Антитела-бесплатный анализ для анализа активности РНК метилтрансферазы

Резюме

Здесь описывается анализ антител без пробирки для прямого анализа активности метилтрансферазы на синтетической или в пробирке транскрибированной РНК.

Аннотация

Существует более 100 химически различных модификаций РНК, две трети из которых состоят из метилирования. Интерес к изменениям РНК, и особенно метилирования, вновь появился из-за важной роли, которую играют ферменты, которые пишут и стирают их в биологических процессах, имеющих отношение к болезням и раку. Здесь, чувствительный анализ in vitro для точного анализа деятельности писателя метилирования РНК на синтетических или in vitro транскрибированных РНК предоставляется. В этом ассее используется тритированная форма S-аденосил-метионина, что приводит к прямой маркировке метилированной РНК тритием. Низкая энергия излучения трития делает метод безопасным, а уже существующие методы усиления сигнала трития позволяют количественно и визуализировать метилированную РНК без использования антител, которые обычно подвержены артефактам. Хотя этот метод написан для РНК метилирования, несколько настроек сделать его применимым к изучению других изменений РНК, которые могут быть радиоактивно помечены, такие как РНК ацетилирование с ¹⁴C ацетил кофермент A. В целом, этот вывод позволяет быстро оценить РНК метилирование условия, ингибирование с небольшими ингибиторами молекулы, или эффект РНК или фермента мутантов, и обеспечивает мощный инструмент для проверки и расширения результатов, полученных в клетках.

Введение

ДНК, РНК и белки подвержены изменениям, которыежестко регулируют экспрессию генов 1. Среди этих модификаций метилирование происходит на всех трех биополимерах. Метилирование ДНК и белка было очень хорошо изучено в течение последних трех десятилетий. В отличие от этого, интерес к метилированию РНК был только недавно возродился в свете важной роли, что белки, которые пишут, стирают или связывают РНК метилациляции играют в развитии и болезни². В дополнение к более известным функциям в обильных рибосомных и передачи РНК, РНК метилирования пути регулируют конкретные посыльного РНК стабильности^3,4, сращивание⁵ и перевод^6,7, miRNA обработки^8,9 и транскрипционной паузы и выпуска^10,11.

Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в условиях лаборатории молекулярной биологии (обобщено на рисунке 1). Многие исследования оценивают активность РНК метилтрансферазы через точечную подрамность с антителом против изменения интереса РНК. Однако, точка-блот не проверяет целостность РНК при инкубации с метилтрансферазой РНК. Это важно, потому что даже незначительные загрязнения рекомбинантных белков с нуклеазой может привести к частичной деградации РНК и смешанные результаты. Более того, даже высокоспецифические антитела к модификации РНК могут распознавать неизмененные РНК с определенными последовательностями или структурами. In vitro RNA метилтрансферазы анализ сообщил здесь использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть трилциатна на метиловой группы донора (Рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обнаружены без использования антител . Инструкции предусмотрены для экстракорпорной транскрипции и очистки стенограммы интереса и тестирования метилирования указанной транскрипта ферментом интереса. Этот метод является гибким и надежным и может быть скорректирован в соответствии с потребностями того или иного проекта. Например, в пробирке транскрибируются и очищены РНК, химически синтезированные РНК, но и клеточные РНК могут быть использованы. Этот ассси обеспечивает количественную информацию в виде сцинтилляции, а также качественную информацию, показывая, где именно метилированная РНК работает на геле. Это может обеспечить уникальное понимание функции РНК метилтрансферазы, особенно при использовании клеточных РНК в качестве субстрата, так как он обеспечивает метод непосредственного наблюдения размер РНК или РНК, которые предназначены для метилирования.

