JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для обогащения эндогенных связывающих участков РНК или "следов" комплексов РНК:белка (РНП) из клеток млекопитающих. Этот подход включает в себя два иммунопреципиции субъединиц РНП и поэтому называют РНК иммунопрецитацией в тандеме (RIPiT).

Аннотация

Рнкова иммунопрецит в тандеме (RIPiT) является методом для обогащения РНК следы пары белков в комплексе РНК:белок (RNP). RIPiT использует два этапа очистки. Во-первых, иммунопрециция помеченного субединицы RNP сопровождается мягким пищеварением RNase и последующим неденативным сродством elution. Второе иммунопрецициционное опора другого подразделения РНП позволяет обогащать определенный комплекс. После денатурации elution РНК и белков, РНК следы преобразуются в высокой пропускной способности ДНК секвенирования библиотек. В отличие от более популярных ультрафиолетовых (УФ) перекрестных ссылок с последующим иммунопрецистирующим (CLIP) подходом к обогащению связывающих мест RBP, RIPiT является независимым от УЛЬТРА-кроссулинки. Следовательно RIPiT можно приложить к многочисленнLp протеинам присытствыющим в interactome RNA и за пределами которые необходимы к регулировке RNA но сразу не контактируют RNA или UV-crosslink плох к RNA. Два шага очистки в RIPiT обеспечивают дополнительное преимущество определения связывающих участков, где белок, представляющий интерес действует в партнерстве с другим кофактором. Стратегия двойной очистки также служит для повышения сигнала путем ограничения фона. Здесь мы предоставляем пошаговую процедуру для выполнения RIPiT и создания библиотек с высокой пропускной способностью из изолированных следов РНК. Мы также излагаем преимущества и приложения RIPiT и обсуждаем некоторые из его ограничений.

Введение

Внутри клеток РНК существует в комплексе с белками для формирования РНК:белковых комплексов (РНК). RNPs собраны вокруг белков связывания РНК (RBPs, те, которые непосредственно связывают РНК), но также состоят из не-RBPs (те, которые связывают RBPs, но не РНК), и часто динамические по своему характеру. РРП и их кофакторы коллективно функционируют в рамках РСП для выполнения регулятивных функций. Например, в пути распада мРНК (NMD) upF белки UPF (UPF1, UPF2 и UPF3b) распознают преждевременно прекращенную рибосому. Каждый из белков UPF может связываться с РНК, но только тогда, когда они собираются вместе, что активный комплекс NMD начинает формироваться. В рамках этого комплекса, UPF1 дополнительно активируется фосфорилированием не-RBP SMG1, и такая активация UPF1 в конечном итоге приводит к набору мРНК распада индуцирующих факторов1,2. В этом примере РБП требуют кофакторов, не относясь от RBP, для набора и активации комплекса RNP, который запускает НМД. Еще одним свойством РНП является их композиционная неоднородность. Рассмотрим сплайсесом, который существует в различных комплексах E, A, B или C. Различные сплайсцеосомные комплексыимеют перекрывающиеся и различные белки 3. Для изучения функций RNP важно выяснить, какие РНК связаны RBP и связанными с ним белками. Многие методы существуют для достижения этой цели, скаждым подходом, имеющим свои отличительные преимущества и недостатки 4,5,6,7.

Широко популярные методы для определения RBP связывающих сайтов - перекрестные с последующими иммунопрецицией (CLIP) и его различные вариации - полагаться на ультрафиолетовый (УФ) свет для перекрестного RBP к РНК8. Тем не менее, это не является эффективным подходом для не-RBPs в рамках RNPs, которые не связываются с РНК напрямую. Здесь мы описываем альтернативный подход, применимый как к RBP, так и к не-RBPs, чтобы изолировать и идентифицировать их сайты связывания РНК. Этот подход называется РНК иммунопрецитификации в тандеме (RIPiT) состоит из двух иммунопреципции шаги, которые помогают достичь более высокой специфичности по сравнению с одной очистки (Рисунок 1)9,10. Поскольку индивидуальные иммунопретенции (Ip) шаги могут быть выполнены на более низкой строгости по сравнению с CLIP, RIPiT не зависит от наличия антител, которые могут выдержать наличие сильных моющих средств во время иммунопреципиции. Самым уникальным преимуществом RIPiT является способность нацеливают два разных белка на два этапа очистки; это обеспечивает мощный способ обогатить композиционно различные RNP комплекса из других подобных комплексов11.

Небольшие изменения в процедуре RIPiT могут способствовать дальнейшему обогащению РНП. Например, некоторые взаимодействия РНК-белка или белка в РНП являются временными, и может быть трудно эффективно очищать следы таких комплексов. Для стабилизации таких взаимодействий, RNPs могут быть перекрестными внутри клеток с формальдегидом до лизиса клетки и RIPiT. Например, мы заметили, что слабое взаимодействие между основным фактором экзон-соединения (EJC) (EJC) и фактором разборки EJC, PYM12 может быть стабилизировано с помощью обработки формальдегида таким образом, что больше следов РНК обогащается (данные не показано). До сбора клеток и RIPiT, клетки также могут быть обработаны препаратами для стабилизации или обогащения RNPs в определенном состоянии. Например, при изучении белков, которые удаляются из мРНК во время перевода (например, EJC13,UPF114),лечение ингибиторами перевода, такими как пуромицин, циклогексимид или харрингтонин, может привести к увеличению заполняемости белки на РНК.

