработан для человека Чок, поддерживается в среде плюрипотентности наивно 4i для по крайней мере 2 недели⁶. Для сохранения нормальной диплоидных кариотипа человека ЦОНов и PGCLCs, мы разработали измененный Протокол, в котором человека ЦОНов подвергаются 4i средством лишь 72 часов¹⁰, которая представлена в этой статье. Человеческого iPSCs (hiPSCs) поддерживаются под загрунтовать плюрипотентности государства. Непосредственно перед EB формирования клетки инкубируют в 4i наивно перепрограммирования среднего (изменение NHSM средний) на 48 часов. Клетки затем отделить и упакованы в microwells форме EBs на дополнительные 24 часа в среде 4i. EBs поддерживаются в среде индукции hPGCLC, содержащие высокую концентрацию рекомбинантного человеческого BMP4 под условие качалки для без вложение культуры на срок до 8 дней получить максимальный доход по hPGCLCs. После 8-день культуры EB hPGCLCs может быть изолирована от диссоциированных EB клеток СУИМ, как CD38 + клеток с до ~ 40% доходность в СУИМ сортируемыми одноклеточного подвеска. В то время как другие опубликованные методы^,78,9, включая оригинальный протокол перед нашей модификации⁶, обычно генерируют hPGCLCs в спонтанно сформированных клеток агрегатов без конкретных Локализация, hPGCLC, производимые нашей протокола наблюдаются на поверхности embryoid органов (EBs).

протокол

1. клеточной культуры hiPSCs в состоянии ПРИМЕД плюрипотентность

1. Приготовление блюд покрытием белков внеклеточного матрикса
   1. Оттепель Matrigel (белков внеклеточного матрикса) на льду в холодильник или холодной комнате на ночь (не разморозить при комнатной температуре или с помощью ванну теплой водой). Аликвота матрица белка (~ 200 мкл; объем Алиготе определяется заводом-изготовителем для каждого пакета и указано на этикетке флакона) в стерильных низким свяжите пробирок или трубы криоконсервирования клеток на льду. Важно сохранить белков внеклеточного матрикса ледяной во время отпуска избежать затвердевания. Хранить аликвоты-80 ° c.
   2. Чтобы покрыть клетки культуры пластиковые блюда с белков внеклеточного матрикса, разбавить одну Алиготе с 25 мл ледяной среде DMEM/F12 и распространение трех блюд 10см (~ 8 мл/блюдо). Инкубируйте блюд при комнатной температуре по крайней мере 1 час. После покрытия, блюда могут быть закрыты с использованием парафина и хранятся при комнатной температуре до одной недели.
   3. Аспирационная среднего от блюда непосредственно перед прививок загрунтовать плюрипотентности hiPSCs. Не стоит мыть посуду с покрытием с средний или кальция/магния свободный фосфат амортизированное saline [PBS(-)].
2. Начало hiPSC культуры в состоянии загрунтовать плюрипотентность
   1. Добавьте 2 мкл 50 мм Y27632 [ингибитора киназы Ро связанные белком (рок)] 10 мл mTeSR1 среды в 15 мл пластиковых пробирок. Подготовьте две трубы рок ингибитор дополнить 10 мл среды инициировать культуры клеток в одном блюде 10 см от 1 мл замороженных клеток складе. Использование Y27632-дополнено средней в тот же день. Prewarm Y27632-дополнено средней в ванну воды 37 ° C за 5 мин.
      Примечание: Этот протокол работает хорошо с hiPSCs в mTeSR1. Когда hiPSCs ведутся в других средствах массовой информации, поддерживая рост человека PSC с различной степенью загрунтовать или наивно плюрипотентности, доходность hPGCLCs значительно варьируется.
      Примечание: Полный mTeSR1 срок годности — 2 недели при температуре 4 ° C и 6 месяцев при-20 ° C, но повторного замораживания причины низкой производительности. Мы замираем 40 мл аликвоты mTeSR1 при-20 ° C до использования.
   2. Оттепель флакон загрунтовать плюрипотентности hiPSC замороженные фондовой (1.0-3.0 х 10⁶ клеток в 1 мл криоконсервирования среднего) с помощью ванну воды 37 ° C. Сразу же после завершения оттаивания перенесите все содержимое флакона в одну трубу (10 мл) разогретую дополнены Y27632 среды.
   3. Суспензию клеток центрифуги при комнатной температуре, 300 x g 8 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток с 10 мл подогретую дополнены Y27632 от другой трубки.
   4. Равномерно суспензию клеток в внеклеточная матрица белка покрытием 10 см блюдо. Поместите блюдо в tri газ CO₂ инкубатора (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Сохранение культуры hiPSC под давлением низким содержанием кислорода.
   5. Изменение среднего (mTeSR1 без Y27632) каждый день. Ингибитор рок (Y27632) имеет решающее значение для выживания hiPSC сразу же после диссоциации в отдельные ячейки. После того, как hiPSCs присоединиться на поверхности покрытием белков внеклеточного матрикса равномерно малые агрегаты с > 10% confluency (который обычно завершается в течение 16 часов после прививки), Y27632 необязательным. Слишком рано среднего изменения после инокуляции диссоциированных hiPSCs без Y27632 может привести к почти полной клеточной смерти.
3. Passaging заливают плюрипотентность hiPSCs
   Примечание: Проход заливают плюрипотентности hiPSCs, когда колонии занимают ~ 80% области эффективного роста. Правильные процедуры, пассированый и плотности имеет важное значение для экспериментальных воспроизводимость. Мы видели, что эффективность hPGCLC индукции не значительно отличаются между культурами hiPSC 6 дней после возбуждения из замороженных запаса (с участием одного или двух проходов) или один месяц (с участием > 10 ходов). Индукции hPGCLC был успешно выполнен из hiPSCs для более чем двух месяцев, хотя не было количественно оценить эффективность.
   1. Взять 4 мл смеси ферментов диссоциации клеток в 15 мл пластиковых пробирок и сбалансировать к комнатной температуре в течение 5 мин.
   2. Prewarm 10 мл PBS(-) в центрифуге 15 мл трубки для > 5 минут при 37 ° C на водяной бане.
   3. Мкл 2 50 мм Y27632 (рок ингибитор) средний mTeSR1 10 мл в пластиковых 15 мл пробирок. Подготовить две трубы рок ингибитор дополнить 10 мл среды и использовать в тот же день. В другом 15 мл пластиковых пробирок Возьмите 5 мл mTeSR1 без добавления Y27632. Prewarm средний + / Y27632 в ванну воды 37 ° C за 5 мин.
      Примечание: Все средних аликвоты, подготовленную на этапе 1.3.3 может содержать Y27632.
   4. Аспирационная старой среды от 10 см блюдо и промыть клетки один раз с подогретую 10 мл PBS(-). Отменить PBS(-) и добавить 4 мл диссоциации фермента в блюдо. Поместите блюдо в инкубатор CO₂ (tri Газовый инкубатор работает, но не обязательно) для ~ 4 мин до тех пор, пока клетки отсоединить от дна. Аккуратно накапайте клетки вверх и вниз, чтобы сделать одну ячейку подвеска.
   5. Передача hiPSC одноклеточных подвеска в подогретую трубка, содержащая 5 мл среды без Y27632 (общий объем в 15 мл трубки составляет около 9 мл). Суспензию клеток в центрифуге при комнатной температуре, 300 x g 8 мин.
   6. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток с 10 мл подогретую средних среды, содержащие Y27632.
   7. Удалить ячейки агрегатов с помощью стрейнер клетки 40 мкм и определить плотность клеток с помощью сошника счетчика.
   8. Разбавления суспензии клеток с подогретую дополнены Y27632 средством для достижения 3.0 х 10⁶ клеток в 10 мл для инокуляции внеклеточная матрица белка покрытием 10 см блюдо. Место привитых блюдо в tri газ CO₂ инкубатора (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂).
   9. Изменение среднего (mTeSR1 без Y27632) каждый день.