протокол

1. Транскрипция в пробирке и гель очищение целевой РНК

1. Клон последовательность интереса в плазмиды, содержащие T7 и / или SP6 промоутеров с использованием установленных молекулярных методов клонирования¹² или комплекты.
2. Линейная версия шаблона ДНК для транскрипции in vitro
   1. Увеличьте последовательность интереса pcR плазмида с грунтовки предназначены для включения T7 промоутер региона через вставку, 20-30 bp вверх по течению и вниз по течению, как ранее описано¹³.
   2. Кроме того, дайджест 5 мкг плазмиды с помощью фермента ограничения (RE) сократить сайт доступны вниз по течению вставки в соответствии с инструкциями, предоставляемыми поставщиком RE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте перепроверить, что вставка не вырезана выбранным RE. Выбор RE, используемый в этом шаге, может существенно повлиять на доходность стенограммы. Преференциально, линейно с тупым или 5'-нависающие конца производства RE, чтобы избежать переключения шаблона T7 РНК полимераза на противоположной нити ДНК¹⁴. Попробуйте различные RE, если первоначальные урожаи недостаточны.
3. Очистите полученную ДНК с помощью комплекта для экстракции и очистки геля агарозы. Выясните ДНК с 30 л воды.
4. Хорошо перемешайте путем вихря, пайпета 1,5 л и измерить концентрацию ДНК с помощью микротомного спектрофотометра.
5. Используйте 250 нг ДНК, чтобы проверить качество и размер очищенной ДНК на 1% агарозного геля электрофореза в 1x буфере TBE мигрировали в течение 1 ч при 4 V/cm.
6. Оттепель замороженных реагентов комплекта транскрипции in vitro. Поместите T7 РНК Полимераза Mix на льду, а другие реагенты на nutator при комнатной температуре. Сразу же после полного оттаивания, быстро спина rNTP труб в течение 5 с, чтобы собрать раствор на дне труб и место на льду. Держите 10x Реакции буфера при комнатной температуре, чтобы избежать осадков.
7. Труба в трубку 1,5 мл следующие компоненты реакции транскрипции 20 л при комнатной температуре в указанном порядке: 6 л воды, 2 л (0,1 - 1 мкг) линейного шаблона ДНК, 2 л раствора АТФ, 2 л раствора GTP 75 мМ , 2 л из 75 мм CTP раствора, 2 л из 75 мМ UTP раствор, 2 зл и 10x реакции буфера и 2 Зл T7 РНКА-микс.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для шаблона ДНК, генерируемого ПЦР, используйте 100 - 200 нг ДНК; для шаблона ДНК, генерируемого ферментным дайджестом ограничения плазмиды,используйте 1 мкг. Активный рекомбинантный Его 6-тегами T7 РНК Полимераза может быть очищена в E. coli¹⁵.
8. Тщательно перемешайте трубку. Быстрый спин в течение 5 с, чтобы собрать раствор реакции в нижней части трубки, а затем инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 2-4 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая стенограмма будет вести себя по-разному в зависимости от шаблона ДНК, его длины, последовательности или структуры. Оптимизируйте условия транскрипции in vitro путем тестирования различных периодов инкубации до 6 ч; различные концентрации шаблона ДНК, T7 РНК Полимераза, или NTP; или добавление дополнительного MgCl₂ к тому, что присутствует в T7 РНК Полимераза Mix.
9. В конце инкубационного периода добавьте 1 qL DNase I на реакцию 20 л и инкубируют при 37 градусах По цельсии в течение 15 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция транскрипции может быть временно сохранена на льду до тех пор, пока полиакриламид гель не будет готов.
10. Продолжить очистку полиакриламидным гелем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку РНК чувствительна к рН и загрязнению RNase, используйте СПЕЦИАЛЬНОе оборудование РНК и реагенты без RNase.
11. Определить процент полиакриламид для геля в зависимости от размера стенограммы процентов: 3,5% за 100-2000 nt (XC: 460 nt; BB: 100 nt), 5% за 80-500 nt (XC: 260 nt; BB: 65 nt), 8% за 60-400 nt (XC: 160 nt; BB: 45 nt), 12% за 40-200 nt (XC: 70 nt; BB: 20 nt), 15% за 25-150 nt (XC: 60 nt; BB: 15 nt), и 20% для 6-100 nt (XC: 45 nt; BB: 12 nt).
12. Подготовка мочевины denaturing полиакриламид гель путем объединения следующих реагентов в 50 мл конической трубки: 9,6 г молекулярного класса мочевины, 2 мл 10x TBE, х мл 40% акриламид:bis-acrylamide смесь (29:1) и воды до 20 мл знака на трубе , где х 20 мл/(40%/процент геля %).
    ВНИМАНИЕ: Полякриламид гели часто содержат ООН-полимеризованный акриламид, который является токсичным материалом, который может производить опасность при введении в окружающую среду. Утилизация гелей полиакриламидов в рамках программы по химическим отходам учреждения.
13. Микроволновая печь для 15 с при 30% мощности. Поставить на nutator в течение 10 минут при комнатной температуре или до полного растворения мочевины.
14. В то время как гель смесь вращается, получить гель кассеты (18-ну, 1 мм толщиной; 13,3 х 8,7 см (W х L)), удалить гребень и положение кассеты для гель литья.