Количество РНК, извлеченных из RIPiT, как правило, является низким (0,5-10 pmoles, т.е. 10-250 нг РНК с учетом средней длины РНК 75 nt). Основная причина этого заключается в том, что лишь малая часть данного белка присутствует в комплексе с другими белками в РНП (любой "свободный" белок IP'ed на первом этапе теряется во время второго IP). Для создания библиотек RNA-Seq из этой РНК, мы также наметить здесь адаптацию ранее опубликованного протокола подходит для таких низких входов РНК15,16 (Рисунок2), который дает высокой пропускной способности секвенирования готовых образцов в 3 Дней.

протокол

1. Создание стабильных HEK293 сотовых линий, выражающих тетрациклин-индуцируемое FLAG-тегами Белок интерес (POI)

  1. Семена HEK293 клетки со стабилизированной flp рекомбинации цели (FRT) сайт с плотностью 10 х 10 104 клетки / мл в среде роста (Dulbecco в модифицированных Eagle в среднем "DMEM" - 10% плода сыворотки крупного рогатого скота (FBS) 1% пенициллин-стрептомицин хорошо пластин. Разрешить клеткам расти в течение ночи в увлажненный инкубатор при 37 градусах По цельсии и 5% CO2 (стандартные условия роста для всех последующих шагов).
  2. На следующий день, клетки должны быть 70% сливочные. Согласно протоколу ретера трансфекции, трансфектировать сайт FRT- содержащий HEK293 клетки с 9:1 соотношение pcDNA5-TETO-FLAG-POI:pOG44.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тег FLAG имеет мотив последовательности DYKDDDDK (D - аспарновая кислота, Y й тирозин, и K и лизин).
  3. После 24 ч начните отбор антибиотиков. Удалить средства массовой информации и добавить свежий рост среды дополняется 100 мкг /мЛ гигромицин. В пределах 72 ч нетрансинфицированные клетки должны начать умирать.
  4. Каждые 48-72 ч, изменить рост средств массовой информации и дополнить свежим гигромицином.
  5. После 2 недель отбора начнут появляться отдельные колонии застопозных трансинфицированных клеток. После того, как колонии видны невооруженным глазом, добавьте 1 мл трипсина в тарелку и инкубировать в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия. Resuspend клетки в DMEM, передача клеток в новую пластину 10 см, и настроить объем до 10 мл свежей среды роста дополняется 100 мкг /мл гигромицин. Разрешить пластины, чтобы достичь 80% вдруг для дальнейшего расширения клеток для подготовки постоянных запасов.
  6. Определите количество тетрациклина (Тет), необходимого для получения оптимального уровня экспрессии FLAG-POI для эксперимента. Выращивайте клетки в 12-хорошем формате и проводите титрование Tet между диапазоном 0-1000 нг/мл для 16-24 ч. Выполните западные помарки на образцах титрования с антителами против POI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для белков до 60 кДа, FLAG-тегами и эндогенной копией белка могут быть решены на натрия dodecyl sulphate-polyacrylamide гель электрофоресис (SDS-PAGE) для сравнения уровня экспрессии FLAG-POI с его эндогенным аналогом. Для более крупных белков интенсивность сигнала в образцах, индуцированных Тет, может быть сравнена с неиндуцированной пробой. Тетрациклин бульонный раствор может быть подготовлен при 1 мг/мл в 100% этанола. Разбавления запасов для работы клеточной культуры должны быть в стерильной воде или фосфат-буферизированном сольном (PBS). Тетрациклин бульон должен быть подготовлен свежий один раз в месяц.

2. Культивирование клеток для индукции тетрациклина и процедуры RIPiT

  1. Семена прочно интегрировали FLAG-POI HEK293 при плотности 3 х 105 ячеек/мл в среде роста в 15 см пластин. Разрешить клеткам расти при 37градусах По кв. м и 5% CO 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, от трех до пяти 15 см пластин будет давать 2-20 pmol следов РНК в зависимости от обилия RNP интереса. Если РНП будут перекрестными и очищенными в строгих условиях, то может потребоваться вдвайску ввода.
  2. Добавьте тетрациклин к заранее определенной оптимальной концентрации к средствам массовой информации, чтобы вызвать экспрессию FLAG-POI (см. шаг 1.6) 16-24 ч, прежде чем клетки будут собраны.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не нужно менять среднюю динамику роста. Клетки должны быть готовы к сбору около 72 ч после посева или когда пластины 80% сливов. Важно, чтобы клетки не стали стыковочные.