2. поколение hPGCLCs

Примечание: Инициировать следующие шаги, когда hiPSC клетки в 10 см блюдо (mTeSR1 средний, внеклеточная матрица белка покрытием) достигает ~ 80% confluency (приблизительно 10⁷ клеток).

1. Приготовление блюд покрытием белков внеклеточного матрикса (1 день)
   1. Размораживание одного Алиготе белков внеклеточного матрикса на льду и разбавленных в 25 мл ледяной среде DMEM/F12.
   2. Отказаться от разбавленных внеклеточная матрица белка для 6-ну пластин (1 мл/хорошо). Один Алиготе достаточно, чтобы покрыть 24 скважин (4 пластины). Инкубируйте пластины при комнатной температуре по крайней мере 1 час. Неиспользуемые пластины с покрытием можно опечатаны и храниться при комнатной температуре до одной недели.
   3. Аспирационная среднего из плит непосредственно перед прививок загрунтовать плюрипотентности hiPSCs. Не стоит мыть посуду с покрытием с средний или PBS(-).
2. Прививок загрунтовать плюрипотентности hiPSCs в внеклеточная матрица белка покрытием пластин (1 день)
   1. Возьмите 4 мл фермента диссоциации клеток в 15 мл пластиковых пробирок и сбалансировать к комнатной температуре 5 мин.
   2. Prewarm 10 мл PBS(-) в центрифуге 15 мл трубки для > 5 минут при 37 ° C на водяной бане.
   3. Мкл 7 50 мм Y27632 (рок ингибитор) средний mTeSR1 35 мл в 50-мл пластиковых пробирок. Использование Y27632-дополнено средней в тот же день. Сделать две трубы для всего 70 мл Y27632-дополнить средне и prewarm среды в ванну воды 37 ° C 15 мин.
   4. Аспирационная старой среды от 10 см блюдо и промыть клетки один раз с подогретую 10 мл PBS(-). Отменить PBS(-) и добавить 4 мл фермента диссоциации клеток на блюдо. Поместите блюдо в инкубатор CO₂ (tri Газовый инкубатор работает, но не обязательно) для ~ 4 мин до тех пор, пока клетки отсоединить от дна. Аккуратно накапайте клетки вверх и вниз, чтобы сделать одну ячейку подвеска.
   5. Передача hiPSC одноклеточных подвеска в подогретую трубка, содержащая 10 мл Y27632-дополнено средней. Суспензию клеток в центрифуге при комнатной температуре, 300 x g 8 мин.
   6. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток с 10 мл подогретую дополнены Y27632 среднего.
   7. Фильтр суспензию клеток через стрейнер клетки (размер пор 40 мкм) удалить ячейки агрегатов и подсчитать ячейки, используя счетчик сошника.
   8. Развести hiPSC подвеска одноклеточного до 5,0 x 10⁶ клеток в разогретую Y27632-дополнить среде 50 мл.
   9. Прививать 2 мл суспензии клеток (2,0 x 10⁵ клеток) в каждой скважине пластины с покрытием 6-хорошо (4 тарелки, 24 скважин). Убедитесь, что ячейки равномерно распределены в каждой скважине. Поместите пластины для культуры клеток в tri газ CO₂ инкубатора (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂).
      Примечание: Плотность клеток посевным материалом и равномерное распределение в каждом также имеет решающее значение. Потому что прививки hiPSCs в 10 см блюда может привести к значительно более высокие плотность клеток, чем в других областях. Даже плотность клеток из одной ячейки hiPSCs может быть достигнуто легче с 6-ну пластинами.
   10. Изменение средних с 2 мл/хорошо mTeSR1 (без Y27632) 24 часов после прививки.
3. Преобразование hiPSCs государство загрунтовать плюрипотентности 4i-наивно (Эрк независимая) плюрипотентных клеток (день 3 и 4 дня)
   1. Подготовить 4i полный наивно плюрипотентности среднего в 50-мл пластиковых пробирок следующим образом (день 3 и 4 день): 50 мл 4i базальной средний, 5 мкл 30 мм CHIR99021, 5 мкл 10 мм PD0325901, 5 мкл 20 мм BIRB796, 5 мкл 50 мм SP600125 и 5 мкл 50 мм Y27632.
      Примечание: Хранить 4i базальной средне-80 ° C и оттаивания в холодильнике всю ночь. Подготовьте свежие 4i полного среднего непосредственно перед использованием. Избегайте воздействия химических веществ 4i (ЧИР, PD, BIRB и SP) сильный свет. Не храните 4i полного среднего на 4 ° C или замороженные на ночь или дольше.
