JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем протоколы для использования платформы широкое поле зрения нематоды отслеживания (WF-NTP), которая позволяет высок объём фенотипические характеристики больших популяций Caenorhabditis elegans. Эти протоколы могут использоваться для характеризуют тонкие поведенческие изменения в мутантных штаммов или в ответ на медикаментозное лечение в масштабируемой моды.

Аннотация

Caenorhabditis elegans является устоявшейся животной модели в биомедицинских исследований, широко используемых в функциональной геномике и старения исследований. Для оценки здоровья и фитнеса животных под исследование, один обычно полагается на моторику отсчетов, такие как измерение количество изгибов тела или скорость движения. Эти измерения обычно включают ручной подсчет, что делает его трудно получить хорошее статистической значимости, как время и труд ограничения часто ограничивают количество животных в каждом эксперименте 25 или меньше. С высокой статистической мощности является необходимым для получения воспроизводимых результатов и ограничить ложные положительные и отрицательные результаты, когда слабый Фенотипическая воздействию исследованы, недавно были предприняты усилия для разработки автоматизированных протоколы, направлена на повышение чувствительность обнаружения моторики и несколькими параметрическими поведенческая Профайлинг. Для того чтобы расширить предел обнаружения до уровня, необходимого для захвата малых фенотипические изменения, которые часто играют решающую роль в генетических исследованиях и обнаружения наркотиков, мы опишем здесь технологического развития, который позволяет исследование до 5000 отдельных животных одновременно увеличивая статистической мощности измерения около Гарибова по сравнению с ручной анализов и около 100 раз по сравнению с других доступных автоматизированных методов.

Введение

Примерно полвека назад, Сидней Бреннер представил Caenorhabditis elegans (C. elegans) как модель системы для изучения развития и нейробиология, как этот маленький (1 мм в длину), прозрачный червя нематоды легко манипулировать генетически и поддерживать в лаборатории1. Сегодня C. elegans используется для изучения широкий спектр биологических процессов, включая апоптоза, сигнализации ячейки, характер клеточного цикла, регулирование гена, метаболизм и старения2. Кроме того клеточные и тканевые сложности, шаблоны выражение протеина и сохранению болезни пути между C. elegans и высших организмов (80% червь генов у человека orthologue), связанный с простотой и рентабельность выращивания, сделать его эффективным в естественных условиях организм модель поддаются высок объём генетических3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 и наркотиков14,,1516 фильмов. По всем этим причинам C. elegans был нанят для характеристики нормального и связанных с болезнью молекулярные пути; в поле нейродегенеративные например, это позволило изучение последствий старения белка агрегации3,4,7,15,17, 18и квалификация промоутеров и ингибиторы протеин агрегации3,4,5,6,7,14, 18.

Общая фитнес червей, который является важным параметром поведенческих должен быть определен в этот тип исследования, может быть измерен вручную в различных способов, таких как подсчитывать количество изгибов тела в минуту (BPM)4,6, 19, или путем измерения скорости движения20,21,22, а также путем измерения средняя продолжительность жизни и уровень паралич. Хотя ручного измерения изгибы тела и скорость движения привели к многие важные идеи в различных молекулярных пути и механизмы3,4,14,19, 20,23, ручной анализов остаются в настоящее время низкая пропускная способность, весьма трудоемким и длительным, находясь склонны к ошибкам и человеческого предубеждения. Эти вопросы представляют значительные трудности в сборе данных с достаточной статистической мощностью, чтобы различать тонкие поведенческие изменения. Это ограничение является особенно актуально для наркотиков скрининг как лечение с потенциальными наркотиков, что молекулы часто приводят к небольшой фенотипические изменения24, поэтому требующих изучения большого числа животных для того чтобы получить воспроизводимые результаты. Чтобы проиллюстрировать это, недавние исследования показали, что большой мощности обнаружения (POD) необходимо определить с уверенностью любые значительные изменения в поведении и ограничить25ложных положительных результатов. Это привело к сильной мотивации в C. elegans сообщество заменить ручной подсчет с измерений воспроизводимы, автоматизированный, время - и экономичным. Для удовлетворения этого спроса, несколько лабораторий недавно разработали методы для высокой чувствительности измерения и отслеживания точных червь большего числа червей22,26,27,28 ,,2930,,3132,33.

С целью дальнейшего расширения процесса автоматизации в большой когорты животных, необходимых для статистически значимых измерения, мы недавно разработали широкое поле зрения нематода, отслеживания платформы (WF-NTP)15,34 ,35,36, который позволяет одновременное исследование несколько фенотипических отсчетов на очень больших червь населения, является ключевым фактором в статистически значимым фенотипические обнаружения25. Не только может WF-NTP в настоящее время контролировать до 5000 животных параллельно, но фенотипические индикацию также включают в себя несколько параметров, включая скорость и амплитуду изгибы тела, скорость движения, доля населения, парализована, и Размер животных. Поэтому легко можно экран тысячи червей параллельно и объединить различные индикацию в поведенческих карту для создания многомерных отпечатков пальцев36. Связанные открытым исходным кодом программного обеспечения написана на Python, который также необходим для работы и полностью настраиваемый. Графический интерфейс пользователя (GUI) также предоставляет возможность пользователям принять эту технологию.

Здесь мы представляем ряда протоколов, которые иллюстрируют некоторые из возможных применений WF-NTP. В частности мы обсудим администрация соединений, начиная от маленьких молекул белка терапии и описывают, как экран их эффекты непосредственно над большим населением червей, таким образом, эффективно устраняя необходимость образец небольшой подгрупп населения. Использование WF-NTP для этой цели уже принесло значительные преимущества в процедурах, направленных для разработки программ обнаружения наркотиков болезни Альцгеймера (AD)15,,3435 и болезни Паркинсона (PD)18 с использованием в естественных условиях данных для оценки кандидатов-терапевтических35,37.