15. Быстрый спин 50 мл трубки для 5 с, чтобы собрать гель раствор в нижней части трубки. Добавьте 125 л 10% раствора персульфата аммония (APS). Место на nutator в течение 1 мин. Быстрый спин снова в течение 5 с.
16. Добавьте 25 л тетраметилэтиленэдиамиамин (TEMED) и тщательно перемешайте, прокладывая вверх и вниз 5 раз с помощью 25 мл пипетки, избегающей пузырьков.
17. Пипетка в гель литые и тщательно вставить гель гребень избегая пузырьков.
18. Затяните печать, добавив большой зажим связующего поверх кассеты.
19. Разрешить гель полимеризации в течение 1 ч.
20. После того, как гель затвердел, удалите связующего клипа. Вставьте кассету в коробку электрофореза. Добавьте буфер 1x TBE в верхние и нижние резервуары.
21. Извлекаем реакцию транскрипции. Добавьте воду до 100 л, затем добавьте 100 зл 2x Гель Загрузка буфера. Подготовьте лестницу, смешивая рекомендуемое количество с водой до 10 л и 10 л 2x gel Загрузка буфера в отдельной трубке 1,5 мл.
22. Инкубировать как лестницу и в пробирке транскрипции реакции в термомиксер на 70 градусов по Цельсию в течение 15 минут.
23. В то время как образцы денатурируются при 70 градусах Цельсия, тщательно удалите гребень, очистите колодцы, прокладывая вверх и вниз каждый колодец с пипеткой P1000, и сразу же предварительно запустить в течение 10 мин при 100 В.
24. После того, как образцы завершили их 15 мин денатурации при 70 градусов по Цельсию, удалить трубки из термомиксера и сразу же поместите на лед.
25. Очистите каждый колодец геля снова с пипеткой P1000. Загрузите 20 зл лестницы на первой скважине влево, 20 зл и л образца РНК на 10 отдельных скважинах и 20 Зл 1x гель-загрузочный буфер на неиспользованные скважины.
26. Выполнить гель при 100 В в течение 60 -240 мин, в зависимости от % полиакриламид геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: красители в гель Загрузка Буфер будет отделяться на две полосы, как они пересекают гель, медленно мигрирующих Bromophenol Blue (BB) синяя полоса, и быстро мигрирующих Xylene Cyanol (XC) голубой группы. Приблизительная миграция этих полос в различных полякриламидных гелях хорошо известна (см. шаг 1.11) и может быть использована для оценки миграции РНК в геле.
27. После того, как гель был остановлен, тщательно удалить гель из кассеты.
28. Поместите гель в чистую коробку, содержащую раствор 50 мл 1x буфера TBE с 50 злящееся нуклеиновой кислоты геля и инкубировать в течение 5 минут на рокер, чтобы испачкать РНК.
29. Возьмите до и после группы иссечения изображение геля на гель изображений системы, предпочтительно с помощью синего света вместо УФ-трансиллюмина.
30. Акциз каждой группы интересов с помощью nuclease-бесплатно одноразовый гель резки отзыв. После каждого хорошо, передача наконечник, содержащий гель ломтик 1,5 мл трубки и кратко спина, чтобы собрать ломтик геля. Повторяйте до тех пор, пока все полосы не будут собраны в ту же трубку 1,5 мл.
31. После того, как все ломтики геля были собраны, добавьте 100 л безнулевой воды или TE буфера в трубку 1,5 мл. Хранить при 4-C для 48 ч. Это позволяет РНК выйти из геля ломтики в раствор.
32. После 48 ч, pipet воды или TE буфера для свежей трубки 1,5 мл. Удалите оставшиеся ломтики геля. Очистите РНК с помощью комплекта очистки следующим образом.
    1. Равновесие спиновой колонки при комнатной температуре не менее 30 мин.
    2. К 100 л раствора РНК в новой трубке 1,5 мл со ступени 1,32, добавьте 350 л буфера RLT и хорошо перемешайте в течение 2 мин на nutator. Спин для 1 с при 200 х г, чтобы собрать раствор в нижней части трубки.
    3. Добавьте 675 кл. 100% EtOH и хорошо перемешайте в течение 2 мин на nutator. Спин для 1 с при 200 х г и сразу же перейти к следующему шагу.
    4. Передача 565 л смеси на спин-колонку и вращаться в течение 1 мин при 15000 х г. Опустошить трубку коллекции по аспирации.
    5. Повторите предыдущий шаг со второй половиной выборки.
    6. Добавьте 500 кЛ буфера RPE к столбце и закрутите в течение 1 мин при 15 000 х г. Опустошить трубку коллекции по аспирации.
    7. Добавьте 750 л 80% этанола в колонку и закрутите в течение 1 мин при 15 000 х г. Опустошить трубку коллекции по аспирации.
    8. Поместите колонку в новую трубку коллекции 2 мл с открытой крышкой и вращаться при 15 000 х г в течение 5 минут.
    9. Перенесите колонну на новую трубку 1,5 мл.
    10. Добавьте 17 кл воды в центре колонны и вращайтесь при 15 000 х г в течение 1 мин. Elute снова с помощью еще 17 л воды. Общий объем извлеченных должен составят 32 л.
33. Хорошо перемешайте путем вихря, пайпета 1,5 зл и измерить концентрацию РНК с помощью микротома спектрофотометра.
34. Проверьте качество очистки РНК с помощью геля полиакриламидного полиакриламида, так как в шагах 1.11-1.29.