3. Сбор клеток, лечение формальдегида и лизия клеток

  1. Вымойте монослойные клетки осторожно с 15 мл охлажденной PBS для каждой 15 см пластины. Затем соскребите клетки в 30 мл PBS. Если клетки лечились препаратами до сбора урожая, дополнить PBS препаратом. Соберите все клетки в коническую трубку 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для сохранения слабых взаимодействий клетки могут быть перекрестными формальдегидами: добавить формальдегид к клеточной подвеске от ступени 3,1 до конечной концентрации 0,1% и инкубировать на рокерпри при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавить 3 мл закалки буфера (Таблица 1 ) и рок в течение 5 дополнительных минут.
  2. Клетки пеллет на 400 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия и отбрасывают супернатант.
  3. Лисические клетки в 4 мл ледяного гипотонического буфера (HLB; Таблица 1). Используйте пипетку P1000 для повторного использования ячеек. Перенесите в трубку 5 мл и инкубируют лисат на льду в течение 10 мин.
  4. Поместите лизат в ледяную ванну и сномите на 10% амплитуда на 30 с 1 с импульсами с 2 паузами. Затем отрегулируйте концентрацию соли до 150 мМ, добавив 108 л из 5 М NaCl.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид кросс-связанные образцы могут быть подвержены более строгий лизис и очистки, в том числе 0,1% каждый из SDS и дезоксихолат натрия в буфере лизиса.
  5. Очистить лизат центробежищем при 21 000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Соберите 20 супернатантов (клеточного экстракта) в помеченной трубке для западного анализа помарки уровней белка при входе (см. рисунок 3А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как лисат находится в центрифуге, бусы агарозы FLAG можно мыть (см. шаг 4.1). FLAG агарозные бусы должны быть предварительно промыты 3x в 4 мл ледяной изотонический буфер стирки (IsoWB, Таблица 1).

4. FLAG Иммунопрецист

  1. Нанесите оставшийся супернатант со ступени 3,5 до 750 л предварительно промытых бусинОК FLAG agarose в трубке 5 мл (объем кровати промытых бусинОК FLAG agarose составит 375 л). Инкубировать FLAG агарозные бусы и клеточный экстракт для 1-3 ч при 4 градусах Цельсия с нежным смешиванием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объем бусинок FLAG agarose должен быть достаточным для широкого спектра белков, но при необходимости может быть оптимизирован.
  2. ПеллетЫ FLAG агарозные бусы центрифугированием при 400 х г в течение 1 мин при 4 градусах Цельсия. Соберите 20 зл супернатантов в помеченной трубке для анализа западного помарки белкового уровня в экстракте истощенных клеток (см. Рисунок 3А). Откажитесь от оставшегося супернатанта.
  3. Для мытья бусинОК FLAG агарозы добавьте 4 мл IsoWB и приостановите. Пеллетбийные бусы при 400 х г в течение 1 мин при 4 градусах По с. Тщательно удалите супернатант. Повторите 4x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для строгих стирок формальдегида, перекрестных ИП, 0,1% каждого из SDS и дезоксихолатов натрия могут быть включены в буфер стирки для первых двух шагов мытья.

5. RNase I Пищеварение

  1. Разбавить RNase I до 0,002-0,01 единиц/мл в 750 Л IsoWB (соответствующая концентрация для желаемых размеров следа должна быть эмпирически определена). Добавить IsoWB-RNase i промыть БУсы FLAG агарозы и инкубировать с нежным смешивания при 4 кв кв в течение 10 минут.
  2. Пеллетбийные бусы при 400 х г в течение 1 мин при 4 градусах По с. Соберите 20 супернатантов (RNase I elution) в помеченной трубке для анализа западной помарки. Отбросьте IsoWB-RNase I и вымойте БУсы FLAG agarose 4x с IsoWB, как описано в шаге 4.3.

6. Сроднити Elution

  1. Подготовьте запас элуционного буфера (пептид FLAG при 250 нг/мл в IsoWB). Применить 375 зл и лист элютации буфера FLAG агарозы бусы и встряхнуть осторожно на 4 кв к в течение 1-2 ч. Пелле FLAG агарозные бусы и собрать 15 зл. аликут из elution для западного пятно белков в FLAG IP (см. Рисунок 3A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда сродство elution продолжается, раздел 7 может быть выполнен.

7. Магнитная бисо-антитела спряжения

  1. Вымыть 50 магнитных бусин (т.е. динабии; Таблица материалов) 3x в 1 мл IsoWB в 1,5 мл трубки. Пристойная магнитная бусы в 100 л буфера спряжения. Добавить соответствующее количество антител (точное количество антител для использования для ИС должны быть эмпирически определены для каждого антитела).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Белок Магнитные бусы являются оптимальными для антител, вырабатываемых в кролика в то время как белок G магнитные бусы являются более подходящими для антител мыши. Диаграмма совместимости магнитных бусин доступна на веб-сайте поставщика, чтобы выбрать шарики, подходящие для каждого антитела.
  2. Вымойте магнитные бусы 2x в буфере спряжения(Таблица 1). Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение не менее 10 мин. Отдохните магнитные бусы в 375 л буфера разбавления RIPiT. Хранить на льду до следующего шага.