   2. Подогретую теплый 50 мл 4i полного среднего в пакете воды 37 ° C для среднего изменения 15 мин с 4i полного среднего (2 мл/хорошо) 48 и 72 часов после прививки. Точное время среднего изменения имеет важное значение для достижения высокой hPGCLC урожайность и экспериментальной воспроизводимость.
      Примечание: Плотность культуры hiPSC 4i высокой под это условие и стать вырожденная 48-72 часов после прививки, но это нормально.
4. EB формирование с помощью микрорезервуар пластины (день 5)
   1. Подготовка 50 мл 4i полной среды в 50-мл пластиковых пробирок и prewarm его в ванну воды 37 ° C ~ 15 минут перед использованием.
   2. Prewarm 35 мл DMEM/F12 в 50-мл пластиковых пробирок в ванну воды 37 ° C ~ 15 минут перед использованием.
   3. Подготовить микрорезервуар пластины
      1. Добавить 5% (w/v) фильтр стерилизовать плюрониевого F-127 моющее средство в 8 активных скважины микрорезервуар плиты (см. Таблицу материалов; 0,5 мл/хорошо).
      2. Центрифуга микрорезервуар пластины при комнатной температуре, 1000 x g, для 5 минут проверить microwells с инвертированным микроскопом обеспечить отсутствие воздушных пузырьков. Оставьте пластину микрорезервуар на 30 минут при комнатной температуре, чтобы покрыть microwells с моющим средством.
      3. Отменить моющем растворе из скважин микрорезервуар пластины, закупорить и промывки скважин с подогретую DMEM/F12 (2 мл/хорошо).
      4. Центрифуга микрорезервуар пластины при комнатной температуре, 1000 x g для 5 минут проверить microwells с инвертированным микроскопом обеспечить отсутствие воздушных пузырьков.
         Примечание: Когда пузырьки воздуха по-прежнему наблюдаются в microwells, проверьте, если по-прежнему твердо микрорезервуар лист приклеивается на дно колодца.
      5. Отменить среде DMEM/F12 от скважин микрорезервуар пластины, закупорить и промывки скважин с подогретую DMEM/F12 (2 мл/хорошо).
      6. Повторите шаги 2.4.3.3 - 2.4.3.4.
      7. Добавьте 4i полного среднего в Промыть лунки микрорезервуар плиты (1 мл/хорошо). Держите оставшиеся 4i полного среднего в ванну воды 37 ° C.
      8. Центрифуга микрорезервуар пластины при комнатной температуре, 1000 x g для 5 минут проверить microwells с инвертированным микроскопом обеспечить отсутствие воздушных пузырьков.
      9. Поместите микрорезервуар пластину в tri Газовый инкубатор (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂) до прививки 4i hiPSCs.
   4. Прививки 4i iPSCs в микрорезервуар плиту
      1. 13 мл фермента диссоциации клеток в 15 мл пластиковых пробирок и сбалансировать к комнатной температуре в течение 5 мин.
      2. Prewarm 50 мл PBS(-) в центрифуге 50 мл трубки для > 5 минут при 37 ° C на водяной бане.
      3. Аспирационная старые среднего из 24 скважин наивно hiPSC клетки культуры и промыть клеток раз с подогретую 2 мл/хорошо PBS(-). Отменить PBS(-) и добавить 0,5 мл/хорошо диссоциации фермента. Поместите пластины культуры клеток в CO₂ инкубатора (37 ° C) для ~ 4 мин до тех пор, пока клетки отсоединить от дна. Аккуратно накапайте клетки вверх и вниз, чтобы сделать одну ячейку подвеска.
      4. Передачи hiPSC одноклеточных подвеска подогретую 20 мл 4i полного среднего. Суспензию клеток в центрифуге при комнатной температуре, 300 x g 8 мин.
      5. Отменить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток с 5 мл подогретую 4i полного среднего.
      6. Фильтр суспензию клеток через сито клетки (размер пор 40 мкм), чтобы удалить ячейки агрегатов. Ситечко вымыть клетки 3 раза с 1 мл подогретую 4i полного среднего. Подсчитать ячейки, используя счетчик сошника.
      7. Разбавьте одну ячейку подвеска 4i наивно hiPSCs для 27,0-32,4 х 10⁶ клеток в 9 мл подогретую 4i полного среднего. Обратите внимание, что в полного среднего что 4i уже содержит Y27632.
      8. Возьмите микрорезервуар пластины, содержащие 1 мл 4i полной среды в 8 хорошо от tri Газовый инкубатор (2.4.3.9). Прививать 1 мл 4i наивно hiPSC подвеска (3,0-3,6 х 10⁶ клеток/хорошо) в каждой скважине. Эта плотность клеток имеет решающее значение. Убедитесь, что ячейки равномерно распределены в каждой скважине, нежно закупорить.
