Приложения пространственно временных карт и методы анализа частиц для количественного определения внутриклеточных Ca2 + сигнализации в Situ

Резюме

Генетически закодированный Ca^{2 +} показателей (GECIs) радикально изменили как на месте Ca^{2 +} изображения производится. Для максимального восстановления данных от таких записей, необходим соответствующий анализ Ca^{2 +} сигналов. Протоколы в настоящем документе облегчить количественную оценку Ca^{2 +} сигналов, записанная на месте с помощью пространственно-временных сопоставления и анализа на основе частиц.

Аннотация

CA^{2 +} изображений изолированных клеток или определенные типы клеток в неповрежденной ткани часто показывает сложные узоры Ca^{2 +} сигнализации. Эта деятельность требует тщательного и углубленного анализа и количественной оценки, чтобы захватить как можно больше информации об основных событиях как можно скорее. Пространственных, временных и интенсивности параметров присущих Ca^{2 +} сигналов, таких как частота, продолжительность, распространения, скорости и амплитуды может предоставить некоторые биологические информацию, необходимую для внутриклеточной сигнализации. Высоким разрешением Ca^{2 +} обычно визуализации результатов в приобретении данных большого размера файлов, которые отнимают много времени процесса с точки зрения перевода изображений информации в количественные данные, и этот процесс может быть восприимчивым к человеческой ошибки и предвзятости. Анализ Ca^{2 +} сигналов от клеток на месте обычно основывается на простой интенсивности измерения из произвольно выбранных областей интереса (ROI) в поле зрения (FOV). Этот подход игнорирует большую часть важных сигналов информацию, содержащуюся в ПЗ. Таким образом чтобы максимизировать восстановления информации из такого высокого разрешения записи, полученные с Ca^{2 +}красителей или optogenetic Ca^{2 +} требуется изображений, соответствующих пространственных и временных анализ Ca^{2 +} сигналов. Протоколы, изложенных в настоящем документе будет описывать, как можно получить большой объем данных от Ca^{2 +} изображений записи для облегчения более полный анализ и количественная оценка Ca^{2 +} сигналов, записанная из клеток, используя комбинацию пространственно-временных карта (СТМ)-на основе анализа и анализа на основе частиц. Протоколы также описывают как различные модели Ca^{2 +} сигнализации наблюдаемых в различных клеток, которые население на местах могут быть проанализированы надлежащим образом. Для иллюстрации, метод будет проверять Ca^{2 +} сигнализации в специализированных популяции клеток в тонком кишечнике, интерстициальных клеток Кахаля (МУС), с помощью GECIs.

Введение

CA^{2 +} является вездесущий внутриклеточным messenger, который контролирует широкий спектр клеточных процессов, таких как мышцы сжатия^1,2, метаболизм³, клетки распространения^{3,4, 5}, стимулирование нейромедиатора релиз на нерв терминалы^6,7и активация транскрипции факторы в ядре. ⁷ внутриклеточных Ca^{2 +} сигналы часто принимают форму переходных фасады в цитозольной Ca^{2 +}, и они могут быть спонтанным или возникают от стимуляции агонистов в зависимости от типа ячейки⁸. Пространственных, временных и интенсивности параметров присущих Ca^{2 +} сигналов, таких как частота, продолжительность, распространения, скорости и амплитуды может предоставить биологической информации, необходимой для внутриклеточных сигнальных^{5, 7 , 9}. сигналы цитоплазматических Ca^{2 +} может быть результатом притока Ca^{2 +} из внеклеточного пространства или через Ca^{2 +} освобождение от эндоплазменный ретикулум (ER) через Ca^{2 +} релиз каналы, такие как рианодиновыми рецепторы (RyRs) и рецепторов инозит tri фосфат (IP₃Rs)¹⁰. RyRs и IP₃Rs может как способствовать поколения Ca^{2 +} сигналов и согласованные открытие этих каналов, которые в сочетании с различными Ca^{2 +} приток механизмов может привести к множество Ca^{2 +} сигнализации модели которые формируются в цифрах и открыть вероятность Ca^{2 +} приток каналов, выражение профиль Ca^{2 +} релиз каналов, близость между Ca^{2 +} приток и выпуска каналы и выражение и распространение Ca^{2 +} белков reuptake и экструзии. CA^{2 +} сигналы могут принимать форму единообразных, длительный, высокой интенсивности глобальных колебаний, которые может длиться несколько секунд или даже минут, распространяющихся межклеточной и внутриклеточной Ca^{2 +} волны, которые могут пересекать внутриклеточных расстояния более 100 мкм в^{10,11,12,13,14,,1516}или более краткий, пространственно-локализованных событий как Ca^{2 +} искры и Ca^{2 +} затяжек, которые происходят на десятки миллисекунд сроками и распространения менее 5 мкм^17,18,19,20.

Люминесцентная микроскопия широко используется для мониторинга Ca^{2 +} сигнализации в изолированных и культивируемых клеток и неповрежденной ткани. Традиционно эти эксперименты связаны с использованием флуоресцентных Ca^{2 +} показателей, ratiometric и не ratiometric красители например Fura2, Fluo3/4 или Rhod2, среди других ^21,,22-²³. Эти показатели были разработаны для быть проницаемой мембраны клетки и затем стать в ловушке клеток путем расщепления эфирную группу через эндогенные эстераз. Связывание Ca^{2 +} с высоким сродством показателями вызвали изменения в флуоресценции, когда клетки и ткани были освещены соответствующие длин волн света. Использование показателей клеток проницаемых Ca^{2 +} значительно расширить наше понимание Ca^{2 +} сигнализации в живых клетках и пространственное разрешение и количественной оценки этих сигналов, что не было возможно, опробование Ca^{2 +} сигналов через другие средства, такие как электрофизиологии. Однако традиционные Ca^{2 +} показатели имеют ряд ограничений, таких как Фотообесцвечивание, которое происходит через расширенный записи периодов²⁴. В то время как новые Ca^{2 +} индикатор красителей, таких, как Cal520/590 значительно улучшить сигнал шум соотношения и способность обнаруживать местных Ca^{2 +} сигналы²⁵, проблемы с Фотообесцвечивание может по-прежнему остаются проблемой для некоторых исследователей ^26,27,28. Резкий Фотообесцвечивание также ограничивает масштаб, скорость загрузки изображений, и резолюции, который может использоваться для записи, как увеличение мощности объективных и более высокие темпы захвата изображений требуется увеличение интенсивности света возбуждения, увеличивает Фотообесцвечивание.