8. Второе иммунопрецистное

  1. Применить оставшиеся FLAG сродство elution от шага 6.1 к магнитным бусинам соединенных к антителам против протеина интереса. Инкубировать с нежным смешиванием при 4 градусах по Цельсию на 1-2 ч. Захват магнитных бусин ок на магнит и собрать 15 зл супернатанов для анализа несвязанных белков через западную подувку. Вымойте магнитные бусы 7x с 1 мл IsoWB.

9. Отрицание Elution

  1. Добавьте 100 зл и ной ясного буфера образца(таблица1) к магнитным бусинкам и переприимсайте с пипеткой P200. Инкубировать на льду в течение 10 мин. Флик осторожно, чтобы повторно приостановить бисер периодически.
  2. Захват магнитных бусин на магнит и собирать 15 злификации для анализа белков в RIPiT elution через западный подьем (см. Рисунок 3A). Передача оставшейся elution в новую трубку с маркировкой 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы были перекрестными формальдегидами, то образцы должны быть инкубированы при 65 градусах по Цельсию в течение 1 ч, чтобы обратить вспять перекрестные ссылки.
  3. Выполните западные помарки на образцах, собранных на различных этапах (вход, истощение IP FLAG, FLAG IP, второе истощение IP, второе elution IP). Пятно с антителами против двух белков приманки, их другие взаимодействующие, если известно, и по крайней мере один не взаимодействующих RBP в качестве отрицательного контроля(Рисунок 3A).

10. Извлечение РНК и конец лечения

  1. К elution RIPiT добавьте 320 qL RNase-свободно ddH2O, 400 qL фенол-хлороформа изоамил спирта (PCIAA, pH 4.5), и вихрь для 30 s и закрутите на комнатной температуре на 12.000 x g для 5 m. Соберите 350 ql участка aque. Добавьте 35 л из 3 М ацетата натрия, 1 зл 1 МГКЛ2,10 мкг гликогена и 1 мл 100% этанола. Инкубировать ночь при -20 градусов по Цельсию.
  2. Для гранул РНК, центрифуга на 12000 х г в течение 30 мин при 4 c. Вымойте РНК в 70% этанола.
  3. Чтобы удалить 3' фосфата, оставленные на РНК после расщепления RNase I, resuspend РНК гранулы в 17 Зл RNase свободной ddH2O, и добавить 2 ЗЛ 10x T4 полинуклеотид киназы (PNK) буфера (Таблица материалов) и 1 Зл T4 PNK. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Активность 3'фосфатазы Т4 PNK имеет оптимальную активность при рН 617. Буфер реакции PNK оптимизирован для 5' киназы деятельности T4 PNK и имеет рН 7.6. При корректировке рН конечной реакции была предпринята попытка, этот шаг может быть дополнительно оптимизирован.
  4. Добавьте в трубку 380 л. без RNase ddH2O и 400 л PCIAA pH 4.5. Вихрь на 30 с, центрифуга при 12 000 х г в течение 5 мин. Соберите аквистную фазу и добавьте 35 л из 3 М ацетата натрия, 1 л из 1 M MgCl2, 10 мкг гликогена и 1 мл 100% этанола.
  5. Инкубировать ночь при -20 градусов по Цельсию. Пеллет и мыть РНК с 70% этанола, как указано выше. Повторное увеличение РНК в 4,5 л безряльной воды.

11. Оценка размера и изобилия РНК-следа

  1. Успешный RIPiT, как ожидается, даст 1 моль или более фрагментов РНК. Для количественной оценки фактической урожайности, передача 0,7 л РНК RIPiT (1/6 от общего объема) в новую трубку. Добавляйте 2 qL 10x буфера T4 PNK, 1 qL 1 mM ATP, 40 «Ci»32P-ATP (0.5-1.0 л бульона), и 1 Л T4 PNK. Отрегулируйте объем до 10 qL и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    1. Параллельно PNK реакции, этикетка низкого диапазона ДНК лестница и 0,1 моль синтетической РНК или ДНК олиго (20-40 nt) для использования размера и количества стандартов.
  2. Разрешить помечены РНК / ДНК на 26% мочевины-PAGE гель (20 х 27 х 0,45 мм3). Гель должен быть предварительно запустить в течение 30 минут на 35 Вт. Флеш скважин до предварительного запуска и перед погрузкой образцов и запустить на 35 Вт, пока бромофенол синий краситель фронт почти достиг конца геля.
  3. Тщательно удалите гель из стеклянных пластин на кусок 8 х 11 дюймов фильтруя бумагу. С гелем на верхней части бумаги, место в гель сушки аппарата и накрыть куском полиэтиленовой пленки. Сухой гель при 80 градусах по Цельсию на 1 ч с вакуумом.
  4. Выставить высушенный гель на фосфоэкран на ночь или до тех пор, пока не будет обнаружен адекватный сигнал. Изображение фосфоэкрана. Хорошее качество РНК от RIPiT должны появиться как мазок в переулке, с минимальными видными полосами(рисунок 3B). Для количественной оценки РНК сравните интенсивность сигнала желаемого размера фрагментов РНК в переулке RIPiT с сигналом от 0,1 моль помеченного синтетического олиго.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, размер и количество следов РНК могут быть проверены с помощью биоанализа высокой чувствительности(рисунок 3C).