      9. Центрифуга микрорезервуар пластины при комнатной температуре, 100 g x 3 мин.
      10. Место пластину микрорезервуар в tri газ CO₂ инкубатора (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Не беспокоить гранулированных в microwells клетки. Инкубации клеток для 24-30 часов. Ночи инкубации (~ 16 часов) обычно недостаточно для формирования жесткой EBs.
5. Передача EBs низкой крепежные пластины для качания культуры (день 6)
   1. Подготовка полного среднего hPGCLC в 50 мл пластиковых пробирок следующим образом (6 день - день 13):
      20 мл hPGCLC базальную средний, 4 мкл 50 мкл 20 мг/мл L-Аскорбиновая кислота, 4 мкл 50 мм Y27632, 50 мкл 100 мкг/мл и 500 мм 2-меркаптоэтанол рекомбинантного человеческого BMP4, 4 мкл 500 мкг/мл человека SCF, 4 мкл 250 мкг/мл человека EGF и 8 мкл 250 мкг/мл человека LIF.
      Примечание: Подготовьте свежие hPGCLC полного среднего непосредственно перед использованием и избегать воздействия света. Не храните hPGCLC полного среднего на 4 ° C или замороженные на ночь или дольше.
      Примечание: Очень высока концентрация BMP4. Оптимальная концентрация BMP4 могут отличаться между сериями BMP4. Лот для лота разница BMP4 сильно влияют на hPGCLC производство. В отсутствие BMP4 в среде полного hPGCLC выход hPGCLCs является очень низкой⁶. Важность других цитокинов в средне-полной hPGCLC был описан Ханна/Сурани⁶.
      Примечание: В настоящем Протоколе, конечная концентрация человека LIF в средстве полного hPGCLC-100 нг/мл^6,10. Конечная концентрация LIF, используется в ранее опубликованных исследований, в том числе наша, был 1 мкг/мл. Удельная активность человека LIF реагента при > 10000 единиц/мкг (Эд₅₀ < 0.1 нг/мл), 100 нг/мл LIF достаточно для поддержки hPGCLC поколения от EBs.
   2. Передача EBs
      1. Prewarm 5 мл hPGCLC базальную среднего и полного среднего 20 мл hPGCLC для > 5 минут при 37 ° C на водяной бане.
      2. Осторожно поместите стрейнер ячейки вниз на вершине 50 мл полипропиленовые Конические трубки.
      3. Накапайте каждой скважины микрорезервуар пластина очень осторожно пластины для отсоединения EBs от microwells. Фильтр все содержимое каждой скважины через ячейку сито, чтобы удалить клетки, не включены в EBs.
      4. Вымойте EBs сохранил на клетки ситечко с 1 мл базальную подставьте hPGCLC среды. Аккуратно мыть, повторите 5 раз.
      5. Промывают EBs теперь сохраняются на мембранный фильтр, который находится на 50 мл конические вверх вниз. Место свежий 50 мл конические пробки на сито клетки, так что ситечко клетки обычно располагаются в новой трубки. Затем быстро Инвертируйте клетки ситечко с новой трубки. Сетчатый фильтр клеток и трубки в настоящее время в нормальных условиях, и EBs ниже мембраны клеток ситечко.
      6. Соберите EBs в коническую пробирку, добавив 18 мл подогретую hPGCLC полного среднего сверху мембраны клеток сетчатый фильтр. Таким образом средний будет идти через мембрану и собирать EBs, крепится на нижней стороне мембраны вниз к нижней части пластиковых пробирок.
      7. Пластина подвеска EBs в скважины пластины 6-ну Низкий насадку (3 мл/хорошо).
      8. Место пластину Низкий насадку на качелях перемещение рокера в tri Газовый инкубатор (37 ° C, 6,5% O₂, 5% CO₂). Установите скорость качания на ~ 20 оборотов в минуту.
         Примечание: Не применять закрученного движения, потому что EBs агрегат в центре колодцев и предохранитель. Таким образом, чтобы не объединять EBs тщательно регулировать скорость качания. Слишком активная качания физически повредит EBs.
         Примечание: Давление низкое кислорода настоятельно рекомендуется для культуры EB.
6. Поколение hPGCLCs на поверхности EBs (день 7 - 13 дней)
7. Свеже Подготовьте 20 мл hPGCLC полного среднего каждый день. Без качания, EBs будет опускаться, в нижней части скважины в ~ 1 мин удалить старые среде без сушки EBs (~0.2 мл/ну старый среднего может оставаться) и добавить свежие hPGCLC полного среднего каждый день (3 мл/хорошо).

3. иммуногистохимическое окрашивание EBs (10 день – день 13)

1. Встраивание EBs в блоки белков внеклеточного матрикса для формальдегида исправлена, парафин врезанных иммуноокрашивания (FFPE)
   1. Для выявления hPGCLCs как OCT4⁺ клетки, урожай EBs в 1,5 мл низким свяжите microcentrifuge. Пусть EBs опускаться на дно или кратко центрифуги (2 секунды) при комнатной температуре и отказаться от среднего. Промойте EBs с ледяной PBS(-).
   2. Удаление PBS(-) и инкубировать EBs в 1 мл ледяной 1%(w/v) азид натрия в PBS(-) за 5 минут на льду. Пусть EBs опускаться на дно или кратко центрифуги (2 секунды) при комнатной температуре. Отменить супернатанта и промойте EBs с ледяной PBS(-).
      Примечание: Добавление азид натрия замедляет ухудшение внутриклеточных белков и РНК стенограммы.
   3. Оттепель 200 мкл белков внеклеточного матрикса на льду и добавить microcentrifuge трубка, содержащая EBs. Оставьте трубки при комнатной температуре ~ 10 мин, до тех пор, пока гель затвердевает.
   4. Добавить 1 мл 4% формальдегида в PBS(-) и инкубации при комнатной температуре в течение 15 минут с плавное покачивание.
      Примечание: Оба EBs и белков внеклеточного матрикса фиксируются во время этого шага. Без фиксации гель блоки могут разлагаться в процессе обезвоживания. Если предварительно фиксированной EBs, внедренные в блоке гель, EBs устанавливаются снова с блоком гель и может быть чрезмерно фиксированным.
   5. Отменить формальдегид и промойте EBs с ледяной PBS(-). Добавьте 1 мл 70% этанола. Гель встроенный EBs могут храниться в 70% этанол на 4 ° C на одну неделю.
   6. Процесс гель встроенный EBs с стандартный протокол FFPE. Подготовьте 5 мкм толщина FFPE слайды. Пусть слайды высохнуть на ночь и хранить их при комнатной температуре до иммуноокрашивания.
      Примечание: Наши обычные FFPE протокол является следующим: 70% этанол, два изменения, 1 час каждый; 80% этанола, одно изменение, 1 час; 95% этаноле, одно изменение, 1 час; 100% этанола, три изменения, 1,5 часа каждая; ксилол, три изменения, 1,5 часа каждая; Парафин (58-60 ° C), два изменения, 2 часа. Обезвоженный тканей встроен в парафиновые блоки и разрезать на 3-10 мкм (обычно 5 мкм).
   7. Для окраски, полностью сухой слайды в 56 ° C духовке в течение по крайней мере 30 мин Deparaffinize и гидрата слайды с ксилолов и градуированных алкоголя серии. Затем промойте слайды в проточной воде в течение 5 мин.
   8. Чтобы деактивировать эндогенной пероксидазы, Инкубируйте Регидратированные слайды с BLOXALL блокирования решения при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем промойте слайды с PBS на 5 мин.
   9. Блок слайды с нормальной сыворотки лошадь (или нормальной сыворотки других видов создаются вторичные антитела) при комнатной температуре в течение 20 мин.
   10. Инкубируйте слайды с основного антитела анти OCT-3/4 козы, разбавляют 0,1% BSA в PBS(-) на 4 ° C на ночь (оптимизация разрежения и инкубации условия для каждого основного антитела). Затем промойте слайды с PBS(-) три раза при комнатной температуре, 5 мин.
   11. Инкубируйте слайды с анти коза, IgG (хрена конъюгированных с пероксидазой вторичное антитело порожденных лошадь; см. Таблицу материалов) при комнатной температуре за 30 мин. Затем промойте слайды с PBS(-) три раза при комнатной температуре, 5 мин.
   12. Смешать необходимые суммы DAB, окрашивание поверхностей (см. Таблицу материалы) непосредственно перед использованием и инкубировать слайды в полной DAB, окрашивание раствора при комнатной температуре в течение 5 минут монитор DAB окрашивание с помощью инвертированного микроскопа и остановить реакции Когда OCT4⁺ клетки визуализированы промыв быстро слайды в проточной водопроводной воды.
   13. Обезвоживает слайды с градуированной алкоголя и ксиленов серии. Лазер захват microdissection готовы слайды. Подготовить постоянный FFPE слайды с помощью установки среднего (см. Таблицу материалы) с высоким разрешением микроскопические наблюдения.

4. СУИМ обогащение hPGCLCs от EBs (10 день – день 13)

1. Подготовка смесь фермента Embryoid диссоциации сопл
   1. Подготовьте фермент смесь 1, добавляя 50 мкл фермента P 1900 мкл буфера X и вихря. Prewarm фермент смесь 1 в 37 ° C водяной бане 15 мин.
   2. Подготовьте фермент смесь 2, добавив 10 мкл энзим A 20 мкл буфера Y.
   3. Смешайте фермента смесей 1 и 2 подготовить полный микс фермента диссоциации EB.
2. Разъединять EBs
   1. EBs урожая от низкой крепежные пластины и центрифуги при комнатной температуре в 15 мл пластиковых пробирок, 300 x g на 2 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте EBs с 10 мл PBS(-). Центрифуга снова.
   2. Отменить супернатант и Ресуспензируйте EBs с полным EB диссоциации фермент смесь (4.1.3). Инкубируйте EB подвеска в ванну воды 37 ° C 15-20 мин, пока отделить EBs. Во время инкубации, нежно накапайте EBs на каждые 3-5 мин для облегчения диссоциации. Кроме того использование автоматизированных диссоциатором Embryoid тела диссоциации программе.
   3. Добавьте ледяной 8 мл PBS(-) диссоциированных суспензию клеток EB. Фильтр суспензию клеток через стрейнер клетки 40 мкм. Ситечко вымыть клетки с 1 мл ледяной PBS(-) три раза.
   4. Подсчитать ячейки в суспензию отфильтрованных клеток с помощью сошника счетчика.
   5. Центрифуга суспензию клеток на на 4 ° C, 300 x g 8 мин и удалить супернатант. Ресуспензируйте Пелле клеток с ледяной 10 мл PBS(-).
   6. Суспензию клеток делят на две трубы, одна для управления без окрашивание (~ 10⁵ клеток), а другой для анти CD38 окрашивание (все остальные клетки).
   7. Центрифуга две трубы на 4 ° C, 300 x g 8 мин.
3. Анти-CD38 окрашивание и СУИМ обогащение hPGCLCs
   1. Ресуспензируйте Пелле ячейки для без окрашивание управления с 200 мкл ледяной 3% (w/v) BSA и азид натрия 1% (w/v) в PBS(-). Место на льду до проточной цитометрии.
      Примечание: Добавление азид натрия замедляет интернализации CD38 от клеточной поверхности.
   2. Ресуспензируйте Пелле ячейки для анти CD38 окрашивание с ледяной 3% (w/v) BSA и азид натрия 1% (w/v) в PBS(-) 1 x 10⁶ клеток / 100 мкл.
   3. 10 мкл за 1 х 10⁶ клеток СУИМ-сорта, антитело проспряганное APC анти CD38. Обложка трубы с алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия на свет. Инкубируйте на 4 ° C на 45 мин с плавное покачивание.
   4. Добавьте 5 мл ледяной PBS(-) и центрифуги на 4 ° C, 300 x g 8 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте клеток окатышей с 5 мл ледяной PBS(-). Повторите мыть с PBS(-) три раза в общей сложности.
   5. Ресуспензируйте Пелле клеток с 500 мкл ледяной 3% (w/v) BSA и 1% (w/v) азид натрия в PBS(-) плотность клеток, достаточное для СУИМ.
   6. Обогатить hPGCLCs как CD38⁺ клетки, которые обычно образуют населения четко выделяются ячейки. Без окрашивание управления используется для обеспечения идентификации CD38⁺ клеток. Типичный выход hPGCLCs являются 1-5% от всех СУИМ рассмотрены отдельные ячейки от EBs день 10 и 20-40% от EBs 13 день.