2. In vitro РНК метилтрансферазы анализ

1. Настройка 100 Л РНК метилтрансферазы асссе в 1,5 мл трубки на льду следующим образом: 23 л воды, 10 мЛ 10x TBS (500 мм Tris-HCl, pH 7.5; 1.5 M NaCl), 2 л 0,05 М EDTA, 5 мЛ 100 мМ DT , 40 зл 50% глицерола, 4 Зл из 58 ММ ³H-SAM, 5 Зл 20x Протеазы Ингибитор Коктейль, 1 Зл RNaseOUT (по желанию), 5 Л РНК и 5 Л метилтрансферазы.
   ВНИМАНИЕ: Радиоактивные трииатированные материалы опасны и должны обрабатываться только во время ношения перчаток, лабораторного пальто и любого другого необходимого СИЗ. Все наконечники пипетки и трубки, контактные с радиоактивным материалом, считаются твердыми радиоактивными отходами. Утилизировать все твердые и жидкие радиоактивные отходы в соответствии с утвержденным лабораторией протоколом радиоактивных отходов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Включите контрольные образцы без метилтрансферазы и без РНК. Концентрации реагентов могут потребовать оптимизации и/или включения растворимых солей катионов, таких как MgCl_2, или немаркированных SAM. Оптимальный диапазон конечной концентрации РНК составляет от 50 нм до 1 ММ, в то время как концентрация метилтрансферазы составляет от 25 нм до 300 нм.
2. Тщательно перемешайте, аккуратно завихряя трубку. Спин 5 с на 200 х г, чтобы собрать раствор в нижней части трубки. Инкубировать трубку (ы) при 37 градусах по Цельсию на 2 ч.
3. Очистка реакции с помощью очистки столбца, как в шаге 1.32.
   ВНИМАНИЕ: Будьте очень осторожны, чтобы правильно утилизировать любые радиоактивные материалы, особенно во время колонны моет (пипетка из вместо аспирации отходов из коллекторских труб).
4. Выполните количество жидких мерцаний
   1. Настроили стойку сцинтилляции с одним флаконом на образец, один флакон для измерения фона и один флакон для теста салфетки. Заполните флаконы 5 мл раствора сцинтилляции.
   2. Добавьте 10 кл/л каждого электорарадиового образца РНК в 1 флакон, затяните крышку и аккуратно перемешайте.
   3. Подготовьте флаконы теста салфетки. Тщательно руб ватные тампоны на всех поверхностях и оборудования, используемых во время протокола. Добавьте тампоны в флаконы, наполненные 5 мл раствора сцинтилляции, и затяните крышку.
   4. Запустите образцы на счетчике сцинтилляции следующим образом. Откройте капот, вставьте стойку в машину и закройте капот. Выберите граф ат-тач. Выберите пользовательскую программу. Выберите или создайте программу, которая измеряет тритий (³H) для 60 s. Hit Count Rack. Повторите сцинтилляцию рассчитывать три раза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оборудование будет измерять количество сцинтилляции каждого образца и выход как на экране, так и на распечатку. Протокол можно приложить здесь при желании. Оставшиеся образцы РНК со ступени 2.3 должны быть заморожены при -80 градусов по Цельсию для последующего использования.
5. Продолжить с авторадиограммы
   1. Подготовка и предварительно запустить мочевины денатурируя полиакриламид гель, как в шагах 1.11-1.20.