12. Лигация адаптера

  1. Приготовьте RIPiT РНК так, что не менее 3 моль РНК растворяется в 3,8 л воды.
  2. В 0,2 мл полимеразной цепной реакции (ПЦР) трубки, объединить 3,8 л РНК, 1 зл miR-CAT-33 предварительно аденированный адаптер (7 м/м) (Таблица материалов). Инкубировать смесь на тепловом циклическом цикле при 65 градусах по Цельсию в течение 10 мин, 16 градусов по Цельсию в течение 5 мин, затем удерживайте при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно аденилатированный связующий можно либо заказать у службы синтеза олиго, либо обычай неаденителированного олиго ДНК-олиго от любой службы синтеза олиго может быть аденирован с помощью Mth RNA ligase(Таблицаматериалов) и гель очищенный.
  3. К той же трубке добавьте 1,5 л 10x буфера лигазовой лиги T4 RNA, 7,5 л 50% полиэтилена гликоль 8000 (PEG-8000), 0,75 л 20 мМ дитиотрейтол (DTT), и0,45 л T4 RNL2 Tr. Tr2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 50% PEG-8000 поставляется с ЗАПомяваемым ЛИгазом РНК и буфером. Решения PEG-8000 вязкие и должны медленно прокладываться.
  4. Инкубировать реакцию в тепловом циклическом при температуре 30 градусов по Цельсию в течение 6 ч, нагревать лигазы при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 10 мин, затем удерживайте при температуре 4 градусов по Цельсию.

13. Обратная транскрипция

  1. К трубке с перевязочной смесью со ступени 12.4, добавьте 11,25 л 4x дезоксинуклеотидных трифосфатов (dNTP), которая содержит смесь регулярных и биотинилапов dNTPs (см. Таблица1), 1,0 л из 10 км РТ праймеры (Таблица материалов), и 6,8 л л Безrзаневода. Инкубировать при 65 градусах по Цельсию в течение 5 мин, затем удерживайте при 4 градусах По Цельсию.
  2. Передача труб на лед и добавить 9,0 л 5x первой нитки (FS) буфер без MgCl2 (Таблица 1), 2,25 л 100 мМ DTT, 1,2 л реверсивного фермента транскриптазы в окончательный объем 45 л (Таблицаматериалов).
  3. Инкубировать в тепловом цикле при температуре 55 градусов по Цельсию в течение 30-60 мин. Тепло инактивируется обратная транскриптаза при температуре 70 градусов по Цельсию в течение 15 мин и удерживайте образец при температуре 4 градусов по Цельсию.

14. Очистка продукта RT

  1. Добавьте 45 qL 2x буфера нагрузки мочевины(Таблица1) к реакции RT. Разбавить 1 мкг низкой дальности ДНК Лестница в 45 л и добавить 45 л 2x мочевины буфер нагрузки.
  2. Приготовьте 10% мочевины-PAGE гель (20 х28 х 0,15 см 3; Таблица 1) с 8-ну колодец. Используя шприц или трубу, промыть скважины с буфером 0.5x Tris/borate/EDTA (TBE).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Домашние гели выше предлагают лучшее разрешение в отделении расширенного продукта RT от нерасширенных RT грунтовки. В качестве альтернативы можно также использовать предварительно отлитые гели мочевины-PAGE(Таблицаматериалов). Как предварительно литые гели позволяют меньшие максимальные объемы в скважине, так что образцы должны быть разделены на несколько скважин. Предварительно литые гели должны быть запущены при 150 х 200 В.
  3. Предварительно запустить гель на 35 Вт в течение 30 мин. Флеш скважины снова, загрузить образцы и запустить гель на 35 Вт, пока бромофенол синий краситель фронт мигрировал примерно на 1 дюйм от конца геля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте металлическую тепловую раковину во время предварительного запуска и финального запуска, чтобы предотвратить перегрев геля.
  4. Пятно гель в течение 5 минут в 1x золото нуклеиновой кислоты гель пятно раствор подготовлен в 0,5x TBE. Этот краситель светочувствительный, поэтому избегайте воздействия света.
  5. Изображение геля на флуоресцентном сканере для целей документации с использованием 520 нм возбуждания и 580 нм эмиссионных фильтров. Если флуоресцентный сканер недоступен, используйте синий светтрансиллистор. Продукт RT должен отображаться как мазок, начиная над нерасширенным RT грунтовки (Рисунок 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя золотой нуклеиновой кислоты гель окрашивания красителя легко визуализированы на гель документ с уф-источником света, очень важно, чтобы не подвергать ценный продукт RT УФ для предотвращения повреждений.
  6. Визуализируйте гель на синем светло-иллюминаторе и вырезают продукт RT из геля. Рекомендуется сократить ДНК с расширениями в диапазоне от 30-200 nt(рисунок 4). Поместите вырезанные кусочки геля на чистую поверхность и фарш ломтик на мелкие кусочки, чтобы увеличить площадь поверхности. Тщательно перенесите в трубку 1,5 мл и добавьте 800 л буфера elution ДНК(таблица 1).
  7. Инкубировать кусочки геля с нежным смешиванием с буфером elution ДНК в течение ночи при комнатной температуре.
  8. Отделите буфер elution от геля путем проходить суспензию через колонку фильтра ацетата целлюлозы(Таблицаматериалов) помещенная в трубку собрания 2 mL.
  9. В 1,5 мл трубки, мыть 10 зл и л стрептавидина магнитных бусин с 500 Л l стрептавидина шарика мыть буфер(Таблица 1). Повторите в течение трех общих смок. Не дайте бисервы высохнуть. Переприостанавливаем бусины в 10 злицита буфера ДНК(таблица 1).
  10. Передача elution буфер отделены от геля штук в шаге 14,8 в трубку, содержащую промытые стрептавидин магнитные бусы.
  11. Инкубировать с нежным смешиванием не менее 8 ч при комнатной температуре. Захват бусинна на магнит, удалить супернатант и resuspend магнитных бусин в 10 Зл-Л воды без RNase и передачи в 0,2 мл ПЦР трубки.