Результаты

Пластину микрорезервуар используется здесь в формате 24-хорошо и имеет 8 скважин, проведение микрорезервуар листов, каждый из которых поддерживает формирование до 1200 EBs. Из примерно 24 миллиона 4i наивно плюрипотентности клеток, эта пластинка микрорезервуар обычно создает ~ 8000 EBs, состоящая из клеток ~ 3000 на EB. Во время не сторонник культуры EBs с постоянным качания, количество нетронутыми EBs постепенно уменьшается из-за спонтанного самостоятельно разбирать и ~ 3000 EBs дожить до дня 13 Протокола. Большинство из них выживают EBs имеют 50-200 hPGCLCs на их поверхности (по оценкам Иммуногистохимическое определение OCT4 + клеток в последовательных секциях EBs; см. Рисунок 8), уступая ~ 100000 OCT4 + hPGCLCs в общей сложности. Ферментативного пищеварения EBs в одной клетки — сравнительно неэффективным процесс, сокращения урожайности СУИМ обогащенный CD38 + hPGCLCs до 9000-47000 клетки. В наших руках в среднем шесть независимых, но последовательных серий экспериментов был 14,038 ± 5,731 (означает ± SEM). Потому что клетки клетки CD38-отрицательных EB Экспресс OCT4 мРНК (ПЦР) или белка (иммуногистохимия) только очень слабо, если не полностью отсутствует, все клетки EB решительно выражая OCT4 белка эквивалентны практически всего населения CD38 + hPGCLCs.

Критический параметр Этот протокол включает в себя плотность клеток. Когда 2.0 x 10⁵ человека iPSCs прививку в внеклеточного матрикса, белок покрытием хорошо из 6-ну клетки культуры пластины (9.60 cm² роста области за хорошо) с 2 мл Y27632-дополнено средней (2.2.9), клетки достигнет около 20-30% confluency 24 часов после прививки (рис. 1). После дополнительных 24-часовой культуры в mTeSR1 среде в отсутствие Y7632, клеток совокупного и формы колоний занимая ~ 30% роста области (рис. 2). Клетки затем культивировали в средстве перепрограммирования 4i (2.3.2). После 24 часов культуры в средних, клетки становятся притока 4i (рис. 3). Дополнительные 24-часовой культуры в среде 4i делает клетки плотно упакованы (рис. 4). Точные сроки среднего изменения (каждые 24 часа около 4 часа) и плотности клетки имеют решающее значение для успешного формирования EBs и hPGCLCs.

После 48-часовой культуры в среде 4i клетки в отрыве и прививку в микрорезервуар плита, которая имеет скважин 400 мкм в размер (2.4). Хотя эта плита коммерчески доступных микрорезервуар покрытием для поверхности низким сцеплением изготовителем, свежие переизоляция с моющим средством (2.4.3) рекомендуется для снижения риска нежелательных клеточной адгезии. 800 мкм microwells привели к сокращению урожайности hPGCLCs, предложив значение размера EB для правильно направленного дифференцирования. Клетки, привитых в среде 4i сформирует EBs в microwells на 24-30 часов, которые можно наблюдать с помощью стандартных, Перевернутый фазы контраст микроскопа (рис. 5). Круговой контур EBs становятся видны на и после 24 часов инкубации. Заготовка EBs на более раннее время (например, 16 часов после прививки) перед их круговой контур хорошо видна не рекомендуется, поскольку такие EBs очень уязвимы для механистический убытков и легко демонтировать. Обратите внимание, что значительное количество hiPSCs наивно не включены в EBs, которая является нормальным. Эти неинкорпорированных клетки будут смыты до начала качания культуры EBs на низкий сторонник поверхности (2.5.2). Также, обратите внимание, что, в нашем протокол, EBs образуются в 4i наивно плюрипотентности средне - не в hPGCLC среде. До формирования твердых EBs в среде 4i до воздействия на hPGCLC носителе имеет важное значение для распространения hPGCLCs на поверхности EBs.