протокол

1. Подготовка материалов для C. elegans протоколов

  1. Для приготовления 10 x M9 буферный раствор, добавьте 30 г калия монокальций фосфат, 60 g двуосновной фосфат натрия и 50 г натрия хлорида автоклавируемый бутылка 1 Л.
    1. В ca. 121 ° C 15 мин, добавьте 1 Л воды очищенной и автоклав.
    2. Развести в 10 раз в очищенной воде и автоклава на ca. 121 ° C в течение 15 мин.
    3. Когда остынет, добавьте 1 мл раствора магния сульфата 1 М.
      Примечание: Только 1 x M9 (M9) должен использоваться для обработки в следующих шагах червя.
  2. Подготовить нематоды роста среднего (Rich-НГМ), смешайте 2,7 г натрия хлорида, 15.75 г агара, 5.75 г казеина, 900 мл очищенной воды и автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин.
    1. Передать богатых-NGM среднего потепления печь (ОК. 70 ° C), если не используется немедленно; Рич-NGM могут храниться расплавленный в 70 ° C до 12 h прежде чем стать непригодным для использования.
    2. Для богатых-NGM смешать, добавить 900 мкл раствора хлорида кальция 1 М, 900 мкл раствора магния сульфата 1 М и 900 мкл раствора 5 мг/мл холестерин в абсолютного этанола.
      Примечание: Холестерин не требует автоклавирования до использования.
    3. Для подготовки экспериментальной пластины, которые сохраняют синхронное возраста, мкл 92 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUDR) в 812 мкм до 900 мл богатых-NGM.
      Примечание: FUDR токсичных и канцерогенных, поэтому важно, чтобы носить перчатки нитриловые помимо халатах и защитные очки. Не позволяют отходов для ввода общего отходов поток и распоряжаться, сжигания с форсажной камерой.
    4. Налейте 20 мл газобетона Рич-NGM 9 см стерильная Петри для создания роста пластины (Rich-NGM плита). Налейте 15 мл газобетона Рич-NGM 9 см стерильная Петри сделать моторики плиты (Mot плита). Влить 20 мл богатых-NGM с FUDR в 9 см стерильная Петри для создания FUDR пластины.
      Примечание: Агар низкий объем пластину Mot облегчает камеры сосредоточиться и червь отслеживания (см. шаг 3.2.5).
  3. Подготовить штамм кишечной палочки ОР50, автоклавирования 1 Л LB отвара при 121 ° C 15 мин и прививать с закваски при охлаждении.
    1. Разрешить бактериальной культуры растут на ночь при 37 ° C и стерилизовать трубки для центрифугирования.
    2. Передавать бактерии стерильных трубок и центрифуги на 4600 x g за 15 мин.
    3. Декант супернатант и, используя стерильную воду, приостановить в 10% от первоначального объема для создания 10 x (10 раз концентрированные) ОР50 складе.
    4. Развести 15 мл 10 акций x OP50 до 150 мл для создания 1 x OP50, используя стерильную воду, прежде чем используется для заполнения Рич-NGM пластины. Решение использовать оставшиеся 10 x семян FUDR пластины.
      Примечание: Mot пластины останется unseeded и будет использоваться только в шаг приобретения изображений.
  4. Для семян пластины с бактериями, отделить богатых-НГМ и FUDR плит.
    1. В стерильных условиях мкл 350 1 x ОР50 для богатых-NGM плиты и равномерно.
      Примечание: Не распространяется на краю пластины, как черви будут ползать вверх по бокам пластины и умереть.
    2. В стерильных условиях 350 мкл 10 x ОР50 для FUDR пластины и равномерно.
    3. Разрешить пластины для сухой и Инкубируйте на 20 ° C для 2 d перед использованием.

2. Подготовка C. elegans для использования с WF-NTP

  1. Поддерживать C. elegans на богатых-NGM пластины или передавая небольшое количество содержащих агар червей лицом вниз на свежий слой бактерий. Поддерживать штаммов C. elegans таким образом до инициирования экспериментальных протоколов.
  2. С помощью метода передачи (см. шаг 2.1), семян 20 пластин каждого штамма с помощью хорошо кормят, смешанные этап червей и позволяют им расти на 2 d при 20 ° C.
  3. Смывают 5 плит, содержащие червей с помощью 15 мл M9 и бассейн в одной тубе 15 мл. Повторите для всех 20 пластин каждого штамма.
  4. Центрифуга для червей в 2000 x g на 2 мин, удалить супернатант и приостановить в 2 мл раствора M9.
  5. Подготовка 10 мл отбеливающий раствор путем смешивания 13% гипохлорита натрия и гидроксид натрия 4 M в соотношении 3:2 vol/vol.
    Примечание: Это решение не требует автоклавирования. Компоненты и полученный раствор коррозионные и должны быть обработаны с осторожностью, используя перчатки нитриловые. Гидроксид натрия мягко коррозию стекла и должен храниться в пластиковых контейнерах.
  6. Добавьте 1 mL отбеливающий раствор для каждого пластиковых пробирок и shake энергично для около 3,5 минут или пока полностью не растворится кутикулы.
  7. В стерильных условиях развести образцы 15 мл M9 и центрифуги на 2000 x g 2 мин удалить супернатант и приостановить в 15 мл раствора M9.
  8. Повторите шаг 2.7 6 раз, до тех пор, пока остаются только яиц гельминтов, и решение больше не имеет запаха хлора.
  9. Центрифугуйте образцы на 2000 x g за 2 мин, удалить супернатант и приостановить в 2 мл раствора M9.
  10. В стерильных условиях используйте стерильные стеклянные пипетки для передачи 2 мл M9 содержащие яиц в каждой скважине плиты 12-ну тканевые культуры и Инкубируйте на 20 ° C для минимум 16 h.
    Примечание: Используйте отдельные пластины для каждого штамма для предотвращения перекрестного загрязнения. Перенос шаг от пробирок на нескольких скважин помогает избежать удушья червя.
  11. Передача червей, на ночь вылупившихся из 12-ну пластин в 15 мл пробирок. Принимать 3 капли 5 мкл раствора червя и подсчитать количество червей, присутствовавших на первом личиночной стадии (L1).
  12. Рассчитайте количество червей за мкл раствора.
  13. L1 семян червей на богатых-NGM пластин на 3000 червей на пластину и дать им возможность расти в течение 2 дней при 20 ° C, до тех пор, пока они достигают последней стадии личиночной стадии (L4).