15. Круговая циркуляция продукта RT

  1. Продукция RT, запечатленная на стрептавидиновых бусинках, циркулярна, а на бисере. К магнитной суспензии бисера добавьте 2,0 л 10-х буфера реакции круговой циркуляции, 1,0 л 1 мМ АТФ, 1,0 л 50 мМ MnCl2, 4,0 л 5 M бетаин, 1,0 л ssDNA лигазы I (Таблицаматериалов),и 1,0 л воды без RNase.
  2. Инкубировать реакцию круговой циркуляции на тепловом цикле при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 4 ч. Тепло инактивировать ssDNA ligase I, нагревая при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 10 мин, затем удерживайте при температуре 4 градусов по Цельсию.

16. Испытание ПЦР

  1. Прежде чем приступить к крупномасштабной ПЦР, используйте часть циркулярного продукта, чтобы определить идеальное количество циклов усиления для каждого образца. Этот шаг помогает предотвратить чрезмерное усиление и ограничить артефакты ПЦР, поскольку компоненты реакции ПЦР становятся ограничивающими на более высоких циклах ПЦР.
  2. Подготовьте реакцию ПЦР 45 л с 4,0-6,0 л кругового продукта с шага 15,2, 9,0 л 5x реакционного буфера, 0,9 л 10 M dNTPs, 2,25 л 10 мкм PE1.0primer (Таблица материалов), 2,25 мл. , и 0,045 л высокой точности ДНК полимераза(Таблица материалов), и воды.
  3. Хорошо смешайте реакцию и разделите на три реакции по 15 л. Каждая из этих трех реакций будет зависеть от переменного количества циклов ПЦР. Идеальное количество циклов, как ожидается, будет между 7 и 14. Так что выполняйте тестовые ПХР для 8, 11 и 14 циклов.
  4. Используйте следующие условия ПЦР: 98 градусов по Цельсию - 30 с; 98 кВ - 5 с; 65 кВ - 10 с; 72 кВ - 15 с; 72 КК - 2 мин; 12 кВ - удерживайте.
  5. Добавьте 3 qL 6x крася загрузки геля и разрешите на 10% родном геле PAGE до тех пор, пока синий фронт красителя не мигрировал 3/4 геля. Пятно гель с использованием золота нуклеиновой кислоты гель пятно и изображение, как в шагах 14,4 и 14,5(Рисунок 5).
  6. Чтобы выбрать идеальное количество циклов ПЦР, сравните продукты ПЦР с увеличением числа циклов. Выберите номер цикла, который дает наибольшее количество продукта ожидаемого размера без артефактов overamplification (например, мазок ДНК гораздо больше, чем ожидалось, и где нет заметного истощения PE1.0 и PE2.0 праймеров видно (см. красную стрелку в Рисунок 5).

17. Крупномасштабный ПЦР

  1. Подготовьте 45 ПЦР реакции, как в шаге 16.2 и повторить ПЦР. Разрешить ПЦР на 10% родной PAGE на 150 V, пятно с 1x золотой нуклеиновой кислоты гель пятно и изображение на синий свет transilluminator.
  2. Вырезать продукт ПЦР из геля и передать в 3 мл шприца. Используйте шприц, чтобы раздавить гель и выдавливание в трубку 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нерасширенный продукт RT при круговой циркуляции дает пЦР-продукт в 151 б.п. Таким образом, на этом этапе следует размер выбрать продукты, которые больше, чем 151 bp(рисунок 6).
  3. Добавьте 900 л буфера элюции ДНК и инкубировать при комнатной температуре на ночь с нежным смешиванием.
  4. Перенесите гель на целлюлозный ацетатный фильтр, помещенный в трубку коллекции 2 мл. Спин при 12000 х г в течение 3 мин, собирая супернатант в свежую трубку.
  5. Добавьте еще 400 qL буфера элюции ДНК в измельченный гель и перенесите в трубку 1,5 мл. Инкубировать с нежным смешиванием в течение дополнительных 4 часов для второго elution.
  6. Объедините все elutions и разделить на 3 трубки с 400 qL каждый. Осаждает ДНК, добавляя 1 мл 100% этанола и 10 мкг гликогена. Вихрь и инкубировать не менее 2 ч при -20 градусов по Цельсию.
  7. Гранулы ДНК при 12000 х г в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия. Вымойте ДНК гранулы с 70% этанола.
  8. Тщательно удалите весь этанол путем пайпетирования и быстро resuspend ДНК гранулы в 20 Зл воды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе важно не допустить, чтобы гранулы ДНК стали сухими, так как высыхание ДНК может денатурировать ее.
  9. Используйте небольшую часть образца ДНК для определения размера и концентрации пЦР-продукта с помощью флюорометра и биоанализатора высокой чувствительности ДНК. Образцы теперь могут быть представлены для секвенирования на одной из платформ.
  10. Секвенированные считывание могут быть обработаны (например, удаление адаптера, обрезка, чтобы сохранить последовательности йgt;30 Phred оценка), выровнены с эталонным геномом, и визуализированы на браузере, таких как UCSC геном браузера (Рисунок 7).

Результаты

Успешный RIPiT приведет к иммунопрециципции как белков, представляющих интерес и других известных взаимодействующих белков, а также отсутствие невзаимодействующих белков. Как видно на рисунке 3A, как Magoh и EIF4AIII были обнаружены в RIPiT elution, но HNRNPA1 не было (переулок 6). ...

Обсуждение

Мы обсуждаем здесь некоторые ключевые соображения для успешного выполнения RIPiT. Прежде всего, отдельные ИП должны быть оптимизированы для достижения максимально возможной эффективности на каждом этапе. Количество бусинок FLAG agarose для входиного количества клеток, описанных здесь, оказа...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NIH GM120209 (GS). Авторы благодарят OSUCCC Genomics Genomics Shared Resources Core за их услуги (CCC Support Grant NCI P30 CA16058).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-FLAG Affinity GelSigmaA2220
ATP, [γ-32P]- 3,000 Ci/mmol 10 mCi/mL EasyTide, 250 µCiPerkinElmerBLU502A250UC
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips (200)Fisher14-823-435
Betaine 5MSigmaB0300
biotin-dATPTriLinkN-5002
biotin-dCTPPerkin ElmerNEL540001EA
Branson Sonifier, Model SSE-1Branson
CircLigase IVWR76081-606ssDNA ligase I
DMEM, High GlucoseThermoFisher11995-065
DNA load buffer NEBNEB
Dynabeads Protein ALifeTech10002D
Flp-In-T-REx 293 Cell LineThermoFisherR78007
GeneRuler Low Range DNA LadderThermoScientificFERSM1203
Hygromycin BThermoFisher10687010
Mini-PROTEAN TBE Gel 10 wellBio-Rad4565013
Mini-PROTEAN TBE-Urea GelBio-Rad4566033
miRCAT-33 adapter 5′-TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGddC-3′Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Mirus transIT-X2 transfection reagentMirusMIR 6004
Mth RNA ligaseNEBE2610S
PE1.0 5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
PE2.0 5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTC
GGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATC*T-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol (25:24:1, pH 6.7, 100 mLl)FisherBP1752I-100
Purple Gel Loading Dye (6x)NEBNEB #7025
Q5 DNA PolymeraseNEBM0491S/L
RNase I, E. coli, 1,000 UEppicenterN6901K
SPIN-X columnCorningCLS8160-24EA
Streptavidin beadsThermoFisher60210
Superscript III (SSIII)ThermoScientific18080044reverse transcriptase enzyme
SybrGoldThermoFisherS11494gold nucleic acid gel stain
T4 Polynucleotide Kinase-2500UNEBM0201L
T4RNL2 Tr. K227QNEBM0351S
TetracyclineSigma87128
Thermostable 5´ App DNA/RNA LigaseNEBM0319S
TruSeq_SE1 5′-pGGCACTANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE10 5′-pGGTGTTCNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE11 5′-pGGTAAGTNNNNNAGATCGGAA
GAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE12 5′-pGGAGATGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE2 5′-pGGGTAGCNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE35′-pGGTCGATNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCT
CTTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE4 5′-pGGCCTCGNNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE5 5′-pGGTGACANNNNNAGATCGGAAGA
GCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTC
TTCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE6 5′-pGGTAGACNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE7 5′-pGGGCCCTNNNNNAGATCGGAAG
AGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCT
TCCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE8 5′-pGGATCGGNNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTT
CCGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
TruSeq_SE9 5′-pGGACTGANNNNNAGATCGGAAGAG
CGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-SPACER 18-CTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTC
CGATCTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′		Anythis protocol is only compatible with the Illumina sequencing platform
Typhoon 5 Bimolecular ImagerGE Healthcare Life Science29187191