EBs поддерживаются в hPGCLC среде под качания, non сторонник культуры условие будет сохранить их сферическую форму без агрегирования или фьюжн (Рисунок 6 и рис. 7). Слишком слабые, тряся условие приведет к EB агрегирования и синтеза, но слишком суровым условие будет демонтировать EBs. Человеческого PGCLCs возникают как OCT4-выражая клетки на поверхности EBs после 5 дней культуры в hPGCLC среде и их количество увеличивается в кратчайшие сроки до 8-день культуры (рис. 8). Дальнейшие инкубации EBs может привести к демонтажу EBs и потери hPGCLCs. Человеческого PGCLCs может обогащаться от ферментативно диссоциированных EB клеток после 5-8 дней культуры в hPGCLC среде СУИМ как CD38 + клеток (рис. 9).

Рисунок 1: культуры клеток человека iPSC в среде Y27632-дополнить 24 часа после инокуляции. Плотность клеток составляет около 20-30% вырожденная. В присутствии ингибиторов рок Y27632 клетки имеют тенденцию распространяться с длинными, Спайк как удлинение. Шкалы бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2: культуры клеток человека iPSC 48 часов после инокуляции. Статистические формы колоний, занимая ~ 30% от площади роста клеток. Шкалы бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: культуры клеток человека iPSC инкубировали в средстве перепрограммирования 4i за 24 часа. Клетки достичь confluency. Шкалы бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: культуры клеток человека iPSC инкубировали в средстве перепрограммирования 4i за 48 часов. Вырожденная клетки плотно упакованы. Шкалы бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: EBs формируется в microwells после 24-часовой инкубации в 4i перепрограммирования среднего человека iPSC. Круговой контур EBs, становятся видимыми на 24-30 часов после прививки. Когда контур подтверждается под микроскопом контраст фазы, EBs готовы для передачи в условие качания культуры. Шкалы бар = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6: человека iPSC EBs инкубированы для 24 часов в средне-и hPGCLC. EBs основном сохранить их сферическую форму. Шкалы бар = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7: человека iPSC EBs инкубированы для 192 часов в средне-hPGCLC. EBs увеличены по сравнению с их появления на 24-часовой культуры, но они по-прежнему поддерживать сферической формы без агрегирования или фьюжн. Шкалы бар = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8: человеческого PGCLCs, выражая OCT4 локализованы на поверхности EBs инкубированы для 192 часов в средне-и hPGCLC hiPSC. EBs были внедрены в белков внеклеточного матрикса и обрабатываются для FFPE слайд иммуногистохимическое окрашивание OCT4 (DAB субстрата). Шкалы бар = 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9: Человека PGCLCs обогащены от ферментативно диссоциированных EB клеток СУИМ как CD38⁺ клетки. После инкубации в средне-и hPGCLC для 5-8 дней EBs можно отделить от ферментативного пищеварения подготовить одну ячейку подвеска. hPGCLCs может быть расширен как CD38⁺ клеток путем СУИМ (красные точки). EB-клетки, которые не выражают CD38 (синие точки) также должны быть собраны как отрицательный контроль. СУИМ ворота CD38-позитивных и CD38-отрицательные клетки должны быть разделены с большим отрывом (зеленые точки) чтобы избежать загрязнения каждого типа клеток. Верхняя и нижняя панели показывают СУИМ профили без или с анти CD38 антитело пятная, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Надежного производства hPGCLCs по Протоколу описанные здесь было подтверждено с трех независимых клоны человека iPSCs с нормальной диплоидных кариотипа¹⁰. Эти клоны iPSC были получены от культуры фибробластов клетки же дермы кожи человека новорожденных¹⁰. Они будут предоставляться авторами этой статьи для следователей по запросу и по соглашению передачи соответствующих материалов и доставка договоренности замороженных живых клеток человека. В настоящее время неизвестно о том, требуется ли нормальный кариотип для надежной hPGCLC производства с помощью нашего протокола, или тех, кто сообщил другими лабораториями.

Недавние исследования показали, что производство hPGCLCs из hiPSCs¹¹ или ЭСК¹⁴ с помощью описанных группой Сайто в университете Киото⁸ протокола зависит проявление EOMESODERMIN, T-бокс транскрипционный фактор требуется для индукция SOX17. SOX17, как представляется, функционировать в качестве основной линии, определяющим фактором транскрипции микрофлорой дифференциация человеческих плюрипотентных стволовых клеток⁶. EOMESODERMIN кодируется геном EOMES , нокаут ТРИФОСФАТЫ/Cas9 EOMES вызвало почти полное отсутствие индукции SOX17 в hPGCLC, производства состояния¹¹, и экспрессии генов, другие следуют той же модели SOX17-значение null нокаут клетки. Сверхэкспрессия EOMESODERMIN от индуцибельной вектор в EOMES-ячейки значение null нокаут во время индукции hPGCLC культуры эффективно спасли надежные hPGCLC производства, а также индукции микрофлорой генов, в том числе SOX17. В отличие от индуцированного Сверхэкспрессия SOX17 также спасли надежного производства PGCLC но не вызывая EOMES. Таким образом EOMESODERMIN является критическим вверх по течению индуктором SOX17, и это кажется одной наиболее важную роль EOMESODERMIN в hPGCLC индукции от человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Наш протокол вызывает SOX17 в hiPSCs¹⁰, но ее зависимости индукции EOMESODERMINE ждет, чтобы быть определены.

Этот протокол преобразует загрунтовать плюрипотентности человека iPSCs поддерживается в средне mTeSR1 Эрк независимые наивно плюрипотентности 96 часов в 4i перепрограммирования средних⁶, который является изменение наивно стволовых клеток человека среднего (NHSM)⁵. Наши попытки создания hPGCLCs начиная с же человека iPSC клонов, но поддерживается в других СМИ коммерчески доступных человека iPSC роста до культуры в 4i перепрограммирования средних привело к той или иной степени снижения урожайности hPGCLC. Хотя в будущих исследованиях определяться улучшает производства hPGCLC ли не остается долгосрочной адаптации в других средствах массовой информации, это наблюдение предполагает, что точное состояние загрунтовать плюрипотентности человека iPSCs до 4i перепрограммирования значительно воздействие EB формирования 4i среднего и EB дифференциации в hPGCLC среде.

Производство hPGCLCs из hiPSCs после нашего протокола является надежным и очень воспроизводимость, частично благодаря использованию микрорезервуар пластин, обеспечивающие эффективное производство большое количество EBs (~ 8000 EBs в пакете) с размером единой (3000 hiPSCs за EB). Количество EBs, легко производится в одном пакете эксперимента с помощью нашего протокола может быть гораздо больше, чем методы с использованием регулярных U-дно клетки культуры скважин. Производство большого количества одинаково размера EBs равномерно шипованных с hPGCLCs могут предоставляют уникальные возможности для определения малого молекулярного веса активаторов или ингибиторов, затрагивающих PGC спецификации высокой пропускной способностью химических отсевов или их биологические характеристики как эпигеномные перепрограммирования. Такие EBs также может быть полезным для токсикологические оценки большого числа герминальных клеток ядовитых веществ, включая не только загрязняющих окружающую среду, но также клинически предписанные лекарства, такие как химиотерапевтических агентов.

Критическими факторами производства надежных и воспроизводимых hPGCLCs с использованием представленные протокол включают в себя (i) использование здорового hiPSCs, в mTeSR1 на белков внеклеточного матрикса, (ii) чтобы прививать точное количество клеток как указано и строго Следуйте тайминги среднего изменения и субкультуры, (iii) чтобы выбрать хороший много человеческого рекомбинантного BMP4 и (iv) для сведения к минимуму физические повреждения EBs во время раскачивания культуры. Это наш опыт, что лучшие много реагента BMP4 работал в концентрации 100 нг/мл, в то время как другие много реагентов BMP4 требуется 2 X или более доз. С другой стороны, доходность hPGCLCs производства с использованием лучших много BMP4 скорее уменьшилось в более высоких дозах BMP4 (например, 200 нг/мл). Мы рекомендуем, чтобы проверить несколько разных много рекомбинантного человеческого BMP4 реагентов, полученных от нескольких поставщиков для их деятельности в поддержку hPGCLC поколения и обеспечить большое количество лучших много.

Уникальной особенностью нашего hPGCLC протокола является, что hPGCLCs локализованы на внешней поверхности слой EBs¹⁰ (рис. 8), в то время как другие протоколы могут генерировать hPGCLCs в середине ячейки агрегатов^6,8. Embryoid органы, как правило, образуют несколько различных слоев поверхность, внешняя оболочка, внутренней оболочки и ядро, и в основных регионах часто некротические за ограниченный запас питательных веществ, кислорода, а также про выжившие факторы роста предусмотрено формы культуры средняя диффузия²⁰. Локализация hPGCLCs на поверхности EBs без возможных ограничений из-за ограниченного распространения к центр EBs может быть полезным для прямых, время контролируемые и доза облучения hPGCLCs наркотиков или токсичных веществ для фармакологической или Токсикологические исследования.

В то время как мыши PGCLCs шоу надежные генома всей ДНК деметилирования с участием импринтинг контролировать регионов по крайней мере частично^7,19,20, степени деметилирования глобальных геномная ДНК в hPGCLCs кажется слабее, чем мыши PGCLCS или PGCs^6,7. Transcriptomal профилей предполагают, что hPGCLCs могут быть похожи на более ранней стадии эмбриональных PGCs чем мыши PGCLCs¹⁰. Сообщалось, что длительное культуры EBs в условиях hPGCLC производства вызвало увеличение степени деметилирования геномная ДНК⁷; Однако ли продолжительный период культуры hPGCLCs в EBs или как изолированные клетки можно добиться более продвинутых стадиях дифференцировки микрофлорой должна определяться будущих исследований.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel	Corning	354277	Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21041-025	Store at 4 °C.
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632	Axon	1683	Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	07930	Store at 4 °C.
Accutase	Innovative cell technologies	AT104-500	Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name	Company	Catalog Number	Comments
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1286101
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Thermo Fisher Scientific	10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I1882-100MG	Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF	PeproTech	300-05	Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2	R&D Systems	4114-TC	Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1	PeproTech	100-21	Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium			Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021	Axon	1386	Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901	Axon	1408	Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796	Axon	1358	Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125	Tocris	1496	Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400	STEMCELL Technologies	27845	Microwell plate
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name	Company	Catalog Number	Comments
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM	Thermo Fisher Scientific	11710035
Sodium pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070
Penicillin-Streptomycin (100x)	Corning	30-002-CI
hPGCLC basal medium			Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4	R&D Systems	314-BP	Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF	PeproTech	300-07	Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF	PeproTech	AF-100-15	Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer	Corning	352340	Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube	Corning	352070
Low attachment plate	Corning	3471
Vari-Mix Platform Rocker	Thermofisher	M79735Q
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution	VECTOR	SP-6000
Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG	VECTOR	MP-7405
OCT-3/4 Antibody	Santa Cruz	SC-8629
ImmPACT DAB	VECTOR	SK-4105
Permount	Thermofisher	SP15-100	Mounting medium
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC	abcam	ab134399