Синтез функциональных магнитных наночастиц, их спряжение с Siderophore Фероксамин и его оценка для обнаружения бактерий

Резюме

Эта работа описывает протоколы для подготовки магнитных наночастиц, его покрытие с SiO₂, а затем его аминь функционализации с (3-аминопропил) триэтоксисилана (APTES) и его спряжения с deferoxamine с помощью succinyl moiety в качестве связучателя. Глубокое описание структурной характеристики и анализ бактерий захвата с помощью Y. enterocolitica для всех промежуточных наночастиц и окончательный конъюгированный также описаны в деталях.

Аннотация

В настоящей работе, синтез магнитных наночастиц, его покрытие с SiO₂, а затем его аминь функционализации с (3-аминопропил) триетоксисилана (APTES) и его спряжение с deferoxamine, боковой дрофор признан Yersinia enterocolitica, используя succinyl moiety в качестве связувателя описаны.

Магнитные наночастицы (MNP) магнетита (Fe₃O₄) были подготовлены solvothermal методом и покрыты SiO₂ (MNP@SiO₂) с использованием процесса Стёбер следуют функционализации с APTES (MNP@SiO₂@NH₂). Затем, фероксамин был конъюгированных с MNP@SiO₂@NH₂ карбодиимид соединения дать MNP@SiO₂@NH₂@Fa. Морфология и свойства конъюгированных и промежуточных были изучены восемью различными методами, включая дифракцию порошкового рентгеновского излучения (XRD), фурье трансформировать инфракрасную спектроскопию (FT-IR), спектроскопию Романа, рентгеновскую фотоэлектронную спектроскопию (XPS), микроскопию электронов передачи (TEM) и энергетическую дисперсию X-Ray. Эта исчерпывающая характеристика подтвердила формирование конъюгата. Наконец, для того, чтобы оценить емкость и специфичность наночастиц, они были протестированы в захвате бактерий анализа с помощью Yersinia enterocolitica.

Введение

Методы обнаружения бактерий с использованием MNP основаны на молекулярном распознавании антител, апгтемеров, биопротеинов, углеводов, спряженных к MNP патогенными бактериями^1. Принимая во внимание, что siderophores признаются конкретных рецепторов на внешней мембране бактерий, они также могут быть связаны с MNP, чтобы увеличить их специфичность². Siderophores являются небольшие органические молекулы, участвующие в Fe^{3 "поглощение} бактериями^3,4. О подготовке спряжений между бокофорами и МНП наряду с их оценкой для улавливания и изоляции бактерий пока не сообщалось.

Одним из важнейших шагов в синтезе конъюгированных магнитных наночастиц с небольшими молекулами является выбор типа связи или взаимодействия между ними для обеспечения того, чтобы небольшая молекула была прикреплена к поверхности MNP. По этой причине, процедура подготовки конъюгировать между магнитными наночастицами и фероксамином- siderophore признанных Yersinia enterocolitica-была сосредоточена на генерации модифицируемой поверхности MNP, чтобы увязать его ковалентно в siderophore карбодиимицидной химии. Для того, чтобы получить единый наночастицы магнетита (MNP) и улучшить нуклеацию и контроль размера, реакция solvolysis с бензиловым спиртом была проведена в тепловом блоке без встряхивания⁵. Затем кремнеземное покрытие было сгенерировано методом Стёбера для защиты и повышения устойчивости подвески наночастиц в aqueous media⁶. Принимая во внимание структуру фероксамина, введение аминь групп необходимо для производства подходящих наночастиц (MNP@SiO₂@NH_2),чтобы быть сопряжены с siderophore. Это было достигнуто путем конденсации (3-аминопропил) триетоксисилана (APTES) с алкогольными группами, присутствующими на поверхности кремнезема модифицированных наночастиц (MNP@SiO₂) с использованием метода соль-геля⁷.

Параллельно комплекс фероксаминов железа (III) был подготовлен комплексом коммерческого дефероксамина с ацетонатом железа ацетилата в аквеевом растворе. N-succinylferoxamine, подшипник succinyl групп, которые будут выступать в качестве связунов, был получен реакцией фероксамина с сукциническим ангидридом.

Спюгация между MNP@SiO₂@NH₂ и N-succinylferoxamine дать MNP@SiO₂@NH_иФа была проведена через карбодииимид химии с использованием в качестве соединения реагентов бензорифотризол-1-й дифологтиуфос -оксофторофос (BOP) и 1-гидроксибензотриазол (HOBt) в мягком базовом носителе для активации терминальной кислотной группы в N-succinylferoxamine⁸. N

После того, как MNPs были охарактеризованы, мы оценили возможности голых и функциональных магнитных наночастиц для захвата дикого типа (WC-A) и мутант Y. enterocolitica не хватает фероксамина рецептора FoxA (FoxA WC-A 12-8). Равнины MNPs, функционализуемые MNPs и конъюгированных MNP@SiO₂@NH_Фабыло разрешено взаимодействовать с каждым Y. enterocolitica штамма. Бактерии-конъюгированные агрегаты были отделены от бактерий подвески путем применения магнитного поля. Разделенные агрегаты дважды промывались фосфатным буферизированным физраствором (PBS), повторно приостанавливались в PBS для подготовки серийных разбавлений, а затем, они были покрыны для подсчета колоний. Этот протокол демонстрирует каждый шаг синтеза MNP@SiO₂@NH@Fa, структурную характеристику всех промежуточных и конъюгированных, а также анализ захвата бактерии как простой способ оценить специфику спряжения по отношению к промежуточным. ^{9 9}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Для реакций, выполняемых в условиях инертной атмосферы, вся стеклянная посуда была ранее высушена в духовке при температуре 65 градусов по Цельсию, запечатана резиновой перегородкой и трижды продувается аргоном.

1. Синтез магнитных наночастиц, конъюгированных с фероксамином

1. Синтез наночастиц магнитного синтеза Fe₃O₄ (MNPs)
   1. Добавьте 0,5 г Fe (acac)₃ в стеклянный флакон 20 мл, а затем смешайте с 10 мЛ бензилового спирта.
   2. Sonicate эту смесь в течение 2 мин, затем передать в отопительный блок и тепла при температуре 180 градусов по Цельсию в течение 72 ч.
   3. После завершения реакции дайте флаконам остыть, промыть наночастицы 96% этанолом и центрифугой при 4000 х г в течение 30 мин. Повторите центрифугирование не менее двух раз.
   4. Отделить наночастицы от супернатанта магнитным притяжением с помощью магнита неодимия (NdFeB) и отбросить остаточный растворитель.
   5. Промыть с 96% этанола повторяя шаг 1.1.4. и отбросить супернатант, чередующийся с звуковой в ванне в течение 1 мин при 40 кГц, пока растворитель не будет выглядеть ясным.
2. Магнитные наночастицы SiO₂ покрытие (MNP@SiO₂)
   1. Подготовьте подвеску 2 г МНП в 80 мл изопропанола, а затем добавьте 4 мл 21% аммиака, 7,5 мл дистиллированной воды и 0,56 мл тетраэтил ортилического ортосиликата (TEOS) (в этом порядке) в круглую нижнюю колбу с магнитной решеткой.
   2. Нагрейте смесь при температуре 40 градусов по Цельсию при непрерывном перемешивании, а затем sonicate в течение 1 ч.
   3. Отделить MNP с магнитом, отбросить супернатант, и разогнать его в 30 мл изопропанола.
   4. Повторите шаги 1.2.1. и 1.2.2.
   5. Удалить и вымыть магнитного перемешать бар с 96% этанола, чтобы восстановить весь материал.
   6. Отделить наночастицы от супернатанта магнитным притяжением с помощью магнита.
   7. Откажитесь от супернатанта и промойте наночастицы 96% этанола, три раза чередуясь с звуковой.
   8. Высушите наночастицы при вакууме при комнатной температуре в течение 12 ч.
3. Функционализации MNP@SiO₂ с (3-аминопропил) триэтоксисилана (APTES)
   1. Промыть 500 мг MNP@SiO_2, полученных от предыдущего шага с N,N-диметилформамид (DMF) под инертной атмосферой, а затем sonicate в течение 1 мин на 40 кГц. Затем отбросьте супернатант и повторите этот процесс три раза.
   2. Повторно приостановить частицы в круглой нижней колбе, под перемешиванием с магнитной бар перемешать и добавить 9 мл APTES.
   3. Перемешать смесь при 60 градусов по Цельсию на 12 ч.
   4. Откажитесь от супернатанта и промойте наночастицы 96% этанола, три раза чередуясь с звуковой.
4. Синтез фероксамина
   1. Растворите 100 мг (0,15 ммоль) соли дефоксамина мезилата и 53,0 мг (0,15 ммоль) Fe (acac)₃ в 5 мл дистиллированной воды и перемешайте смесь на ночь при комнатной температуре.
   2. Вымойте полученный продукт три раза с 20 мл EtOAc в разделительной воронке, а затем удалить органический растворитель под вакуумом с помощью вращательного испарителя.
   3. Заморозить-сухой aqueous фазы позволить себе фероксамин, как красный твердый.
5. Синтез N-сукцинильфероксимин
   1. Добавьте 350 мг (3,50 ммоль) сучцинического ангидрида в раствор 100 мг (0,17 ммоль) фероксамина в 5 л пиризина в 50-м л круглой нижней колбе под инертной атмосферой.
   2. Перемешать полученную смесь при комнатной температуре в течение 16 ч. По истечении этого времени, удалить избыток пиридин под пониженным давлением в ротатор испаритель, чтобы дать темно-красный твердый.
   3. Растворите реакцию сырой в 3 мл метанола.
   4. Перенесите метаноловый раствор в колонку Sephadex (20 см Sephadex в столбе диаметром 20 мм) и elute на 0,5 м/мин.
   5. Соберите красную фракцию и удалите метанол под вакуум с помощью ротатора испарительного.
6. Синтез сопряженного MNP@SiO₂@NH@Fa
   1. Промыть 30 мг сухого MNP@SiO₂@NH₂ дважды с DMF и sonicate наночастицы в 100 мл Erlenmeyer колбу в течение 30 минут под инертной атмосферой.
   2. Приготовьте раствор NN-succinylferoxamine (200 мг, 0,30 ммоль), бензотриазол-1-ил-окс-трис-(диметиламино)-фосфоний гексафторосфат (БОП, 173 мг, 0,45 ммоль), 1-гидроксибензотриоз (HOBt, 46 мг, 0,39 ммоль) и N,N-diisopropythylamine (DIPEA, 128,8 мг, 1,21 ммоль) в 10 ммл DMF (Mix A) в 50 мЛ круглое дном в атмосфере.
   3. Приостановить ранее промыть MNP@SiO₂@NH₂ в 3 мЛ DMF под sonication в сухих в условиях, свободных от кислорода с использованием аргона газовой атмосферы (Mix B).
   4. Добавить смесь А, чтобы смешать B dropwise.
   5. Встряхните окончательную смесь с помощью орбитального шейкера при комнатной температуре на ночь.
   6. Отделите полученную конъюгированную (MNP@SiO₂@NH@Fa) от подвески с помощью магнита.
   7. Промыть полученный твердый, а затем, sonicate его пять раз с 10 мл этанола.
   8. Высушите твердое тело под вакуумом на 24 ч.

2. Бактериальный анализ с штаммами Y. enterocolitica для количественной оценки улавливания патогенных бактерий с помощью наночастиц

1. Подготовьте суспензию всех промежуточных наночастиц и окончательный конъюгации в PBS на 1 мг/мл в стерильных 2 мЛ трубках.
2. Приготовьте культуру Y. enterocolitica в 5 мл бульона Лурия Бертани (LB) ночью инкубации при 37 градусов по Цельсию.
3. Приготовьте 5 мл железа дефицитный триптический соевый бульон (TSB), добавив 50 мл 10 мМ 2,2'-bipyridyl.
4. Прививайте 5 мл железа дефицитным TSB с 50 мл ночной культуры Y. enterocolitica, а затем, инкубировать при 37 градусов по Цельсию с агитацией до тех пор, пока не будет достигнут OD₆₀₀ и 0.5'u20120.8.
5. Возьмите 100 мл культуры, полученной в шаге 2.4 и разбавляйте в трубке 2,0 мл, содержащей 900 мл PBS, чтобы получить первое разбавление 1/10. Затем подготовьте разбавление 1/100 от первого разбавления с помощью той же процедуры, чтобы получить концентрацию бактериальных клеток на 1 х 10⁶ колонии Формация единиц (CFU)/mL примерно.
6. Добавьте 100 мл наночастиц суспензии при 1 мг/мл до 1 мл от 1/100 разбавления бактериальной подвески в трубке 2,0 мл и гомогенизировать вихрем.
7. Инкубировать культуру при 20 градусов по Цельсию на 1 ч.
8. Разделите агрегаты MNP/bacteria с помощью магнита и тщательно отбросьте супернатант.
9. Промыть разделенные наночастицы дважды с 1 mL PBS с помощью вихря.
10. Приостановите наночастицы в 1 мл PBS, чтобы подсчитать количество бактериального захвата в CFU/mL.
11. Подготовка четырех последовательных 1/10 разбавления от бывшей подвески до 1 х 10^-4 разбавления достигается.
12. Плита 10 мл каждого разбавления на пластины агара TS и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в одночасье.
13. Фотография пластины с гелевым диджитализатором в эпи-белом режиме. Обработайте изображение с соответствующим программным обеспечением для усиления пятна для подсчета количества отдельных колоний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый промежуточный MNP был охарактеризован для наблюдения за ходом синтеза. Во-первых, голые депутаты были изучены XRD, чтобы проверить кристаллическую структуру. Затем, FT-IR спектр каждого промежуточного был запущен, чтобы проверить изменения, которые произошли в соответствующей реакции. Был также проведен анализ спектроскопии каждого промежуточного анализа Романа, с тем чтобы подтвердить выводы, сделанные из спектра FT-IR. Анализ TGA позволил оценить вес потери промежуточных веществ, несущих органический материал в его структуре. Морфология и размер каждого промежуточного были изучены TEM. Наконец, анализ XPS имеет решающее значение для определения состояния окисления атома на каждой промежуточной поверхности МНП и подтверждения образования ковалентных связей в конъюгированном MNP@SiO₂@NH@Fa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для определения морфологии и свойств каждого промежуточного и окончательного спряжения проводится исчерпывающая структурная характеристика. Для этого для демонстрации формирования конъюгации используются методы XRD, FT-IR, Рамановской спектроскопии, TGA, TEM, EDX mapping и XPS. Состояния окислен?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает синтез спряжения между магнитными наночастицами и бокофором фероксамином путем ковалентной связи. Синтез магнетита был проведен с использованием протокола, о которого сообщает Pinna et al.⁵ с последующим кремнеземным покрытием для защиты магнитного я?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT	Acros	300561000
2,2′-Bipyridyl	Sigma Aldrich	D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99%	Acros	151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3	Sigma Aldrich	338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent	Acros	209800050
Benzyl alcohol	Sigma Aldrich	822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC)	Sigma Aldrich	D9533
Ethanol, anhydrous, 96%	Panreac	131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97%	Sigma Aldrich	F300
LB Broth (Lennox)	Sigma Aldrich	L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal	Acros	459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal	Acros	339421000
Sephadex LH-20	Sigma Aldrich	LH20100
Succinic anhydride >99%	Sigma Aldrich	239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0%	Sigma Aldrich	86578