   2. Пипетка 20 л радиоактивного РНК-материала в новую трубку 1,5 мл, содержащую 20 л 2x гель-загрузочный буфер. Хорошо перемешать. Подготовьте лестницу как в шаге 1.21. Инкубировать образцы при 70 градусах по Цельсию в течение 15 мин.
   3. Вымойте скважины геля еще раз непосредственно перед загрузкой образца. Нагрузка 20 зл и лестницы, 20 зл и 20 зл 1x Гель Загрузка буфера на оставшихся полосах. Выполнить гель при 100 В в течение 60-180 мин, в зависимости от процента полиакриламид.
   4. Как только гель заканчивает работу, удалите гель из кассеты и поместите его в коробку, содержащую 50 мл 1x буфера TBE с 5 Зл ультрачувствительных нуклеиновой кислоты гель пятно.
   5. Инкубировать в течение 5 минут на рокер, чтобы испачкать РНК.
   6. Аккуратно возьмите гель из коробки и поместите его на УФ-трансиллюнтор системы гель изображений с колодцами вверх и лестницей слева.
   7. Сосредоточьте камеру на гель, включите ультрафиолетовый свет, а затем принять изображение геля, подвергая от 50 мс до 1 с в зависимости от интенсивности сигнала.
   8. Выключите УФ-экспозицию и сохраните изображение в виде файла Tiff.
   9. Поместите гель обратно в коробку. Удалить TBE. Закрепите гель с 50 мл крепячего раствора (50% метанола, 10% уксусной кислоты, 40% ультра-чистой воды) в течение 30 минут при комнатной температуре на рокере.
   10. Аккуратно переместите гель снова в свежий черный ящик, содержащий 25 мл саморапривающего раствора. При отсутствии черного ящика накройте коробку алюминиевой фольгой, чтобы защитить раствор от света.
   11. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре на рокере.
   12. Аккуратно поднимите гель и поместите его лицом вниз на лист полиэтиленовой пленки с колодцами вверх и лестницей на правой стороне. Поместите два листа хроматографической бумаги на заднюю часть геля. Аккуратно переверните весь стек.
   13. Предварительно разогреть гель сушилку до 80 градусов по Цельсию. Отодвите пластиковую крышку на сушилке для геля. Вставьте пленку, гель и хроматографию бумаги стек под пластиковой крышкой и переместить пластиковую крышку обратно вниз, чтобы создать печать.
   14. Высушите 1 ч при 80 градусах По Цельсия в сушилке для геля.
   15. Выключите гель сушилку и аккуратно снимите стек. Удалите пленку и вторую хроматографической бумагу. Лента оставшихся хроматографии бумаги с высушенным гелем в авторадиограмме кассеты.
   16. Добавьте 1 лист ауторадиграфической пленки в темной комнате.
   17. Поместите кассету при -80 градусов по Цельсию и разработайте пленку через 1 ч до 4 недель в зависимости от интенсивности сигнала, о чем можно судить по ранее измеренным подсчетам мерцания: 1-4 недели для 250-1000 cpm, 24 ч до 1 недели для 1000-10000 cpm и 1 h до 24 h для М.
   18. После того, как фильм разработан, поместите пленку на верхней части кассеты и тщательно отметьте лабораторным маркером 4 края геля, каждый хорошо, и положение красителей XC и BB.
   19. Сканирование пленки на 300 или 600 пикселей на дюйм разрешение и сохранить изображение как файл Tiff.

Результаты

Реакция транскрипции в пробирке
Рисунок 2 A представляет собой типичный пробег от реакции транскрипции in vitro с полимеразой РНК T7 7SK snRNA, которая является относительно короткой (331 nt) и высоко структурированной РНК. Как показано на этом исходном изображе...

Обсуждение

Здесь сообщается о простом и надежном методе проверки РНК-метилтрансферазы в отношении конкретных транскриптов. Ассаи использует тот факт, что S-аденосил метионин может быть тритиациарет на метилгруппы донора(рисунок 1), что позволяет метилированной РНК быть точно обна...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 bp DNA Ladder	Invitrogen	10821-015	10 bp DNA Ladder kit.
10% Ammonium Persulfate (APS)	N/A	N/A	For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter).
10X TBE Buffer	N/A	N/A	For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter).
10X TBS	N/A	N/A	For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter.
Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher	BP1408-1	For urea denaturing polyacrylamide gel.
ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])	Perkin Elmer	NET155V250UC	For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM.   Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.
Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes	GE Healthcare	RPN11649	For autoradiogram gel exposure.
Amersham Hyperfilm MP	GE Healthcare	28906846	For autoradiogram gel exposure.
Beckman Scintillation Counter	Beckman	LS6500	For liquid scintillation count.
Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System	Biorad	1704466	Mini Horizontal Electrophoresis System.
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Applied Science	4693159001	For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.
Criterion Cell	Biorad	345-9902	RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.
Criterion empty Cassettes	Biorad	1656001	Vertical midi-format electrophoresis cell.
DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer	DeNovix	DS-11-S	Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.
Ecoscint Original	National Diagnostics	LS-271	For liquid scintillation count.
Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials	Fisher	03-337-1	For liquid scintillation count.
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer	RPI CORP	112600	For autoradiogram gel pretreatment.
Gel dryer	Biorad	1651745	For drying gel.
Gel Loading Buffer II	Ambion	AM8547	For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).
GeneCatcher disposable gel excision tips	Gel Company	NC9431993	For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.
Megascript Kit	Ambion	AM1333	For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.
Perfectwestern Extralarge Container	Genhunter Corporation	NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)	Gel staining box.
pRZ	Addgene	#27663	Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup	Qiagen	74204	For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.
Saran Premium Plastic Wrap	Saran Wrap	Amazon	For drying gel.
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	Ultra sensitive nucleic acid gel stain.
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Nucleic acid gel stain.
TE	Sigma	93283-100ML	10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0
TEMED	Fisher	110-18-9	For urea denaturing polyacrylamide gel.
Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES	eppendorf	5382000023/5361000038	For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.
TOPO TA Cloning Kit	life technologies		Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.
TURBO DNase (2 U⁄µL)	Ambion	AM2238	For DNA removal from in vitro transcription reactions.
Urea	Sigma	51456-500G	For urea denaturing polyacrylamide gel.
Whatman 3MM paper	GE Healthcare	3030-154	Chromatography paper for drying gel.