Эти ограничения традиционных Ca^{2 +} индикатор красители усугубляются при записи Ca^{2 +} сигналов на местах, например при записи внутриклеточных Ca^{2 +} сигналы от нетронутыми тканей. Из-за выше проблемы, Визуализация Ca^{2 +} сигналов на месте с использованием клеток проницаемых Ca^{2 +} показателей была ограничена увеличения малой мощности и сниженные ставки захвата изображения, ограничивает возможности следователей для записи и количественно височно или пространственно ограниченных субцеллюлярные Ca^{2 +} сигналов. Таким образом было трудно захватить, проанализировать и оценить пространственные и временные сложности Ca^{2 +} сигналов, которые могут быть важны в поколение желаемого биологических реакций, как описано выше. Анализ Ca^{2 +} сигналов от клеток на месте обычно основывается на простой интенсивности измерения из выбранных областей интереса (ROI) в поле зрения (FOV). Произвольный выбор количество, размер и положение трансформирования, зависит от прихоти исследователя, может серьезно смещения полученные результаты. А также присущи предвзятости с анализом ROI, этот подход игнорирует большую часть важных сигналов информация, содержащаяся в ПЗ, как динамический Ca^{2 +} события в пределах произвольно выбранной ROI отбираются для анализа. Кроме того анализ Руа не для предоставления сведений о пространственных характеристик Ca^{2 +} сигналов наблюдается. Например, это не возможно провести различие между увеличением Ca^{2 +} в результате распространения Ca^{2 +} волна и высоко локализованных Ca^{2 +} релиз событий из таблицы Ca^{2 +} сигналов в пределах ROI.

С появлением генетически закодированный Ca^{2 +} показателей (GECIs), радикально изменилась, как Ca^{2 +} изображений может быть выполненной в situ^{29,30,,3132,33} . Есть несколько преимуществ использования GECIs над красители. Наиболее важным, возможно, что выражение ГЕЧИ может быть выполнена определенным образом клеток, что уменьшает нежелательные фон загрязнения от клеток не интерес. Еще одним преимуществом GECIs над традиционными Ca^{2 +} показателей является, что Фотообесцвечивание уменьшается (флуоресценции и, как следствие, Фотообесцвечивание происходит только когда клетки являются активные), по сравнению с краситель загружены образцы, особенно на высоких увеличение и высокие показатели образа захвата³⁴. Таким образом, формирование изображений с GECIs, такие, как GCaMP серии optogenetic датчиков, предоставляет следователям возможность записи краткие, локализованные субклеточном Ca^{2 +} сигналов в situ и расследовать Ca^{2 +} сигнализации в клетках в течение их родной среды, которые ранее не удалось. Для максимального восстановления информации из такого высокого разрешения записи, соответствующие пространственной и временной анализ Ca^{2 +} сигналов не требуется. Следует отметить, что, хотя GECIs может предложить некоторые ясные преимущества, недавние исследования показали, что Ca^{2 +} изображений могут быть успешно выполнены из больших популяций различных классов нейрохимических нейронов одновременно с использованием обычных CA^{2 +} индикаторы, которые генетически не кодируются в животных³⁵. Этот подход используется post hoc иммуногистохимия выявить несколько различных классов нейронов стрельбы на высоких частотах в синхронизированных выстрелов и избегать потенциал, что генетические модификации для животного может помешали физиологических поведение следователь стремится понять^35,36.

Протоколы, изложенных в настоящем документе облегчить более полный анализ и количественная оценка Ca^{2 +} сигналов, записанные с клетки на месте, используя комбинацию пространственно-временных карты (СТМ)-на основе анализа и анализа на основе частиц. Протоколы также описывают как различные модели Ca^{2 +} сигнализации наблюдаемых в различных клеток, которые население на местах могут быть проанализированы надлежащим образом. Для иллюстрации, метод будет проверять Ca^{2 +} сигнализации в специализированных популяции клеток в тонком кишечнике, интерстициальных клеток Кахаля (ICC). ICC – специализированные клетки желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), которые экспонат динамическое внутриклеточных Ca^{2 +} сигнализации, как визуализируются с помощью мыши, выражая GCaMPs^{37,,3839,40, , 41}-⁴². CA^{2 +} переходные процессы в МУС связаны с активации Ca^{2 +}-активированный Cl^– (в формате Ano1) каналы, которые играют важную роль в регуляции возбудимости кишечных гладкомышечные клетки (SMCs)^{43, 45 44,}. Таким образом изучение Ca^{2 +} сигнализации в МУС имеет основополагающее значение для понимания кишечной моторики. Мышиных тонкой кишки служит прекрасным примером для этой демонстрации, поскольку существует два класса МУС, которые анатомически разделены и могут быть визуализированы самостоятельно: я) ICC расположены в районе между круговой и продольных гладких мышц слои, окружающие myenteric сплетение (ICC-MY). Эти клетки служат кардиостимулятор клетки и генерации электрической активности, известный как медленные волны^46,47,,4849; II) ICC также расположены среди сплетения, богатые в терминалах двигательных нейронов (глубокие мышечные сплетения, таким образом ICC-DMP). Эти клетки служат посредниками ответов на кишечные мотор синапсах^37,,3940,50. ICC-MY и ICC-DMP морфологически отличаются, и их Ca^{2 +} сигнализации поведения радикально отличаются для решения их конкретных задач. ICC-MY севрюги в форме и образуют сеть взаимосвязанных клеток через разрыв соединения^51,52. CA^{2 +} сигналов в ICC-мой манифест как краткие и пространственно-локализованных Ca^{2 +} релиз событий, происходящих на нескольких сайтах асинхронно через ICC-моя сеть как визуализация в ПЗ (образы с 60 X цель)³⁸. Эти асинхронные сигналы височно организованы в 1 секунду кластеров, что, когда Табулированы вместе, сумма нетто 1 s сотовой увеличение Ca^{2 +}. Эти сигналы распространения ячеек в пределах сети МУС и поэтому организовать Ca^{2 +} сигнализации, сгенерированные из субклеточном сайты ткани широкие Ca^{2 +} волна. Височной группирования и суммирования Ca^{2 +} сигналов в ICC-мой был назван Ca^{2 +} переходных кластеры (CTCs)³⁸. ЦОК происходит ритмично (например очень похожи длительностей и аналогичные периоды между CTCs) 30 раз в минуту в мыши. И наоборот ICC-DMP шпинделя формы клетки, некоторые с вторичных процессов, которые распределить между SMCs и варикозной нервных процессов, а не самостоятельно формируют сети^51,52. ICC-DMP формы разрыв соединения с SMCs, однако и функции в рамках этой более синцития, известный как SIP синцития⁵³. CA^{2 +} сигналы происходят в нескольких местах вдоль длины клеток, но эти переходные процессы не увлекаемого или височно кластеризованный, как отмечено в ICC-мой³⁷. CA^{2 +} сигналов в ICC-DMP происходят на основе стохастической, с переменной интенсивности, длительности и пространственных характеристик. Протоколы ниже, на примере Ca^{2 +} сигнализации в ICC-мой и ICC-DMP, описывают методы для анализа сложных сигналов в конкретных типах клеток на месте. Мы использовали индуцибельной Cre-Lox p системы выразить GCaMP6f исключительно в МУС, после вызывающих активацию Cre-рекомбиназа (Cre) обусловлен конкретной промоутера ICC (комплект).

протокол

Все животные и протоколы, в этом исследовании были в соответствии с национальных институтов здравоохранения руководство для ухода и использования лабораторных животных. Все процедуры были утверждены Комитетом правомерного использования животных и уход на Университет Невады в Рено.

1. поколение KitGCaMP6f мышей

1. Крест Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f мышей) и c комплект^{+/ Cre-ERT2} (комплект-Cre мышей) для создания МУС конкретных GCaMP6f выражая животных (мышей Kit-Cre-GCaMP6f).
   Примечание: GCaMP6f был использован из-за его сообщил эффективности отчетности локализованные, краткие внутриклеточных Ca^{2 +} сигналы на месте, так и in vivo⁵⁴.
2. Придать мышей Kit-Cre-GCaMP6f с тамоксифен в возрасте 6 – 8 недель, чтобы побудить Cre рекомбиназа активации и последующие выражения GCaMP6f в МУС (рис. 1).
   1. Чтобы создать решение тамоксифен, распустить 80 мг тамоксифен (см. Таблицу материалы) в 800 мкл этанола (см. Таблицу материалы) в кювет и вихревые за 20 минут.
   2. Добавьте 3,2 мл сафлоровое масло (общий) для создания решения по 20 мг/мл и затем sonicate за 30 минут до инъекции.
   3. Придать мышей (внутрибрюшной инъекции; IP) с 0,1 мл раствора (2 мг тамоксифен) тамоксифен для трех дней подряд. Подтвердите GCaMP6f выражение, Генотипирование и использовать мышь через 10 дней после первого введения.
      1. Генотип мышей путем отсечения небольшой кусок уха из каждого животного. Затем используйте метод отчаянный⁵⁵ для геномной ДНК изоляции инкубировать уха клипы на 95 ° C 60 мин в 75 мл NaOH и затем нейтрализации 75 мл трис-буфер. Используйте стандартное PCR для определения генотипа каждого животного, 2 мл в 20 мл реакции с GCaMP6f конкретных грунтовки⁵⁶ДНК. Запуск 10 мл ПЦР продукта на 2% агарозном геле для определения дикого типа (297 bp) и мутанта (~ 450 bp) полос.

2. Подготовка тканей для Ca^{2 +} изображений

1. Обезболивают мышей при вдыхании с изофлюрановая (4%, см. Таблицу материалы) в вентилированные капюшон и затем жертву от шейки матки дислокации.
2. С помощью острых ножниц открыть брюшке мышей, удалите тонкой кишки и место в растворе Кребса-звонарь бикарбонат (KRB). Открыть в тонком кишечнике на границе верхней брыжеечной и смыть содержимое любого внутрипросветная с KRB. Используя острые Анатомирование, удалите слои слизистой оболочки и суб слизистой.
   Примечание: KRB решение имеет следующий состав (в мм): NaCl 118,5, хлористого калия 4,7, CaCl₂ 2.5, MgCl₂ 1.2, NaHCO₃ 23,8, KH₂PO₄ 1.2, декстроза 11.0. Это решение имеет рН 7,4 при 37 ° C, когда кипела равновесия с 95% O₂- 5% CO₂.
3. С помощью небольшой булавки, контакта ткани тонкой кишки на базе тома 5 мл, Sylgard покрытием блюдо диаметром 60 мм с круговой гладкой мускулатуры, вверх. Perfuse подготовка с утепленным KRB решения при 37 ° C для уравновешивания продолжительностью 1 час перед экспериментов.
4. После этого периода уравновешивания, выполняют на месте Ca^{2 +} томография малого кишечника ICC-мой и ICC-DMP с помощью конфокальной микроскопии (изображения в этот протокол были приобретены с Конфокальный микроскоп оснащен спиннинг диск). Из-за преимущества GECIs, описанных выше, использовать промежуток времени изображения с высоким разрешением (> 30 кадров в секунду, FPS) в сочетании с высокой мощности целей (60-100 x) приобрести фильмы динамических Ca^{2 +} сигналов в МУС.
   Примечание: Чтобы уменьшить движение ткани, применить nicardipine (0,1-1 мкм) во время записи, как описано ранее^{37,,3839,40,41}.
5. Отличить ICC-MY и ICC-DMP в тонкой кишке, используя их различных анатомических месте, морфология и базальной Ca^{2 +} деятельности шаблоны.
   1. Найдите ICC-мой на уровне myenteric сплетения, между слоями круговой и продольных гладких мышц кишечника. Они являются звездчатой формы, образуя подключенной сети (рис. 3A). ЦОК (описанные выше) распространить через сеть ICC-мой с обычным явлением ~ 30 циклов в минуту.
   2. И наоборот найти ICC-DMP в одной плоскости на уровне глубокой мышечной сплетения, между круговой гладкой мускулатуры и подслизистую сплетения. ICC-DMP не образуют сеть и шпинделя форме клетки (рисунок 2A), которые демонстрируют события не регулярное распространение и вместо этого огонь стохастические, локализованные внутриклеточного Ca^{2 +} транзиентов.
6. Независимо от приобретения программного обеспечения использовать сохраните фильмы как стек изображений TIFF.

3. анализ стохастических Ca^{2 +} сигналов в ICC-DMP с помощью пространственно временные сопоставления (STM)

1. Анализ в ICC-DMP с использованием пространственно временных сопоставление с сочетанием ImageJ (НИЗ, США, бесплатно скачать на http://imagej.nih.jov/ij) и пользовательские сделал программного обеспечения (Volumetry, версия G8d, GWH, открывающиеся на Mac OS, обратитесь к grant.hennig@ Хеннига Грант MED.uvm.edu относительно запросы для доступа к Volumetry и использования)
   Примечание: Альтернативный подход к полностью проанализировать эти пространственно временной карты с ImageJ только также приводится в последующих разделах (начало в шаге 3.9).
2. Открыть Volumetry и использование правой кнопкой мыши щелчков для открытия папок, содержащих файлы фильмов. Щелкните левой кнопкой мыши на файл фильма, чтобы быть проанализированы, чтобы открыть его в Volumetry (должен быть в несжатый формат TIFF). После открытия, фильм будет содержаться внутри граничит с голубой окна (фильм) который будет охватывать большую площадь экрана справа. В левой части экрана будет содержать участок окно (верхняя 4/5ths) и окно следы (Нижняя 1/5^th).
3. Отрегулируйте размеры фильма, удерживая нажатой клавишу SHIFT и одновременно прокрутка вверх с помощью средней кнопки мыши (MMB, уменьшает размер) или прокрутки вниз с MMB (увеличивает размер). Начать или остановить воспроизведение, нажав «A»; скорость воспроизведения можно отрегулировать, нажав вверх и вниз клавиши со стрелками.
4. Для создания STM с помощью Volumetry, нарисуйте ROI за всю ячейку, удерживая нажатой клавишу SHIFT при нажатии и перетаскивании левой кнопкой мыши. Отрегулируйте ориентацию ROI, прокрутка с MMB на углах ROI. Когда ROI находится в месте над ячейкой для анализа (рисунок 2A), использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' ROI STM-STMyAvg > xRow' и щелкните левой кнопкой мыши для создания STM клеточной активности в окне печати (есть также возможность выбрать ' STMxAvg > Одеского w «, который выбран будет зависеть ли ориентации клетки более выравнивается с x или ось y, например, ячейки выделены рисунок 2A больше ориентирован на оси y»).
5. Левый клик на STM в окне печати и нажмите «P» вычесть среднее фоновый шум и нажмите клавишу «H» для увеличения контрастности STM. Сохраните STM, щелкнув правой кнопкой мыши на нем для доступа к «STM нагрузки Save - сохранить STM как .tif» и затем левой кнопкой мыши, сохранить как TIFF.
6. Остальная часть анализа ICC-ПРСБ будет осуществляться в ImageJ. ImageJ состоит из двух основных компонентов, инструментов с фиксированной позицией на верхней части монитора и мобильных пользовательский интерфейс. С помощью ImageJ, откройте файл STM TIFF ICC-DMP Ca^{2 +} активности (файл-> открыть на панели инструментов для изображений J).
7. Открытые Volumetry создал STM, который будет иметь время вертикально ориентированные. ImageJ будет автоматически открывать файлы TIFF как RGB или 16-битные изображения. Для улучшения качества изображения, щелкните левой кнопкой мыши «Изображение» на панели инструментов ImageJ. Выделите первый вариант ' тип «выявить раскрывающегося меню различных форматов изображений, прокрутите ' 32-битный» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы изменить.
8. Чтобы сделать STM читаемым против времени слева направо, щелкните левой кнопкой мыши на панели ImageJ по следующему пути: «Имидж-Transform-повернуть 90 градусов влево». Это также возможно для создания STMs на месте Ca^{2 +} активности с использованием linescans с ImageJ, только без Volumetry и это подробно излагается ниже.
   Примечание: После того, как создаются STMs, они анализируются таким же образом, независимо от программного обеспечения был использован для их создания. Чтобы пропустить этот альтернативный метод для создания STM в ImageJ, перейдите к шагу 3.19.
9. Чтобы создать STM с ImageJ, откройте стек TIFF-файлы, которые составляют записи ICC-DMP Ca^{2 +} активности (файл-> открыть на панели инструментов ImageJ). ImageJ будет автоматически открывать файлы TIFF как RGB или 16-битные изображения. Для улучшения качества изображения, щелкните левой кнопкой мыши «Изображение» на панели инструментов ImageJ. Выделите первый вариант ' тип «выявить раскрывающегося меню различных форматов изображений, прокрутите ' 32-битный» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы изменить.
10. Фоновый шум (в результате auto флуоресценции или камеры шум) теперь должны быть вычтены из фильма. Щелкните левой кнопкой мыши функцию «Прямоугольное выделение» в интерфейсе ImageJ и рисовать ROI (левой кнопкой мыши и перетаскивания нужного размера и формы) на фоне флуоресцирования фильма.
11. После выбора ROI, щелкните левой кнопкой мыши на «Analyze» в панели инструментов ImageJ, и затем щелкните левой кнопкой мыши «Гистограмма» из раскрывающегося меню. Всплывающее окно появится вопросительно о диапазона значений пикселов для вычисления; ImageJ имеет значения ROI предварительно так левой нажмите «OK».
12. После нажатия кнопки «OK», новый всплывающее окно, содержащее гистограммы появится показаны распределение значений для пикселей шум фон в ROI. Принять к сведению среднее значение перечисленных ниже гистограммы, а затем закройте всплывающее окно.
13. Нажмите кнопку назад для 32-разрядных фильм и выберите весь ПЗ кликнув левой кнопкой мыши «Edit» на панели ImageJ, прокрутка «Выбор» и левой кнопкой мыши на «Выбрать все» показал в раскрывающемся меню.
14. Левый клик «Процесс» на панели инструментов ImageJ, перейдите к «Математика» и нажмите левую кнопку «Вычесть» показал в раскрывающемся меню.
15. Всплывающее окно появится, когда значение быть вычитанным из ПЗ может быть вставлен. Введите среднее значение приобрел от гистограмму в шаге выше 3.12 и нажмите «OK». ImageJ затем будет просить, чтобы обработать все фреймы в стеке TIFF (и не только один кадр фильма в настоящее время). Нажмите кнопку «Да».
16. После нажатия кнопки «Да», фильм будет черным. Чтобы исправить это, левой кнопкой «Изображение» в панели инструментов ImageJ и прокрутки над «Настройки». Щелкните левой кнопкой мыши на показал первый вариант для «Яркость/контрастность» (B и C). Это принесет вверх всплывающее окно, где могут быть изменены различные аспекты яркости и контраста. Щелкните левой кнопкой мыши на параметр «Auto», один раз раскрыть повышение качества в фильме. Оставьте этот B & C поп окно открытым для использования в будущем.
17. Для создания linescan, сначала щелкните правой кнопкой мыши на выделение линии в интерфейсе ImageJ выявить варианты для различных линий; Щелкните левой кнопкой мыши на «Сегментирована линии», чтобы выбрать его из списка. С выбранным инструментом «Сегментированный линия» использование единого оставил щелкает нарисовать линию по середине оси отдельных ICC-DMP. Каждый один левый клик будет исправить строки в этот конкретный момент и линии можно затем свободно переместить дальше под любым углом. По завершении линии двойной левый клик исправить линии в месте.
18. Щелкните левой кнопкой мыши «Изображение» на панели инструментов ImageJ и прокрутки над «Стеки» и щелкните левой кнопкой мыши на параметр «Изменить». Появится всплывающее окно; Щелкните левой кнопкой мыши на параметр «повернуть на 90 градусов», это будет ориентировать linescan слева направо, так что он может быть откалиброван и читать против времени на оси x, с пространством на оси y. Нажмите кнопку «OK» для создания STM.
19. Интенсивность STM будет создаваться на серого с высокой интенсивностью Ca^{2 +} сигналов как различной степени белого цвета, с белым или светло серый в зависимости от их интенсивности. Как правило контраст созданный linescan будет необходимо усовершенствовать. Сделать это, нажав «Auto» на B & C поп окно.
20. Интенсивность флуоресценции linescan представлен на STM значений произвольных точек. Для точного измерения амплитуды Ca^{2 +} сигналы от STM, значения флуоресценции STM (F) теперь должны быть нормализованы. Используя функцию «Прямоугольное выделение» в интерфейсе ImageJ, нарисуйте ROI на площади STM, который отображает области наиболее равномерное и наименее интенсивных флуоресценции (F₀).
21. Повторите шаги, предпринятые в 3.11-3.12 получить среднее значение (F₀) интенсивности в пределах выбранного ROI, а затем выберите всю STM кликнув левой кнопкой мыши на «Edit-выбор-выбрать все» от ImageJ инструментов.
22. Щелкните левой кнопкой мыши «Процесс» на панели инструментов ImageJ и перейдите к «Математика»; левый клик «Разбить» из выявленных вариантов. В последующих всплывающее окно введите среднее значение (F₀), полученные из шага 3.21. После деления всего STM (₀F) почернеют STM; Исправьте это, нажав «Auto» на B & C всплывающее окно. Linescan теперь откалиброван для амплитуды, с интенсивностью флуоресценции, выраженные как F/F₀.
23. В настоящее время STM будет отображать количество кадров в стеке TIFF на оси x и количество пикселей, представляющее длину клетки на оси y. В целях количественной оценки временнóй и пространственной информации от Ca^{2 +} сигналов, калибровки STM для пространства и времени. Левый клик «Изображение» в панели инструментов ImageJ и нажмите левую кнопку «Свойства». Появится всплывающее окно. В этом окне введите соответствующие значения для полностью калибровки STM.
24. Для «Ширина» укажите продолжительность времени требуется, чтобы захватить один кадр в секундах. Для примеров, частотой 5 FPS введите значение 0,2, для 50 FPS, введите значение 0,02, для 33 FPS введите значение 0,033 и т.д. Для «Пикселей высота» введите сколько мкм каждый пиксель представляет (будет зависеть от цели используется и используется для приобретения камеры). «Voxel глубины» остается в 1 перед нажатием кнопки «OK». Никакие другие параметры должны быть скорректированы в пределах окна.
    Примечание: После нажатия кнопки «OK», СТМ будет полностью калиброванные для амплитуды, пространства и времени. Амплитуда на СТМ будет выражаться как F/F_0, время на оси x будет выражаться в секундах и пространства на оси y будет выражаться в мкм (Рисунок 2Б). CA^{2 +} события на STM теперь готовы быть измерена, калиброванный STM также могут быть сохранены как единое изображение TIFF для анализа на более позднем этапе.
25. ImageJ имеет ряд построен в таблице подстановки цветом (ТМП), который может быть использован для цветовой код STM. Применить встроенный в LUT кликнув левой кнопкой мыши на панели инструментов ImageJ на пути «Image-поиска таблиц» и выбрать LUT для применения. Пользовательские сделал ТМП можно также импортировать STM, левой кнопкой мыши на панели инструментов ImageJ на пути «Файл-импорт-LUT» и затем выбрав LUT для импорта. К примеру STM, показано на рисунке 2 c имеет пользовательские LUT «QUBPallete» (Квинс университета Белфаст, Великобритания) применяется к нему, чтобы код теплые цвета (красный, оранжевый) как районы интенсивной Ca^{2 +} флуоресценции и холодные цвета (черный, синий) в области низких Ca^{2 +} флуоресценции.
26. Чтобы вставить амплитуды калибровочных бар чтобы указать диапазон амплитуд, представлены различные цвета, левый клик «Analyze» из панели инструментов ImageJ, выделите «Инструменты» и выявленных меню выберите «Калибровка Bar». Параметры приведены для размер, масштаб, диапазона и позиции на STM для калибровки бара; настроить эти параметры и нажмите кнопку «OK». Обратите внимание, что при вставке калибровочных бар, ImageJ создает новый STM, содержащие его, оставив исходную версию без калибровочных бар нетронутыми и отдельный.
    Примечание: Если поле «Наложение» отмечена при вставке калибровочных бар, не создается новый STM.
27. Чтобы начать анализ отдельных Ca^{2 +} события, щелкните левой кнопкой мыши на селекторе «Прямой линии» в интерфейсе ImageJ. Первоначально левой кнопкой мыши на STM, нарисуйте прямую горизонтальную линию через центр Ca^{2 +} события параллельно оси x (в отношении времени). Полная линия кликнув левой кнопкой мыши во второй раз (Рисунок 2D).
28. Нажмите кнопку «Анализировать» на панели инструментов ImageJ и щелкните левой кнопкой мыши на «Участок профиля». Новое поле появится с профилем участка Ca^{2 +} события (Рисунок 2E).
    Примечание: Параметр «Список» в этом поле будет генерировать список значений XY сгенерированный сюжет, который можно скопировать в программу электронных таблиц для создания трассировок, если того пожелают.
29. Для измерения амплитуды Ca^{2 +} события, представленные в участок профиля, щелкните левой кнопкой мыши на селекторе «Прямой линии» в интерфейсе ImageJ. Затем нарисуйте вертикальную линию от базовой участок профиля на пик Ca^{2 +} события; Длина линии (показано на интерфейсе ImageJ) будет представлять амплитуда события, выраженный в виде ΔF/Ф₀ (Рисунок 2E).
30. С помощью приобретенных амплитудное значение, продолжительность Ca^{2 +} мероприятия может быть измерен Рисование прямой линии по всей ширине события точке 50% максимальной амплитудой (полный срок на половину максимальной амплитуды, FDHM) или полной продолжительности события может быть измерена при желании (Рисунок 2E).
    Примечание: Экспериментаторы будет необходимо разработать конкретный критерий для Бинаризация действительный Ca^{2 +} события в этих записей. В наших экспериментах, Ca^{2 +} события были обозначены как будучи действительны для анализа, если его амплитуда > 15% максимальной амплитуды события в Секции управления записи. Однако эти пороговые значения будет зависеть от конкретных тканей и клеток под изучить и только произвольным руководящие принципы, которые требуют конкретных оптимизации для каждого типа ткани и клетки.
31. По прямой линии вдоль (рубильный) станок или надувки Ca^{2 +} событий участок профиля, темпы роста или падения может быть рассчитано соответственно. После того, как рисуется линия, курсор мыши может перемещаться до точки, где строка начинается и где заканчивается. Когда курсор находится в неподвижном состоянии через эти точки, x, y координаты для этот местоположение будет отображаться в нижней левой части интерфейса ImageJ. Таким образом, приобретая x, значений y, для которых начинается линии (x₁, y₁) и заканчивается (x₂, y₂), темпы роста или падения (ΔF/s) может быть рассчитана как наклон линии,₂ y - y₁ / x₂ - x₁ (Рисунок 2F ).
32. Для того чтобы вычислить распространением или пространственного распространения Ca^{2 +} события, щелкните левой кнопкой мыши на селекторе «Прямой линии» в интерфейсе ImageJ. Затем нарисуйте прямо вертикальную линию по длине Ca^{2 +} события вдоль оси y. Длина линии (показано на интерфейсе ImageJ) будет представлять пространственного распространения событий, выраженный в виде мкм (рис. 2 g).
33. Определение скорости распространения событий Ca^{2 +} Рисование линии вдоль распространение фронта события и расчета наклон линии. Это может осуществляться вручную аналогичным образом описано в шаге 3.32, путем определения x, значений y, для которых начинается линии (x₁, y₁) и заканчивается (x₂, y₂); Эти значения будут отображаться в нижней левой части интерфейса ImageJ когда курсор мыши находится на STM.
34. По коллекции нужные параметры для Ca^{2 +} событий количественной оценки бассейн среднего эти значения для создания средних значений для каждого параметра на основе за клеток; Кроме того место все необработанные значения в гистограмму распределения, чтобы показать их диапазон (Рисунок 2 H).

4. Количественная оценка ЦОК в ICC-мой с помощью частиц на основе анализа

1. Прежде чем анализировать фильмов в Volumetry с PTCLs, пространственных и временных калибровки фильма нужно будет вставляться в имя файла. Редактировать все файлы, которые будут проанализированы в Volumetry содержат в названии количество секунд, которые каждый кадр равен, а также количество микрон, которые каждый пиксель равен отделены одной тире, с ценностями, заключенная в квадратные скобки. Например, фильм, приобретенных на 33 FPS с целью 60 x (512 x 512) должны иметь [0.22-0.033] вставляется имя его файла.
2. Открыть Volumetry и использование правой кнопкой мыши щелчков для открытия папок, содержащих файлы фильмов. Щелкните левой кнопкой мыши на файл фильма, чтобы быть проанализированы, чтобы открыть его в Volumetry (рис. 3A, должен быть в несжатый формат TIFF).
3. Для того, чтобы точно рассчитать Ca^{2 +} сигналы от всего ПЗ, фильм будет сначала проходят дифференциации и сглаживания для удаления фона помех (шум камеры, auto флуоресценции и т.д.) и увеличить соотношение сигнал-шум. В окне фильма, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы вывести меню и с помощью правой кликов доступа ' СТК фильтр-дифференцировать ', щелкните правой кнопкой мыши снова, чтобы входное значение для дифференциации, нажмите клавишу ENTER и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить (за фильмы приобретенных на 33 FPS значение 2 (∆t = ± 66-70 мс) работает хорошо, значение увеличивается как коэффициент увеличения изображения захвата).
   Примечание: Дифференциация в этом контексте будет уменьшить интенсивность областей записи (пикселей), которые показывают не динамической активности за количество кадров указанного. Таким образом Если вставляется значение '2', каждый пиксель в каждом кадре запись анализируется, и если в течение этого периода не динамические изменения в кадр флуоресценции 1 пиксель до и 1 кадр после, интенсивность этих точек будет вычитаться из записи. Таким образом удаляется нединамическое фоновый шум и сигнал/шум увеличивается.
4. Гладкие дифференцированной кино, применив фильтр Гаусса. Щелкните правой кнопкой мыши в окне фильма, чтобы принести вверх меню и с помощью правой кликов доступа «СТК фильтр-Гаусс KRNL», щелкните правой кнопкой мыши снова вставить значение (всегда использовать нечетное число, для фильмов, приобретенных на 33 FPS, значение 5 работает хорошо, 1,5 x 1,5 мкм StdDev 1.0) входное значение, нажмите клавишу ENTER и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить (рис. 3B).
5. Начните создавать PTCLs, сначала выбрав период фильм, который включает в себя период покоя (20 – 40 кадров), следуют появление КТК и также 20 – 40 кадров после КТК. Для этого, прокрутите фильм с помощью MMB для прокрутки слева направо на желтой панели.
6. С выбор использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к «STK Ops – рамп DS PTCLinfo» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Эта функция выполняет процедуру анализа PTCL, который постепенно рампы порог от максимальной интенсивности до минимальной интенсивности. Это будет отображаться графически в окне сюжет как участок шума, а также в окне трассировки, как три цветные следы, зеленый след, отображающие количество PTCLs, красный след, показываю средний размер PTCL, и синий след, показаны абсолютной интенсивности порог.
   Примечание: Число и средний размер PTCLs в каждый порог вычисляется автоматически и затем полу ручной порог применяется с помощью интенсивность с которой в котором средний размер PTCLs начинает падать, который происходит в точке перегиба красный след в Окно трассировки (рис. 3D, т.е. Ввиду большого числа пространственно ограниченных шума PTCLs, уменьшение среднего размера PTCLs).
7. В окне печати нажмите клавишу «H» гистограммы баланс сюжет показано PTCL шума. Переключение цветовых схем, нажав ' [' до тех пор, пока фон является цветной белый с цветные следы на вершине.
8. Нажмите «F» воспитывать измерительного инструмента и щелкните левой кнопкой мыши на участке, на пересечении которых цветные участки переход с правой стороны. Это будет означать одну вертикальную линию в полосе прокрутки окна следы ниже.
9. В окне трассировки прокрутите MMB слева направо от точки перегиба красный след заметное Белая вертикальная линия создана в шаге 4.10 и убедившись, что щелкнув правой кнопкой мыши на нем, выбран синий след читал от «yAVG», который будет отображаться в t он ниже левой стороны окна трассировки. Отмените выделение, нажав один раз MMB внутри окна трассировки.
10. В окне фильма, нажмите «C», чтобы воспитывать колесо цвета, затем нажмите 'D ' настроить порог. Допустимое PTCLs будут отображаться как красный в окне фильма (рис. 3 c) и те, которые насыщают будет белым. Снимите белые области прокрутки вверх с левой кнопкой мыши.
11. Прокрутка вверх или вниз с MMB регулировать желтый числовое значение в цветовом круге, настроить это значение к значению yAVG, взяты из шага 4.11. Это будет назначать все в красном как активного Ca^{2 +} переходных PTCL в точке установленного порогового показателя. Сохранить как файл координат на основе частиц, использовать право щелкает доступ ' STK 3D-сохранить PTCLS 0' и затем слева нажмите, чтобы сохранить файл.
12. Закройте Volumetry и вновь открыть. Откройте файл PTCL (.gpf-файл), созданный в шаге 4.13. В этом типе файла все активные Ca^{2 +} переходные процессы сохраняются как равномерное синий PTCL (Рисунок 3E). Поскольку каждый PTCL отдельные сущности с собственным ID, площадь и периметр координаты, государственных флагов (см. ниже) и результат массивы, рационализированы анализ пространственно временных характеристик PTCLs, или между PTCLs.
13. Чтобы начать анализ PTCLs, удалите любые оставшиеся PTCL шума (малые недействительным PTCLs создается файл .gpf создается), используя право кликов в окне фильм для доступа к ' PTCL STKOPS-флаг ptcls > Min = 70' и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это действие будет флаг PTCLs более 6 мкм² (~ диаметр > 2 мкм) и Volumetry будет назначать их «флаг 1' выбор. После завершения этой, PTCLs, которые находятся выше данного порога (флаг 1) будет отображаться как светло фиолетовый цвет в окне фильма, в то время как любой PTCLs ниже порога будет оставаться их базовый синий цвет (Рисунок 3F).
14. Создание представлений тепла карта PTCL активности с помощью правой кликов в окне фильм для доступа к ' PTCL STKops-StatMap флаг ='. Щелкнув правой кнопкой мыши на этот последний путь, назначение флаг для анализа могут быть введены. Таким образом Если желающих количественно PTCLs, присвоенный Флаг1, просто введите '1', нажмите ENTER и затем щелкните левой кнопкой мыши чтобы применить. Это будет генерировать тепло карта, показывающая общий PTCLs для всей длины записи, с различными цветами, представляющие вхождения (%) во время записи (Рисунок 3 g, теплые цвета показывают увеличение вхождения в этом месте).
15. Сохраните тепло карты, щелкнув правой кнопкой мыши на них для доступа к «STM нагрузки Save - сохранить STM как .tif» и затем левой кнопкой мыши, сохранить как TIFF.
16. Количественно PTCL активности с помощью правой кликов в окне фильм для доступа к ' PTCL STK мера-PTCLStats =', щелкнув правой кнопкой мыши на этом заключительном пути, могут быть введены назначение флаг для анализа. Таким образом Если желающих количественно PTCLs, присвоенный Флаг1, просто введите '1', нажмите ENTER и затем щелкните левой кнопкой мыши чтобы применить. Это будет генерировать серию трассировок в окне трассировки.
17. Volumetry по умолчанию будет накладывать PTCL трассировки, созданные в шаге 4.17 поверх друг друга. Разделите их с помощью щелкает правой кнопкой в окне трассировки для доступа к «Выравнивание-отдельные трассировки» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это позволит выявить четыре различных PTCL следы, которые количественно Ca^{2 +} PTCL деятельность в фильме показаны PTCL области (зеленый), PTCL count (красный), PTCL размер (голубой) и PTCL размер стандартного отклонения (синий) заговор против времени (рис. 3 H).
18. Эти следы могут быть сохранены в текстовом файле, который может быть импортирован в программу электронных таблиц для дальнейшего анализа. Чтобы сохранить следы, удерживая нажатой клавишу SHIFT и используйте щелкает правой кнопкой в окне трассировки для доступа к «Ассорти-дамп ROI как текст» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы сохранить файл. Эта информация затем собирается и иллюстрации в гистограммы или другие соответствующие графические материалы (рис. 3 H).
19. Для того, чтобы взглянуть на возникновения PTCLs (т.е., чтобы взглянуть на обжиг сайтов), эти первоначальные PTCLs получают назначение другой флаг. Лучше изолировать, выпустив сайты происходящих в сети, только те PTCLs, не пересекающиеся с любой частицы в предыдущий кадр но и перекрытия с частицами в следующем 70 мс считаются стрельбы сайтов.
20. Чтобы применить этот порог, использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' PTCL поведение-F1 InitSites > F = 3' и слева нажмите, чтобы применить. Это будет назначать инициирования PTCLs как «флаг 3', и PTCLs, которые отвечают этим критериям теперь будет отображаться как известь зеленый цвет в фильме (рис. 4A).
21. Volumetry также предоставляет возможность количественной оценки и участок PTCL стрельбы сайтов в данной ПЗ, а также построения вероятность их стрельбы во время КТК. Чтобы проанализировать эти параметры, создайте тепловую карту возбуждения PTCLs (флаг 3), как описано в шаге 4.16 (рис. 4B).
22. Щелкните левой кнопкой мыши в окне Печать и затем нажмите «C» воспитывать колесо цвета и нажмите 'D ' порога. Карта жары начала PTCLs будет затем повернуть серый и белый. Удалить все белые путем прокрутки вверх с левой кнопкой мыши и порог PTCLs в тепловой карте, так что только действительный PTCLs покрыты серым (настроить порог, прокрутка вверх и вниз с MMB).
23. Использовать право щелкает на тепловой карте в окне печати для доступа к «STM PTCLs-найти PTCLs 70' и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это будет назначать все серые PTCLs на карте, которые больше, чем 70 пикселей² размер выделяемого как отдельным цветом Инициация PTCL или PTCL стрельбы сайта (рис. 4 c).
24. Участок деятельности каждого из этих сайтов огонь против времени, щелкнув правой кнопкой на PTCL стрельбы карта и доступ к «PTCL PTCLs-создание STM rois» и левой кнопкой мыши для применения. Это будет создавать новое изображение в окне фильм с все отдельные цветные PTCL, выпустив сайты отображаются с Руа вокруг них.
25. Использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' PTCL мера-PTCLpixROIBM > = 1' и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это будет определять все ROIs в окне фильма, которые содержат по крайней мере один PTCL и будет участок всю деятельность в рамках этих ROIs в окне трассировки. По умолчанию эти следы будут наложены друг на друга. Чтобы разделить их, используйте щелкает правой кнопкой в окне трассировки для доступа к «Выравнивание-отдельные трассировки» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Чтобы сохранить следы, удерживая нажатой клавишу SHIFT и используйте щелкает правой кнопкой в окне трассировки для доступа к «Ассорти-дамп ROI как текст» и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы сохранить файл.
26. Деятельность каждого обжига сайта также могут быть отображены как возникновение карта. Чтобы сделать это, используйте щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' PTCL мера ROI Pianola = 10' и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это будет генерировать участок всех сайтов огонь против времени в окне печати. Каждый сайт стрельбы будет отображаться как отдельно цветные сущности, каждый в свой «Майна» и эти участки соответствуют Ca^{2 +} PTCLs начала в ЦОК (Рисунок 4 dE) сохранить эти вхождения карты, щелкнув правой кнопкой мыши на них для доступа к ' STM Нагрузки Save - сохранить STM как .tif ' и затем левой кнопкой мыши, сохранить как TIFF.
27. Для количественной оценки вероятности стрельбы на каждом сайте стрельбы во время КТК, использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' PTCL поведение-Марк является = 1' и щелкните левой кнопкой мыши, чтобы применить. Это определит все кадры в фильме, которые содержат PTCLs выше порога, и они будут помечены как Вертикальные синие линии в нижней части окна.
28. ЦОК проявляются как быстрой кластеризации асинхронных стрельбы из нескольких сайтов стрельбы в ПЗ с ~ 1 s пробелов между каждого цикла КТК. Эта регулярность и долго разрыв не активных PTCLs между CTCs используется для дальнейшего определения КТК для анализа.
29. Использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к ' PTCL поведение-блок является разрыв < =' и использовать правый клик на конечной точки ввести число. Эта команда будет Группировать активные кадры PTCL, идентифицированную на шаге 4.28 в блоки и блоки основаны на количество кадров, которые отделяют активных PTCLs. Например, для записи 33 FPS значение 10 работает хорошо. Если активные PTCLS менее чем 10 кадров врозь (330 мс) они сгруппированы в один блок для анализа (блоки затем отображаются в виде розовых прямоугольников над Вертикальные синие линии в нижней части окна фильма с каждым розовый прямоугольник, теперь указанием КТК).
30. Использование щелкает правой кнопкой в окне фильм для доступа к «PTCL мера-PTCL событий Prob». Это создаст текстовый файл, который может быть импортирован в программу электронных таблиц. Этот текстовый файл будет оказывать огромное количество данных о характере инициации сайтов, которые были определены шаги 4.16-4.23 и их вклада в ЦОК.
    Примечание: Текстовый файл будет показывать количество сайтов посвящения (упоминаемые как «домены»), размер сайта в пикселах и мкм², вероятность каждого сайта инициации, выпустив либо один раз или несколько раз во время каждого КТК (задается как %), средняя продолжительность и размер PTCLs, происходящих в начало сайта, количество циклов КТК (как определено в шаг 4.23) и процент стрельбы сайтов, которые выпустили во время каждого цикла КТК. Эта информация собирается и иллюстрации в гистограммы или другие соответствующие графические материалы (Рисунок 4F).

Результаты

С помощью мыши Kit-Cre-GCaMP6F (рис. 1), динамические Ca^{2 +} сигнализации что поведение ICC в желудочно-кишечном тракте может отражаться на месте. С помощью конфокальной микроскопии изображения с высоким разрешением конкретных популяций МУС могут быть приобр...

Обсуждение

CA^{2 +} изображений конкретных типов клеток в пределах нетронутыми тканей или сети клеток часто показывает сложные узоры Ca^{2 +} транзиентов. Эта деятельность требует тщательного и углубленного анализа и количественной оценки, чтобы захватить столько информации об основных событ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ImageJ software	NIH	1.5a	ImageJ software
Volumetry	GWH	Volumetry 8Gd	Custom made analysis software
Isoflurane	Baxter, Deerfield, IL, USA	NDC 10019-360-60
Tamoxifen	Sigma	T5648
GCaMP6F mice	Jackson Laboratory	Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice	Gifted From Dr. Dieter Saur	c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol	Pharmco-Aaper	SDA 2B-6