Ссылки

  1. Karousis, E. D., Nasif, S., Mühlemann, O. Nonsense-mediated mRNA decay: novel mechanistic insights and biological impact. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 7 (5), 661-682 (2016).
  2. Ivanov, P. V., Gehring, N. H., Kunz, J. B., Hentze, M. W., Kulozik, A. E. Interactions between UPF1, eRFs, PABP and the exon junction complex suggest an integrated model for mammalian NMD pathways. The EMBO Journal. 27 (5), 736-747 (2008).
  3. Papasaikas, P., Valcárcel, J. The Spliceosome: The Ultimate RNA Chaperone and Sculptor. Trends in Biochemical Sciences. 41 (1), 33-45 (2016).
  4. Jensen, K. B., Darnell, R. B. CLIP: Crosslinking and ImmunoPrecipitation of In Vivo RNA Targets of RNA-Binding Proteins. Methods in Molecular Biology. 488, 85-98 (2008).
  5. Garzia, A., Morozov, P., Sajek, M., Meyer, C., Tuschl, T. PAR-CLIP for Discovering Target Sites of RNA-Binding Proteins. mRNA Decay: Methods and Protocols. 1720, 55-75 (2018).
  6. Konig, J., et al. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
  7. Sibley, C. R. Individual Nucleotide Resolution UV Cross-Linking and Immunoprecipitation (iCLIP) to Determine Protein-RNA Interactions. RNA Detection: Methods and Protocols. 1649, 427-454 (2018).
  8. Wheeler, E. C., Van Nostrand, E. L., Yeo, G. W. Advances and challenges in the detection of transcriptome‐wide protein-RNA interactions. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (1), (2018).
  9. Singh, G., et al. The Cellular EJC Interactome Reveals Higher-Order mRNP Structure and an EJC-SR Protein Nexus. Cell. 151, 750-764 (2012).
  10. Singh, G., Ricci, E. P., Moore, M. J. RIPiT-Seq: A high-throughput approach for footprinting RNA:protein complexes. Methods. 65, 320-332 (2014).
  11. Mabin, J. W., et al. The Exon Junction Complex Undergoes a Compositional Switch that Alters mRNP Structure and Nonsense-Mediated mRNA Decay Activity. Cell Reports. 25 (9), 2431-2446 (2018).
  12. Gehring, N. H., Lamprinaki, S., Kulozik, A. E., Hentze, M. W. Disassembly of Exon Junction Complexes by PYM. Cell. 137 (3), 536-548 (2009).
  13. Dostie, J., Dreyfuss, G. Translation Is Required to Remove Y14 from mRNAs in the Cytoplasm. Current Biology. 12 (13), 1060-1067 (2002).
  14. Zünd, D., Gruber, A. R., Zavolan, M., Mühlemann, O. Translation-dependent displacement of UPF1 from coding sequences causes its enrichment in 3' UTRs. Nature Structural & Molecular Biology. 20 (8), 936-943 (2013).
  15. Gangras, P., Dayeh, D. M., Mabin, J. W., Nakanishi, K., Singh, G. Cloning and Identification of Recombinant Argonaute-Bound Small RNAs Using Next-Generation Sequencing. Argonaute Proteins: Methods and Protocols. 1680, 1-28 (2018).
  16. Heyer, E. E., Ozadam, H., Ricci, E. P., Cenik, C., Moore, M. J. An optimized kit-free method for making strand-specific deep sequencing libraries from RNA fragments. Nucleic Acids Research. 43 (1), 2 (2015).
  17. Cameron, V., Uhlenbeck, O. C. 3'-Phosphatase activity in T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 16 (23), 5120-5126 (1977).
  18. Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
  19. Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nature Communications. 6, 10237 (2015).
  20. Metkar, M., et al. Higher-Order Organization Principles of Pre-translational mRNPs. Molecular Cell. 72 (4), 715-726 (2018).
  21. Giudice, G., Sánchez-Cabo, F., Torroja, C., Lara-Pezzi, E. ATtRACT-a database of RNA-binding proteins and associated motifs. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  22. Paz, I., Kosti, I., Ares, M., Cline, M., Mandel-Gutfreund, Y. RBPmap: a web server for mapping binding sites of RNA-binding proteins. Nucleic Acids Research. 42, 361-367 (2014).
  23. Sundararaman, B., et al. Resources for the Comprehensive Discovery of Functional RNA Elements. Molecular Cell. 61 (6), 903-913 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

149RIPiTRBPRNP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены