Протокол предпочтение кондиционером место для измерения инкубации тягу в крыс

Резюме

Здесь морфин кондиционером место предпочтение (CPP) Протокол описан измерить инкубации тягу в крыс.

Аннотация

Одной из основных причин повторные рецидивы является жажда наркотиков. Наркотиков жажда увеличивается постепенно в период воздержания, явление называется инкубации жажда наркотиков. Здесь мы описываем морфин-кондиционером место предпочтение (CPP) протокол для измерения инкубации тягу в крыс. В настоящем Протоколе CPP парадигмы, главным образом используя соматосенсорные подсказки используется для создания долгосрочной памяти награду морфина. Окно CPP-трехкамерный, которое отличается в текстуре пола камеры построен. Во-первых животные проверяются на их исходных предпочтение двух бортовых камер трех дней подряд. Затем они вводили внутрибрюшинно морфин/физиологического раствора и положить в их предпочитали/непредпочитаемого камеру за 45 мин. После 6 дней кондиционирования их предпочтений в сторону камеры проверяется на 15 мин в разное время точках после последней сессии принадлежности. С этой парадигмы награда памяти морфина может продолжаться в течение 18 дней. Чтобы проверить ли вышеупомянутый Протокол можно смоделировать увеличение жажды, количество входов в двух бортовых камер, учитываются в период воздержания. Результаты показывают, что входы увеличилось, предполагая, что CPP парадигма может имитировать инкубации тягу. Будущие исследования могут использовать эту модель для изучения нейронных механизмов долговременной памяти и инкубации тягу.

Введение

Наркомания представляет собой хроническое заболевание¹ с несколькими различных этапов²: выпивка/интоксикации, вывод/отрицательное влияние и заботой/ожидание. В стадии первоначального выпивка/интоксикации цикла зависимость от наркотиков субъектов принимать наркотики из-за усиливающие эффект². В стадии влияет на вывод/отрицательная предметы опыт негативные соматических и эмоциональных состояний наркотиков вывода, способствующие отрицательное подкрепление механизмы, связанные с развитием наркомании³. В стадии озабоченность/ожидание субъектов восстановить поисках наркотиков после исчезновения, которые могут быть вызваны сигналы, связанные с наркотиками или стресс. В исследованиях на животных наркомании кондиционером место предпочтение (CPP) парадигмы используются для имитации армирующие положительный эффект препаратов^4,5,6 , и, таким образом, он используется для моделирования на начальном этапе препарата зависимость от цикла. Морфин, членом семьи opioid, производит положительный эффект армирующие, активировав опиоидные рецепторы в мозге^7,,⁸.

CPP парадигмы основаны на принципе классической кондиционирования (Павловский) и часто используется для измерения полезный эффект наркотических средств, таких как морфин^4,5,9,10, из-за его легко доступность в лаборатории. Типичный CPP парадигмы состоит из трех этапов: этапа предварительного кондиционирования, кондиционирования и испытания. Во время этапа принадлежности награждение свойства препарата (unconditioned стимул) в паре с одной или более нейтральных контекстной раздражителей, которые получить свойства, награждение после нескольких комбинаций принадлежности и служить в качестве условных раздражителей. На этапе тестирования предпочтение животных наркотиков в паре отсеков измеряются и отражение их вознаграждение памяти. По этой причине CPP парадигма также используется для изучения механизмов обучения и памяти. Учредить долгосрочную память награду морфина, переменные, которые влияют на создание CPP были скорректированы и оптимизированы с ниже описывается протокол¹¹. Контекстуальные стимулы представляют собой сочетание визуальные, тактильные и запах подсказки. Вариации контекстуальные раздражителей и тестирования время точек изготавливаются по различных научно-исследовательских целей. Например в наших предыдущих исследования¹², соматосенсорные сигналы (различных напольных текстуры) главным образом использовались как контекстуальные раздражители расследовать роль хвостовой части островной коры мозга региона соматосенсорной функцией, в приобретении и поддержание долгосрочной памяти вознаграждение. Дизайн аппарата и назначение крысы предпочитали/непредпочитаемого сторон влияют на создание CPP. Трехкамерная аппарат вместо 2 камеры аппарата используется в ниже протокол, чтобы избежать принудительного выбора. Баланс двух бортовых камер и первоначальная уступка животных в них влияют на приобретение CPP^4,13. Таким образом сбалансированный дизайн бортовых камер и предвзятым назначение животных применяются в этом протоколе приобрести прочное место предпочтение. Поддержание долгосрочной памяти награда требует более принадлежности испытания на этапе принадлежности. Чтобы уменьшить время стоимость во время фазы принадлежности, проводятся два испытания принадлежности в день и инъекции морфина/физраствора уравновешенной чтобы избежать острого абстинентного эффекта морфина в солевой парных испытания⁴.

Восстановление животных моделей¹⁴ были созданы для моделирования озабоченность/ожидание этап цикла зависимость от наркотиков. CPP также использовались для изучения восстановление, моделирующее рецидив аддиктивного поведения⁵. Рецидив является одним из препятствий на пути в лечении наркомании. Тяга является одной из причин повторный рецидив. Жажда наркотиков увеличивается постоянно в период воздержания, явление называется инкубации тяга^15,16. Инкубации тягу широко изучается в парадигмы самоуправления наркотиков, но не CPP парадигмы. Использование парадигмы CPP, чтобы отразить инкубации тяга была впервые предложенный Li et al. ¹⁷. их результаты¹⁷ показал, что CPP десятки низкими дозами морфина (1 мг/кг и 3 мг/кг), но не высокой дозе (10 мг/кг) увеличен постепенно в течение первых 14 дней воздержания. Аналогичным образом мышей вводили с низкой дозой кокаина, показал увеличение CPP баллы за время¹⁸. Увеличение CPP десятки низкой дозы морфина были использованы для отражать инкубирован тяга¹⁷. Длительность показа в и количество записей в связанных с наркотиками окружающую среду предлагается отразить армирующие условных реакций в CPP парадигмы¹⁹. Большинство из последних исследований использовать CPP баллы для прямо или косвенно отражают время, проведенное в паре наркотиков камеры во время количество записей бортовых камер как параметр часто пренебрегают. По этим причинам морфин доза 10 мг/кг был использован и в нашем исследовании¹¹было измерено количество записей. Результаты показывают, что входы крыс в сторону камеры значительно возросло во время периода воздержания¹¹. Это означает, что CPP баллы и количество записей являются полезными параметрами в оценке увеличение жажда наркотиков и CPP парадигма применяется для моделирования инкубации тяга явление. Однако чтобы уменьшить количество животных требуется, группа морфина опытных животных тестируется неоднократно; Таким образом эффект исчезновения не могут быть исключены с током в пределах тема дизайн. A между тема дизайн с тот же протокол может преодолеть это ограничение.

Ниже описывается протокол CPP, установлены долгосрочные вознаграждения памяти и моделируется увеличение жажды. Кратко после трех дней предварительного кондиционирования, крыс через шесть дней принадлежности с двумя принадлежности испытаний в день и затем проверяются в разное время точках после последнего суда принадлежности. В этой парадигме CPP построен-трехкамерный поливинилхлорид (ПВХ) окна, используется как аппарат CPP и пол аппарата является сбалансированным. Аппарат состоит из двух палат большие черные боковые (30 см × 25 × 30 см, Д × Ш × в) и один среднего белого камеры (11 cm × 25 × 30 см, Д × Ш × в) с белым полом гладкая ПВХ. Два бортовых камер имеют различные этаж текстуры как соматосенсорные подсказки: один с полом из плексигласа сетки, а другой с черновой пол из ПВХ.

протокол

Экспериментальной процедуры выполнялись в соответствии с руководящими принципами для национальных уход и использование животных и экспериментов были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом в Шэньчжэнь институты передовых технологий, китайский Академия наук.

1. животных привыкания

1. Получить от животных лабораторных взрослых самцах и поддерживать их под свет/темно цикла 12 h (свет на с 7:00 до 19:00) с свободный доступ к продовольствию и воде.
2. Обрабатывать животных, играя с ними или поглаживая их два раза в день за две недели до начала экспериментов.
3. Случайным образом назначьте животных в соленой или морфин группы.

2. наркотиков подготовка

1. Подготовить морфина гидрохлорида как 10 мг/мл и придать крыс внутрибрюшинно (и.п.) в объеме 1 мл/кг.
2. Как элемент управления придать крыс с физиологического раствора в объеме 1 мл/кг.

3. CPP аппарат

1. Построить-трехкамерный CPP аппарат с различных тактильные (этаж) сигналы и тест крыс первоначальное предпочтение двух бортовых камер. Аппарат состоит из двух палат большие черные боковые (30 см × 25 × 30 см, Д × Ш × в) и один среднего белого камеры (11 cm × 25 × 30 см, Д × Ш × в) с белым полом гладкая ПВХ. Два бортовых камер имеют различные этаж текстуры как соматосенсорные подсказки: один с полом из плексигласа сетки, а другой с черновой пол из ПВХ.
2. Отличаются сочетанием тактильные сигналы, чтобы убедиться, что аппарат является беспристрастной, поскольку предвзятое аппарат подвержен давая ложные положительные результаты⁴.
   Примечание: Важным методологическим вопросом в дизайн аппарата CPP является ли аппарат «предвзятой» или «объективное»⁴. Если одна группа неподготовленных крыс показывает не первоначальное предпочтение одной стороны камеры над другой, аппарат считается «объективное». В противном случае рассматривать его как «предвзятым»¹³.

4. CPP процедура

1. Создание морфина индуцированной CPP парадигмы главным образом согласно предыдущих исследования^21,22 модификация кондиционирования моменты времени, количество кондиционирования сессий, кондиционирования испытательный период и тестирования время точек²⁰ . Краткое описание приводится ниже, из которых экспериментальный график изображен на рисунке 1.
2. Этап предварительного кондиционирования
   1. Во время этой фазы (день 1-3) удалите дверцы системы Гильотина разрешить свободный доступ к весь аппарат и место животного в середине камеры.
   2. Рекорд активности животных на 15 мин.
   3. Рассчитать время, проведенное в двух бортовых камер на 3 день как базовый и называть это T0.
   4. Удаление крыс, которые ввести меньше чем - четыре раза либо из бортовых камер от эксперимента²³ как этих крыс, скорее всего, есть проблемы в общее благосостояние (например, грязный меха и наличие опухоли). Проверьте состояние здоровья животных в целом экспериментальный период.
3. Фаза принадлежности
   Примечание: Принадлежности этап включает в себя 6 дней (день 4-9).
   1. Для морфина кондиционером субъектов придать крыс и.п. морфин (10 мг/кг) или физиологического раствора (1 мл/кг) поочередно утром (9:00) и вечером (19:00) сессий (10 h врозь).
   2. Ограничивайте крыс сразу же после каждой инъекции в паре наркотиков-(предпочтительно) или физиологического раствора в паре (предпочитаемый) Палата 45 мин (рис. 1B).
   3. Держите система видеозаписи на.
      Примечание: Согласно нашему опыту, около 5% крыс имеют угнетение дыхания после первой инъекции морфина (10 мг/кг). В таком случае для увеличения выживаемости дыхательной депрессии крыс, получить крысы из кондиционной камеры, вытащить свой язык и положил его на белой папиросной бумаги в его домашней клетке.
   4. Для элементов управления, солевых кондиционером дают крыс физиологическим инъекций (1 мл/кг) перед воздействием одной стороны палату CPP аппарата во время утренней сессии и на другой стороне, во время вечерней сессии 45 мин/сессии соответствует группы морфина (Рисунок 1 C).
4. Этап тестирования
   1. Во время этой фазы удалите дверцы системы Гильотина разрешить свободный доступ к весь аппарат и место животного в Ближнем палаты, чтобы позволить им свободно исследовать весь аппарат за 15 мин.
   2. Запишите их активности в течение этого 15 мин.
   3. Провести три испытания после принадлежности, т.е., тест 1 (T1), тест 2 (T2) и тест 3 (T3), 2 дней, 10 дней и 18 дней после последней сессии принадлежности в государства, свободного от морфина, соответственно (рис. 1A).
   4. Различаются тестирования время точки для различных экспериментальных целей.
      Примечание: Чтобы свести к минимуму количество необходимых крыс, используется в рамках темы дизайна. Однако, чтобы исключить эффект исчезновения, между субъектом дизайн не требуется.

Рисунок 1: экспериментальный процедуры. (A) экспериментальных процедур всего процесса CPP. (B) экспериментальный график этапа принадлежности группы морфина. (C) экспериментальный график этапа принадлежности солевой группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

5. анализ данных

1. Подсчитать очки CPP в morphine(saline) группы, как: Оценка CPP = время, проведенное в камере наркотиков в паре-(предпочтительно) / общее время, затраченное в обеих палатах принадлежности.
2. Выполните анализ данных CPP баллы и входы в сторону камеры с соответствующих статистических методов, использовании SPSS.
3. Представляем все поведенческих данных означает ± SEM, где SEM это стандартная ошибка среднего. Рассмотрим значения p < 0,05 как статистически значительным и указывают на звездочки (*) и octothorpesin (#) в цифрах.

Результаты

Следующие представитель результаты показывают, что морфин, созданные CPP может быть успешно протоколом, описанных выше и долговременную память награду морфина (рис. 2) может быть сохранен. Количество записей бортовых камер, аналогично количество активных ответов в парадигме самоуправления, отражает армирующие свойства морфина. Увеличение числа записей (рис. 3), указывающее инкубации тягу, было отмечено, с помощью этой парадигмы CPP морфина.

CPP память может продолжаться по крайней мере 18 дней после последней сессии принадлежности.

21 крыс в группе морфина и 10 крыс в солевой группы были использованы для тестирования выражение долгосрочной памяти, награждение. Смешанные ANOVA выявлены существенные различия в области взаимодействия между группой и тест (F (3,87) = 4.973, p = 0,003), испытания (F (3,87) = 18.237, p < 0,001) и группы (F (1,29) = 11.413, p = 0,002). Значительные различия среди тестов (F (3,60) = 46.628, p < 0,001) в группы морфина, но не физиологическим group(F(3,27) = 1.576, p = 0.218) были обнаружены односторонней неоднократные ANOVA. Несколько сравнительный анализ с регулировкой Бонферрони показали значительные различия между тремя тесты и T0 в группе морфина. Как показано на рисунке 2, морфин награда памяти продолжалась по крайней мере 18 дней и снизилась в зависимости от времени тенденции. Данные получены из предыдущих опубликованное исследование¹¹.

Входы для бортовых отсеков в группы морфина, увеличивалось

Группа морфина
Чтобы протестировать тренд входов, группа (физиологического раствора в паре и морфина в паре) как фактор между предметов и тест (T0, T1, T2 и T3) как фактор в рамках темы были установлены для смешанного ANOVA. Никаких существенных различий в области взаимодействия между группой и тест (F (2.311,92.449) = 1,915, p = 0.147) и группы (F(1,40) = 0.898, p = 0.349), но значение в тесте (F(2.311,92.499) = 24.243, p < 0,001), были обнаружены. Несколько сравнительный анализ с наименее значительные различия (ЛСД) испытания показали значительные различия между T1 и T0 (p < 0,001), T2 и T0 (p < 0,001) и T3 и T0 (p < 0,001) в группе морфина в паре морфина входов. Относительно физиологического раствора в паре отсеков, между T2 и T0 существовало статистической значимости (p = 0,002) и T3 и T0 (p = 0,003) но не T1 и T0 (p = 0.246), который подобен шаблону инкубации героина, жажда²⁴. В общем входы в сторону камеры в морфин группы увеличение время зависим.

Крысы, чаще вступил в паре морфина отделение чем физиологического раствора в паре отсек на T1 (t(1,21) =-2.833, p = 0,010) и T2 (t(1,21) =-4.458, p = 0.0002) но не T3 (t(1,21) =-0.471, p = 0.642) (2 tailed паре t тесты).

Солевой группы
Аналогичные с группой морфина, смешанная ANOVA был применен и выявлено статистически значимых различий в области взаимодействия между группой и тест (F(3,54) = 0.345, p = 0.793), тест (F(3,54) = 1,793, p = 0.159) и группы (F(1,18) = 0.151, p = 0,702). Таким образом входы в сторону камеры в группе физиологическим были стабильными с течением времени.

Рисунок 2: CPP памяти может длиться минимум 18 дней, но снижается со временем. Сохранение памяти CPP в группе морфина (n = 21) и солевой группы (n = 10) оценивалась путем измерения CPP Оценка для нескольких точек времени после последнего кондиционирования (T1, 2 дня; T2, T3, 18 дней и 10 дней). Все значения CPP оценки являются среднее ± SEM. ### указывает p < 0,001 и ## означает p < 0,01 по сравнению с физиологическим группой; указывает p < 0,001 по сравнению с T0 в группе морфина. Эта цифра была изменена от Sun et al., 2017¹¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: входы в сторону камер в группы морфина и физраствора. Входы в две стороны камер в группе морфина (n = 21) и солевой группы (n = 10) были оценены в нескольких точках времени после последнего кондиционирования (T1, 2 дня; T2, T3, 18 дней и 10 дней) и по сравнению с T0. Все значения входов являются среднее ± SEM. В группе морфина (A), входы в сторону морфина в паре очень значительно возросло от T1 до T3 при входов палаты физиологического раствора в паре, только значительно возросла от T2. Парные t тесты с морфина в паре отсек и отсек физиологического раствора в паре показал очень значительное увеличение в T1 и T2. В группе физиологический (B) есть никаких существенных изменений в входов для обеих сторон. Эта цифра была изменена от Sun et al., 2017¹¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Здесь метод с использованием парадигмы CPP морфина описана установить долгосрочные вознаграждения памяти в Крыса с соматосенсорные подсказки как кондиционером контекста. Для построения такой долгосрочной памяти вознаграждение, изменяется предыдущий протокол²¹ с сбалансированный аппарат CPP и физиологического раствора и морфин сеансы являются набор по крайней мере 10 h друг от друга. Кроме того во время этапа принадлежности для повышения качества обучения ассоциативные добавляются дополнительные принадлежности сессий. Помимо оценки CPP входы в две стороны камеры измеряются и шаблон расширения входов в сторону камеры схож с этим увеличение активных ответов в парадигме самоуправления.

Создание CPP парадигмы, упомянутые выше влияют несколько факторов. Одним из ключевых факторов является дизайн аппарата: крысы в целом должны иметь аналогичные предпочтение обеспечить сбалансированный аппарат по обе стороны камеры. Несбалансированные аппарат может маскировать приобретение CPP из-за первоначального высокое предпочтение одной стороны Палаты¹³. Таким образом крайняя предпочтение одной стороне камеры (более 90% общего времени в любом из двух бортовых камер) следует избегать при выборе текстуру слово или другие контекстные подсказки. Для различных экспериментальных целей экспериментаторов можно сбалансировать CPP аппарат, изменяя контекстуальные раздражителей. Для сбалансированного аппарат часто используемые⁴существуют два способа экспериментальный дизайн. Один из способов предвзятым — пара наркотиков с непредпочитаемого камеры со всеми субъектами; объективное способом является пара половина животных с наркотиками в зале непредпочитаемого, другая половина с предпочтительным камеры. Оба способа можно установить CPP¹³ , но исследования^17,25 с последнего дизайн всегда исключают многие предметы из-за их явное предпочтение одной стороне камеры. Как отдельные уязвимость к наркотиков наркомания^26,27,28 , предвзятым дизайн был выбран в этом исследовании чтобы избежать исключения здоровых испытуемых. Одно ограничение предвзятым дизайна является эффект несовместимым предпочтение стороне камеры. Как показано на рисунке 2, крыс в группе физиологическим имеют последовательную низкие оценки CPP для первоначального непредпочитаемого камеры. Таким образом исключается возможность, что несогласованные предпочтение стороне камеры может повлиять на оценки CPP в группе морфина, установив физиологический контроль. Чтобы избежать эффекта потолок предпочтительным камеры, мы используем первоначальный непредпочитаемого камеры как морфин спаренные камеры. Чтобы избежать эффекта новизны и стресса на базовых предпочтений в сторону камеры, выполняются три сессии предварительного кондиционирования, и третья сессия используется в качестве базового. Четвертым фактором является интервал между морфина и физиологическим сессий. В нашей парадигме мы выбираем промежутки времени по крайней мере 10 часов чтобы избежать вывода эффекта в период физиологическим принадлежности. Доза морфина также является важным фактором. Чрезвычайно низкие дозы морфина, например 0,01 мг/кг⁶, не вызвать место предпочтения. В дозе 10 мг/кг индуцированной высокая оценка CPP¹⁷ крыс и широко используется в крыса морфина CPP исследования^17,21,23. Однако 10 мг/кг морфина (и.п.) может вызвать угнетение дыхания в около 5% крыс. Более низкие дозы морфина, например 5 мг/кг, могут использоваться в будущих исследованиях. Для других видов, таких как дерево бурозубка терпимости к наркотикам должны рассматриваться при построении CPP парадигмы. Поскольку дерево белозубка развивается быстро терпимости к морфину, увеличение дозы морфина должны использоваться в ходе кондиционирования этап^29,30.

С изменение протокола долговременную память вознаграждение устанавливается для по крайней мере 18 дней после 6 дней кондиционирования¹¹ (рис. 2). Будущие исследования должны измерять ли CPP могут сохраняться в течение длительного времени. Повторные рецидивы является главным препятствием в лечении наркомании. Рецидив может вызвать стресс, экологические сигналы и наркотики. После исчезновения CPP памяти эта модель может использоваться для моделирования рецидив, вызванный стресс или наркотиков.

Входы в паре наркотиков камеры в группе морфина увеличилась в период воздержания¹¹ (рис. 3), которая схожа с повышенной активные ответы в парадигме самоуправления. Однако входы в камеру физиологического раствора в паре также увеличилось с CPP парадигмы в крыс и тупайи¹¹, который отличается от неактивных ответы самоуправления парадигмы. Эта разница может из-за различных основополагающих принципов двух парадигм: один классический подготовлять, другой — оперантного кондиционирования. Кроме того тупайи с пищей, которую испытывает CPP не показывают такой шаблон расширения входов³⁰. Таким образом увеличение входов в обе стороны камеры в морфин опытных животных считается представляют инкубирован жажда наркотиков. Хотя нельзя исключить ограничение использования повторяющихся мер в одной теме, шаблон повышенной записей был сохраняется в крыс¹¹, тупайи^11,30 и обезьян³¹. Тем не менее между предметом дизайна во время абстиненции период настоятельно рекомендуется для будущих исследований исключить эффект исчезновения повторных измерений.

Помимо расширения входов CPP счеты с низкими дозами морфина (1 мг/кг и 3 мг/кг) увеличивалось в течение периода воздержания¹⁷. Эти результаты показывают, что CPP парадигма может также модель инкубации тяга явление. Однако расширение CPP оценка может также представлять увеличения памяти на условный стимул. В этом аспекте входы в сторону камеры в аппарате трехкамерный, которые похожи на активной реакции в парадигме самоуправления, больше напоминают Поиск наркотиков или полезный эффект препаратов. Было бы интересно проверить тенденции входов в сторону камеры в период воздержания в крыса CPP парадигмы более низкие дозы морфия. Будущие исследования с другими препаратами и мышей должно быть сделано для проверки ли это явление сохраняется через наркотики видов злоупотреблений.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morphine	Shenyang First Pharmaceutical Factory
CPP apparatus/Camera	Anlai Technology Company
SPSS	IBM Inc