3. Общие WF-NTP протокол

  1. В соответствующей концентрации добавить 2,2 мл каждого препарата соединения (такие как 25 или 10 мм для наркотиков как скваламин18 bexarotene и15, соответственно) до 6 FUDR пластины и дайте высохнуть в стерильных условиях, для каждой требуемой червь штамм.
    Примечание: Этот шаг будет повторяться для каждого соединения на рассмотрении, для каждой концентрации и каждого использованного растворителя.
    1. Моют червей от 5 богатые-NGM плит, подготовленный на этапе 2.13, используя 15 мл буфера M9 и передачи червей для пластиковых пробирок.
    2. Центрифуга на 2000 x g за 2 мин, удалить супернатант и приостановить в 3 мл M9. Принимать 3 капли 5 мкл раствора M9, содержащие черви и подсчитать количество присутствующих на последней личиночной стадии L4 червей.
    3. Рассчитайте количество червей за мкл буфера M9.
  2. Семя 700 L4 личинки на 6 сухой FUDR плит, содержащий данного соединения, повторите эти действия для каждого концентрации каждого соединения и дайте высохнуть в стерильных условиях.
    1. Инкубируйте червей на 24 ° C от L4 для тех штаммов, где червь паралич индуцируется только повышение температуры, такие как AD штамм38. Граф на следующий день после L4 личиночной стадии как D0 взрослой жизни.
  3. Включите свет этапа для tracker.
    1. Очистите стекло этапе с 70% этанола и убедитесь, что не остается видимых следов, затем снимите крышку объектива. Очистите тепловизионных линзы, используя воздух тряпкой. Убедитесь, что камера правильно подключен и установлены и начать запись с помощью программного обеспечения захвата изображения.
    2. Настроить параметры камеры для записи 20 кадров/с, с моно 16 записи параметров установки; Запись 1200 кадров, сохранение в формате MJPEG в размере 95% сжатия. Использовать пустой 9 см Петри блюдо, чтобы гарантировать, что на сцене установлен на нужной высоте и изменять его при необходимости.
      Примечание: Убедитесь, что края пластины видны в записи, как это позволит «держать мертвым» алгоритм для правильной работы (рис. 1a).
    3. В стерильных условиях принимать 2 пластины, ранее подготовленных в шаге 3.2 на тех же условиях и 1 Mot, скрининг пластины, подготовленную на этапе 1.2.4. Добавьте 3 мл раствора M9 пластину Mot. Использование других 2 мл M9 мыть 1/3 площади поверхности плит 2, подготовленный на шаге 3.2 на пластину для Mot.
    4. Место пластину Mot, содержащий около 5 мл раствора M9 и около 600 червей на трекер сцену. Фокусировка камеры с помощью индивидуальных червя и начать запись.
    5. Когда запись закончена, отбросить Mot пластины с червей; Марк FUDR тарелки как раз используется и вернуть его в инкубаторе.
    6. Повторите шаги 3.3.3 для 3.3.5 для каждого экспериментальные условия.
    7. Повторите шаги 3.3.3 для 3.3.6 для каждой точки время взрослой жизни.
      Примечание: Процедуры отбора может осуществляться в любой момент жизни взрослого червя (ОК. 3 недели). Эти протоколы содействовать скрининга до 9 моменты времени; Авторы рекомендуют скрининг каждые 2 дня, начиная с 1 день совершеннолетия.

4. Оптимизация для дискретного дозы исследования

  1. Подготовьте червей, повторив шаги 3.1.1 до 3.1.3.
    1. Семя ОК. 1000 L4 червей на 5 FUDR пластин. Инкубируйте пластины при 24 ° C, до тех пор, пока D3 взрослой жизни, для экспериментов с AD38 червей.
  2. С помощью стерильной стеклянной пипетки, передачи червей подготовлен в стерильных условиях от плиты до 15 мл пластиковых пробирок, центрифуги на 2000 x g на 2 мин и удалить супернатант.
    1. Приостановите решение червей в 1 мл буфера M9. Передать microcentrifuge трубки, центрифуги на 300 x g за 2 мин, червей и удалить супернатант.
  3. Для трансдукции белка добавить 40 мкл Реагента трансфекции доставки и 20 мкл родной белка в нужной концентрации (обычно 40 мкм) и инкубации при комнатной температуре за 30 мин.
    1. В стерильных условиях используете стерильные стеклянные пипетки для передачи червей с шагом 4.2.1 в microcentrifuge трубка, содержащая инкапсулированные белка, чтобы дать общий объем 1060 мкл. место трубок горизонтально и погрозит 60 об/мин в 24 ° C, пожимая инкубатор для 8 h.
  4. В стерильных условиях добавить 4 мл раствора M9 Mot тарелку и передачи одной microcentrifuge трубки червей плюс наркотиков на пластину для Mot.
    1. Настройка трекера, повторив шаги 3.3 к 3.3.2.
    2. В стерильных условиях добавить 4 мл раствора M9 Mot тарелку и передачи одной microcentrifuge трубки червей плюс наркотиков на пластину для Mot.
    3. Место пластину Mot на стадии трекер, сфокусировать камеру на отдельных червя и начать запись. Когда закончите, ярлык пластину Mot и установить в одну сторону.
    4. Повторите шаги 4.4.1 и 4.4.3 для всех образцов.
    5. С помощью пипетки стеклянные, передачи червей в стерильных условиях от Mot пластины для пластиковых пробирок 15мл, центрифуги на 2000 x g на 2 мин удалить супернатант, передачи гранул на плиту FUDR и дать высохнуть в стерильных условиях.
    6. Повторите шаг 4.4.5 для всех образцов.
  5. Инкубируйте червей на 24 ° C до D6 взрослой жизни.
    Примечание: Возможны также несколько инкубаций антитела.
  6. Добавить 3 мл буфера M9 пластину Mot и использовать 2 мл раствора M9 мыть все черви из FUDR пластины на пластину для Mot.
    1. Настройка трекера, повторив шаги 3.3 к 3.3.2.
    2. Место пластину Mot на стадии трекер, сфокусировать камеру, как необходимо и начать запись. Когда запись закончена, или восстановить его для дальнейшего скрининга при желании отказаться от пластину Mot.
    3. Повторите шаги 4.6 к 4.6.2 для всех образцов.

5. анализ видеоданных

  1. После приобретения видео, выберите соответствующие параметры в GUI (рис. 2) программного обеспечения для анализа данных.
    1. Загрузить одно или несколько видео через функцию просмотра . Выберите папку назначения вывода. Убедитесь, что 600 до 1200 кадры используются для 30 s анализа.
      Примечание: Любой диапазон кадров могут быть проанализированы.
    2. Вставьте один пиксел на коэффициент пересчета мм, который будет 0,029 для визуализации 9 см Петри в полном разрешении. Выберите алгоритм отслеживания «держать мертвых».
      Примечание: Коэффициент преобразования будет зависеть используется поле зрения. Z-преобразование алгоритм может использоваться также в качестве альтернативы.
    3. Заполните параметры в разделе локация (Рисунок 2): Z используйте изображения = 100, обивка Z = 3, Std пикселей = 54, порог = 9, Открытие = 1, закрытие = 2. Настроить параметры фильтрации Минимальный размер = 20, максимальный размер = 180, червь как = 0,94.
    4. Настроить параметры формирование траектории : Максимальное расстояние перемещения = 10; Минимальная длина = 150, памяти = 10.
    5. Установите параметры изгибы и скорости . Используйте 1.8 для загиба порога, 0 для минимум изгибови 150 для кадров для оценки скорости.
    6. Настройка статистики погибших червя. Использование 5.0 для максимум избили в минуту и 1.0 для максимальной скорости.
    7. Выберите выходную папку. Задайте количество выходных кадров до 50. Задать Размер шрифта до 10.
      Примечание: При необходимости выберите одну или несколько областей, представляющих интерес (ROI).
  2. Проверьте параметры, используя следующий Пример функции. Вывод изображения примера и проверьте, что черви являются видимыми на протяжении 8 шагов Бинаризация (рис. 1).
  3. Используйте функцию запуска задания .
  4. Анализ текстовых файлов результата путем объединения отдельных результатов для всего набора данных. Используйте экспорт функции tsv в GUI.
    Примечание: При необходимости отдельных метрик червей может также рассматриваться для демографических исследований.
    1. Анализируйте данные с помощью пакета статистического программного обеспечения.

Результаты

Простота эксплуатации, многопараметрических анализа и высокую пропускную способность иллюстрированный WF-NTP протокол (рисунки 1 и 2) делает возможным определить очень небольшие изменения в поведение червя в очень точным образом. Платформа отображения информации основана на заказ опто механики, и он может быть собран с использованием 6 Монохромная камера MP, в сочетании с высоким разрешением объектив 16 мм фокусное расстояние для 1'' датчика, освещается с 8'' 8'' белая подсветка (см. Таблицу материалы и также ссылаться на36 для получения дополнительной информации). Соответствующее программное обеспечение WF-NTP написана на Python и был разработан для запуска на Windows платформах. Она работает на пользовательских собранный компьютер с 3,00 ГГц окта core процессоров и 64 ГБ оперативной памяти (ОЗУ). Программное обеспечение также была разработана для параллелизации работ и анализа видео, основанный в ОЗУ и процессор компьютера; т.е., машина с нижней расчет мощности приведет к менее видео параллельно. Настройки, которую мы используем в настоящее время оптимизирована для запуска ca. 16 видео параллельно и могут завершить анализ ca. 100 видео на ночь. Кроме того высокий уровень детализации в GUI WF-NTP настройки позволяет строже контролировать качество визуализации анализа. Графический интерфейс может использоваться напрямую загружать большие наборы данных в параллельных или отдельных видео; конкретные рамки также могут быть выбраны для детального анализа суб, вместе с пиксель коэффициент пересчета, который может быть использован для оценки поведенческих показателей. Один из двух различных отслеживания алгоритмов (держать мертвых и Z-преобразование) могут быть выбраны в зависимости от ли или не пользователь хотел бы рассмотреть парализованные животные в анализе. Параметр порог может быть соответственно настроенным с видео и экспериментальных качества. Открытие и закрытие параметры позволяют пользователю удалить шум и далее осуществлять Бинаризация функциональность. Skeletonizing алгоритм предлагает альтернативный метод анализа. Объект размер обрезков (фильтрация) обеспечивают дополнительный фильтр для фонового шума и червь как параметр позволяет пользователям рассматривать червей только объекты с эллипсоидальной формы, поэтому отличить от других объектов, которые могут иметь такой же размер пикселя черви. После этих операций Бинаризация все результирующие помечены регионы могут быть определены как отдельные червей и позиции этих регионов затем сохраняются для каждого кадра для последующего анализа и отслеживания. Эксцентриситет каждого отслеживаемого червя используется для оценки червь метрики, как степень червя, изгиб (BPM) как функцию от времени. Пользователи также могут выбрать количество кадров для держать червя в памяти программное обеспечение после столкновений, и количество пикселей, которые червь может перемещаться между кадрами также могут быть настроены различать животных от шума. Параметр длина минимум трек позволяет пользователю отменить червей, которые отслеживались для только несколько кадров. Других ключевых параметров, такие как изгибы и скорость, позволяют пользователю выбрать степень изгиба необходимо считать загиба тела и количество кадров, считается, что необходимо оценить скорость животных. Отключения параметров могут быть далее настроены для включения парализована животных. Выходные данные автоматически показывается в результирующих файлах. Эти значения рассматриваются как верхних пределов для оценки доли парализована животных. Пользователь также может выбрать одну или несколько областей, представляющих интерес. Эта функция особенно полезна для анализа субпопуляций червей и результат сортируется автоматически в файлы результатов. Параметр вывода позволяет пользователю выбрать папку вывода и количество отслеживания кадры, которые будут подготовлены для него. Различные наборы инструментов может также использоваться для дальнейшего анализа данных, такие как участок пути инструмент, который показывает отдельные червь треков и дактилоскопия инструмент, который позволяет пользователю создавать отпечатков пальцев карты.

Эта методология позволяет новые подходы, которые будут приняты, не только для биологических исследований C. elegans , но и для целей медицинских и фармакологических исследований, например высокопроизводительного скрининга генетической модификации и медикаментозного лечения. Мы продемонстрировали этот потенциал, описывая характеристика фенотипов крупных демографических исследований (N > 1000) различных моделей червь нейродегенеративные заболевания (frontotemporal деменции (FTD)39, болезни Паркинсона (PD)7 , Болезни Альцгеймера (AD)16,40и боковой амиотрофический склероз (ALS)19 (Рисунок 3А) и характеризующих последствия потенциальных терапевтических молекул с помощью модели червь PD18 и AD 15,12 (рис. 3b). Два маленьких молекул, скваламин18 и bexarotene15, вводили в концентрациях до 25 мкм PD (рис. 3b) и 10 мкм до AD38 (рис. 3b) червей, соответственно. Оба соединения показал ясно дозозависимый эффект в диапазоне концентраций испытания. Мы показали, что эта высокая точность измерений достигается путем увеличения числа червей, которые могут быть проанализированы по сравнению с традиционными методами (рис. 3 c). Мы свидетельствует о важности размер выборки (рис. 3 c) в молекулярной скрининга, а также как характеристика мутантных штаммов. Увеличение температуры от 20 ° C приводит к примерно половина AD червей, став парализована после 3 дней взрослой жизни. Червь населения были проверены в различных условиях, например, , когда черви, чрезмерно выражая 42-остатки формы амилоид β пептида (значения1-42) (AD черви) были подвержены тонкие температуры (рис. 3 c, слева Группа), когда значения1-42 было высказано в всех нейронов (рис. 3 c, Центральная панель), или когда AD червей были подвержены bexarotene (рис. 3 c, правая панель). Черви также были проанализированы от небольших трансформирования, случайно выбранных из полное поле зрения видео, полученные с WF-NTP (N баров < 50, желтый), подчеркнув сравнение сократительной способности этих червей с средняя подвижности населения всей червь (N < 1000). В всех панелей разница измеряется в целом червь населения представляется статистически значимое p ≤ 0,0001 (*).

WF-NTP протокол, описанные здесь также позволяет одновременная запись нескольких параметров (рис. 1b) для поддержки, оптимальным образом, внутренние проверки и разработки всеобъемлющей отпечатков широкий спектр условий по отношению к контрольной пробы, позволяя для значимого сопоставления через несколько исследований. Это мульти параметрический подход включает в себя одновременный анализ нескольких поведенческих особенностей, включая изгиб частоту, скорость, паралич ставка, размер, амплитуды изгиба и изгиб перемещения36. Это позволяет тысячи животных контролироваться очень подробно и очень высокую чувствительность и статистической значимости и предоставляет возможности для исследования больших групп населения. Эта процедура отслеживания также имеет преимущество, позволяя паралич исследования выполняться параллельно с другими поведенческие измерения, ключевой особенностью в молекулярной скрининговых исследований.

Результаты, достигнутые до настоящего времени в AD15,,3435 и PD18 лекарственных препаратов свидетельствуют о важности приобретения широкого поля зрения данных значительно увеличить количество животных, которые могут быть мониторинг в одном эксперименте, значительно уменьшается экспериментальной ошибки и значительно улучшение статистической достоверности исследований. На основе этих результатов, мы ожидаем, что WF-NTP протокол, который мы сделали доступными для сообщества36, будет значительно расширить использование C. elegans.

figure-results-8903
Рисунок 1: WF-NTP шаги анализа и примером отпечатков. () 1. Оригинальное видео. 2. фоновое изображение. 3. фон вычитается изображения. 4-6. Бинаризация шаги. 7-9. единый маркировки червей. (b) несколько фенотипов сообщается с отпечатков пальцев для дикого типа червей и червь модели PD и AD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-9556
Рисунок 2: графический пользовательский интерфейс (GUI) WF-NTP. Конкретные видео и выбранные кадры могут быть выбраны в GUI для анализа, и коэффициент пересчета пикселей может быть вставлен, после чего проводится анализ с одним из двух алгоритмов данной отслеживания. Это позволяет выбрать степень изгиба необходимо считать загиба тела, а также количество кадров, необходимых для оценки скорости животных. Тела поворотах и скорость порогов можно определить статистику парализована червя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-10371
Рисунок 3: примеры приложений, поддерживающих WF-NTP методом. (a) приложения WF-NTP в крупных демографических исследований (N > 1000) измерений BPM для моделей C. elegans целого ряда нейродегенеративных заболеваний, в том числе FTD, PD, AD и ALS. (b) приложения WF-NTP в лекарственных препаратах. (c) важность демографических исследований в чувствительность температуры, эффективность препарата и характеристика мутантный штамм. Фенотипы субпопуляций N < 50 (жёлтые столбики) сравниваются с теми, кто всего червь населения (N < 1000). Планки погрешностей указывают Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

Из-за быстрого расширения методов в области оптических наук стало возможным удовлетворить требование для автоматизированных методов в C. elegans исследований существенно новыми способами. В результате были разработаны и доступны через ряд цифровых отслеживания платформы20,41,42,,4344,45,46 за последние несколько лет для того, чтобы заменить ручной подсчет параметров, таких как скорость движения, изгиб частоты, паралич курс, а также более сложных форм поведения, таких как Омега повороты и измерения жизни. Самые последние автоматизированные платформы значительно улучшили воспроизводимость и чувствительность C. elegans учится41 и высокое качество данных на малых групп или даже отдельных животных. Мы решили продлить автоматизации анализа червя поведение, чтобы сделать его также можно оценить фенотипов когорты тысяч животных параллельно. Главное преимущество подхода изучения когорты червь является, что она позволяет для учета высокая внутренняя изменчивость червь поведение24 и тот факт, что исследования наркотиков лечения часто приводят к тонкие фенотипические изменения, которые сложно определить с достаточной статистической значимости, когда с помощью небольшой группы животных. Высокая мощность обнаружения (POD) действительно необходимо обнаружить с уверенностью значительных изменений в поведении и ограничить25ложных положительных результатов.

Здесь мы описали ряд протоколов, основанных на методе недавно сообщили автоматизированной проверки для C. elegans, широкое поле зрения нематода, отслеживания платформы (WF-NTP)36. Протокол, описанные здесь делится на 5 частей. Части 1 и 2 описывают подготовку населения больших червя. Важнейшие шаги являются стерильности условий работы и подготовка реагентов и пластин, необходимых для выполнения экспериментов. Мы отмечаем, что, за счет увеличения пропускной способности, предоставленные настоящим Протоколом, по сравнению с другими отбора методологий36, она также требует увеличения количества реагентов; Этот фактор необходимо тщательно рассматривать в экспериментальный дизайн. Мы также отмечаем, что отбеливание шаг имеет решающее значение и должна испытываться заранее как большое количество яиц, и здоровых личинки необходимы для запуска этих экспериментов. Часть 3 настоящего Протокола сведения для доставки препаратов в твердых носителей и экран червь населения. Мы отмечаем, что эта часть протокола сильно зависит количество наркотиков и концентрации препарата быть проверен пользователем параллельно. Полная автоматизация процедуры проверки и быстрого сбора сдвиг ограничивающим шаг от поведенческие наблюдения Подготовка реагента и роста и синхронизации больших червь населения. Основные шаги в ходе скрининг являются тайминги записи и любой червь, обработка шагов (например, передача червей от NGM пластины для отслеживания платформы). Протокол, описанные здесь приведен пример предназначен для экрана червей до 9 дней в течение взрослой жизни; Однако этот протокол может быть легко адаптированы для экрана как много времени, как желания пользователя, например, 18 дней подряд36. Часть 4 затем иллюстрирует применение протокола доставить белковых молекул (например, антител и молекулярных сопровождающих) в C. elegansи показывает, как протокол, показано в части 1-3 можно легко настроить, в зависимости от желаемого приложения. Мы демонстрируем, как эта процедура может быть расширена, не только для доставки наркотиков как молекул, но и для отправления молекулярной сопровождающим или антител37. Первые четыре шага (части) проводятся в стерильных условиях, если не указано иное. Все жидкие компоненты должны быть газобетона до использования и инкубации шаги должны выполняться на 70% относительной влажности. В части 5 мы опишем, как использовать пакет программного обеспечения, в сочетании с этапа отслеживания. Это программное обеспечение было пользовательских предназначен для анализа данных WF-NTP, связанные с поведением населения больших червя. Мы предлагаем, что пользователь соответствует рекомендации, представленные в части 5 для анализа данных; Однако эти параметры зависят от конкретных особенностей записанные видео (то есть, fps, поле зрения, разрешение видео, количество приобретенных кадров). Следующий пример функции в графический интерфейс был разработан для облегчения оценки правильные параметры до анализа.

Эти серии протоколов позволяют анализировать фенотипов больших популяций C. elegans (в настоящее время до 5000 отдельных червей параллельно) эффективно, уменьшения артефактов вследствие внутренней изменчивости поведения животных , по согласованию с предварительные исследования по мощности обнаружения, необходимых для достижения статистической значимости для исследования C. elegans25. Платформа использует систему камер высокого разрешения, способна записывать изображения большого числа животных на высокой скорости, при записи одновременно несколько большие когорты. Высокая производительность и высокая пропускная способность протокола WF NTP делает его возможным определить очень небольшие изменения в поведение червя в очень точным образом. Таким образом эта методика позволяет новые подходы могут считаться не только для изучения биологии C. elegans, но дополнительно для медицинских и фармакологических исследований, например высокопроизводительного скрининга генетической модификации и наркотиков лечение. Эта процедура также имеет то преимущество, позволяя паралич исследования выполняться параллельно с другими поведенческие измерения, ключевой особенностью в молекулярной скрининговых исследований.

Результаты, достигнутые до настоящего времени в программах обнаружения наркотиков AD15,,3435 и PD18 продемонстрировать важность сбора данных широкого поля зрения в существенного увеличения количество животных, которые могут контролироваться в одном эксперименте, тем самым значительно уменьшается экспериментальной ошибки и значительно улучшение статистической достоверности исследований. Хотя нынешний подход, описанный в этом протоколе была сосредоточена на решении проблем в области лекарственных препаратов, мы надеемся, что методология будет широко принят в сообществе, и что его применение будет продлен до сложных генетических и поведенческие исследования и расширить количество фенотипов, которые в настоящее время обнаружено.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что не существует никакого конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Центром по сворачиванию заболеваний (CMD). АВС поддерживается старший стипендия исследований Альцгеймера общества, Великобритания (Грант номер 317, AS-SF-16-003). Штаммы C. elegans были получены из Caenorhabditis elegans генетического центра (CGC).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Consumable reagents
monobasic potassium phosphateSigma AldrichP0662
dibasic sodium phosphateSigma AldrichS3264
sodium chlorideSigma Aldrich13422
magnesium sulphateSigma AldrichM7506
AgarSigma AldrichA1296
Difco casein digestScientific Laboratory Supplies211610
calcium chloride dihydrateSigma AldrichC3881
cholesterolAcros110190250
absolute ethanolVwr20821.33
5-Fluoro-2'-deoxyuridine 98%Alfa AesarL16497.ME
LB medium capsulesMP biomedicals3002-031
13% sodium hypochloriteAcros OrganicsAC219255000
Sodium hydroxideFisher ChemicalS/4880/53
NameCompanyCatalog NumberComments
Strains
E. coli strain OP50Supplied by CGCOp50E coli strain
C. elegans strain wild typeSupplied by CGCN2C. elegans strain
C. elegans strain ADSupplied by CGCGMC101C. elegans strain
C. elegans strain PDSupplied by CGCNL5901C. elegans strain
C. elegans strain ALSSupplied by CGCAM725C. elegans strain
C. elegans strain TauSupplied by CGCBR5485C. elegans strain
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Tactrol 2 AutoclavePriorclave
9 cm sterile Petri dishesFisher Scientific11309283
2 L erlenmeyer flasksScientific Laboratory SuppliesFLA4036
Nalgene 1 L Centrifuge potsFisher Scientific3120-1000
RC5C plus floor mounted centrifugeSorvall9900884
15 mL centrifuge tubesFisher Scientific05-539-12
Heraeus Multifuge X3RThermofisher scientific75004515
Inoculating SpreadersFisher Scientific11821741
M4 multipetteEppendorf4982000012
P1000 pipetteEppendorf Research Plus
P200 pipetteEppendorf Research Plus3123000055
P10 pipetteEppendorf Research Plus3123000020
1,000 μL low retention tipsSarstedt
300 μL low retention tipsSarstedt70.765.105
10 μL low retention tipsSarstedt70.1130.105
pipeteboy 2VWR612-0927
50 mL serological pipetteAppleton WoodsCC117
25 mL serological pipetteAppleton WoodsCC216
10 mL serological pipetteAppleton WoodsCC214
glass pipette 270 mmFisherbrandFB50255Camera for videos recording
pulsinPolyplus Transfection501-04Transduction reagent
Multitron Standard shaking incubatorInfors HTINFO28573
air dusterOffice Depot1511631
NameCompanyCatalog NumberComments
WF-NTP Tracker Components and Image Capture Software
8'' by 8'' BacklightEdmond Optics88-508Tracker component
16 mm FL high resolution lens for 1'' sensorEdmond Optics86-571Tracker component
6 Mpx cameraEdmond Optics33540Tracker component
FlyCapture SoftwarePointGreySDK v2.12Image capture software
WF-NTP SoftwareCambridge Enterprisev1.0Image analysis software
Office PackageMicrosoftOffice 365Statistical analysis software

Ссылки

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (5), 387-399 (2006).
  3. Nollen, E. A. A., et al. Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 101 (17), 6403-6408 (2004).
  4. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  5. Van der Goot, A. T., et al. Delaying aging and the aging-associated decline in protein homeostasis by inhibition of tryptophan degradation. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA. 109 (37), 14912-14917 (2012).
  6. Van Ham, T. J., et al. Identification of MOAG-4/SERF as a regulator of age-related proteotoxicity. Cell. 142 (4), 601-612 (2010).
  7. Van Ham, T. J., et al. C. elegans model identifies genetic modifiers of α-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genetics. 4 (3), e1000027 (2008).
  8. Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes & Development. 19 (13), 1544-1555 (2005).
  9. Sarin, S., Prabhu, S., O'Meara, M. M., Pe'er, I., Hobert, O. Caenorhabditis elegans mutant allele identification by whole-genome sequencing. Nature Methods. 5 (10), 865-867 (2008).
  10. Kim, Y., Sun, H. Functional genomic approach to identify novel genes involved in the regulation of oxidative stress resistance and animal lifespan. Aging Cell. 6 (4), 489-503 (2007).
  11. Dillin, A., et al. Rates of Behavior and Aging Specified by Mitochondrial Function During Development. Science. 298 (5602), 2398-2401 (2002).
  12. Lee, S. S., Kennedy, S., Tolonen, A. C., Ruvkun, G. DAF-16 target genes that control C. elegans life-span and metabolism. Science. 300 (5619), 644-647 (2003).
  13. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nature Reviews. Genetics. 3 (5), 356-369 (2002).
  14. Alavez, S., Vantipalli, M. C., Zucker, D. J. S., Klang, I. M., Lithgow, G. J. Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan. Nature. 472 (7342), 226-229 (2012).
  15. Habchi, J., et al. An anticancer drug suppresses the primary nucleation reaction that initiates the production of the toxic A 42 aggregates linked with Alzheimers disease. Science Advances. 2 (2), e1501244 (2016).
  16. Wu, Y., et al. Amyloid- -Induced pathological behaviors are suppressed by ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 26 (50), 13102-13113 (2006).
  17. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 92 (20), 9368-9372 (1995).
  18. Perni, M., et al. A natural product inhibits the initiation of a-synuclein aggregation and suppresses its toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the USA. 114 (6), E1009-E1017 (2017).
  19. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genetics. 5 (3), e1000399 (2009).
  20. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. Journal of visualized experiments. (95), 52321 (2015).
  21. Machino, K., Link, C. D., Wang, S., Murakami, H., Murakami, S. A semi-automated motion-tracking analysis of locomotion speed in the C. elegans transgenics overexpressing beta-amyloid in neurons. Frontiers in Genetics. 5, 202 (2014).
  22. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  23. Van der Goot, A. T., Nollen, E. A. A. Tryptophan metabolism: entering the field of aging and age-related pathologies. Trends in Molecular Medicine. 19 (6), 336-344 (2013).
  24. Lublin, A. L., Link, C. D. Alzheimer's disease drug discovery: in vivo screening using Caenorhabditis elegans as a model for β-amyloid peptide-induced toxicity. Drug Discovery Today: Technologies. 10 (1), e115-e119 (2013).
  25. Petrascheck, M., Miller, D. L. Computational analysis of lifespan experiment reproducibility. Frontiers in genetics. 8 (JUN), 92 (2017).
  26. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E. X., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nature Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  27. Wang, S. J., Wang, Z. -. W. Track-a-worm, an open-source system for quantitative assessment of C. elegans locomotory and bending behavior. PLoS ONE. 8 (7), e69653 (2013).
  28. Faumont, S., et al. An image-free opto-mechanical system for creating virtual environments and imaging neuronal activity in freely moving Caenorhabditis elegans. PLoS ONE. 6 (9), e24666 (2011).
  29. Tsibidis, G. D., Tavernarakis, N. Nemo: a computational tool for analyzing nematode locomotion. BMC Neuroscience. 8, 86 (2007).
  30. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  31. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. T. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  32. Restif, C., et al. CeleST: computer vision software for quantitative analysis of C. elegans swim behavior reveals novel features of locomotion. PLoS Computational Biology. 10 (7), e1003702 (2014).
  33. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: a platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes. PLoS ONE. 3 (5), e2208 (2008).
  34. Habchi, J., et al. Systematic development of small molecules to inhibit specific microscopic steps of Aβ42 aggregation in Alzheimer's disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (2), E200-E208 (2017).
  35. Aprile, F. A., et al. Selective targeting of primary and secondary nucleation pathways in Aβ42 aggregation using a rational antibody scanning method. Science Advances. 3 (6), e1700488 (2017).
  36. Perni, M., et al. Massively parallel C. elegans tracking provides multi-dimensional fingerprints for phenotypic discovery. Journal of neuroscience. 306, 57-67 (2018).
  37. Perni, M., et al. Delivery of Native Proteins into C. elegans Using a Transduction Protocol Based on Lipid Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 7380 (2017).
  38. McColl, G., et al. Utility of an improved model of amyloid-beta (Aβ₋) toxicity in Caenorhabditis elegans for drug screening for Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 7 (1), 7380 (2012).
  39. Fatouros, C., et al. Inhibition of tau aggregation in a novel Caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  40. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-Amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).
  41. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: the Online Review of C. elegans Biology. , 1-17 (2012).
  42. Hardaker, L. A., Singer, E., Kerr, R., Zhou, G. T., Schafer, W. R. Serotonin modulates locomotory behavior and coordinates egg-laying and movement in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurobiology. 49 (4), 303-313 (2001).
  43. Tsechpenakis, G., Bianchi, L., Metaxas, D., Driscoll, M. A novel computational approach for simultaneous tracking and feature extraction of C. elegans populations in fluid environments. IEEE Transactions on Bio-medical Engineering. 55 (5), 1539-1549 (2008).
  44. Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry. BMC Neuroscience. 10, 84 (2009).
  45. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H., Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. 5, 115 (2004).
  46. Stroustrup, N., et al. The caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

141C elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены