Подготовка Drosophila Ларваль и Pupal Тесты для анализа клеточного отдела в прямом эфире, Intact Ткани

Резюме

Целью этого протокола является анализ деления клеток в нетронутой ткани живой и фиксированной клеточной микроскопией с использованием дрозофилы мейотических сперматозитов. Протокол демонстрирует, как изолировать целые, нетронутые яички от личинок Дрозофилы и ранних куколок, и как обрабатывать и монтировать их для микроскопии.

Аннотация

Экспериментальный анализ клеток, делящихся в живых, нетронутых тканей и органов имеет важное значение для нашего понимания того, как деление клеток интегрируется с развитием, ткани гомеостаза, и болезни процессов. Дрозофилы сперматоцитов, проходящих мейоз идеально подходит для этого анализа, потому что (1) целые яички Drosophila, содержащие сперматозиты относительно легко подготовиться к микроскопии, (2) сперматозитов 'большой размер делает их хорошо подходит для изображения высокого разрешения, и (3) мощные дрозофилы генетические инструменты могут быть интегрированы с виво-анализом. Здесь мы представляем легко доступный протокол для подготовки целых яичек из Drosophila третьих личинок и ранних куколк. Мы описываем, как идентифицировать мейотические сперматозиты в подготовленных целых яичках и как их изобразить с помощью замедленной микроскопии. Предусмотрены также протоколы фиксации и иммуноспоминации целых яичек. Использование личиночных яичек имеет ряд преимуществ по сравнению с имеющимися протоколами, которые используют взрослые яички для анализа сперматозоидов. Самое главное, личиночные яички меньше и менее переполнены клетками, чем взрослые яички, и это значительно облегчает высокое разрешение изображения сперматоций. Чтобы продемонстрировать эти преимущества и применение протоколов, мы представляем результаты, показывающие перераспределение эндоплазмического ретикулума по отношению к микротрубочкам шпинделя во время деления клеток в одном сперматоции, изображенном замедленной конфокальной микроскопией. Протоколы могут сочетаться с экспрессией любого количества флуоресцентно маркированных белков или маркеров органелл, а также генных мутаций и других генетических инструментов, что делает этот подход особенно мощным для анализа механизмов деления клеток в физиологическом контексте целых тканей и органов.

Введение

Разделение клеток часто изучается с помощью клеточных линий, выращенных в культуре¹. Хотя мы получили богатство бесценного понимания и понимания фундаментальных механизмов из этих исследований², клетки, выращенные в культуре не может полностью резюмировать физиологии деления клеток, как это происходит в нетронутой, живой ткани. Например, в нетронутых тканей и органов, клетки должны делиться в нужном месте и в нужное время, так что потомство клетки должным образом расположены в ткани, так что они могут пройти соответствующую дифференциацию или функциональные программы, и так, что пролиферация клеток правильно координируется с ростом тканей или гомеостаза³. Для клеток, выращенных в культуре, с другой стороны, деление клеток, как правило, регулируется факторами роста в культуре среды⁴, и, таким образом, мы не можем узнать из этих клеток, как in vivo экологических факторов, таких как архитектура тканей или развития сигнализации влияние процесса деления. Важно также отметить, что многие из клеточных линий, используемых для изучения деления клеток, таких как Клетки HeLa и U2OS, были получены из метастатических опухолей^5. Таким образом, многие аспекты основной физиологии этих раковых клеток, такие как механизмы регулирования клеточного цикла и хромосомной стабильности, вероятно, были изменены по сравнению со здоровыми клетками. Полное понимание физиологии клеточного деления, таким образом, зависит от нашей способности изучать деленительные клетки в их родной, в виво-среде, которые сохраняют физиологические регуляторные механизмы и архитектуру тканей.

Достижениям в понимании того, как деление клеток действует в нетронутых тканях и органах, препятствуют трудности, присущие анализу in vivo или ex vivo. Во-первых, это может быть трудно или невозможно получить доступ к деления клеток для микроскопического анализа в крупных органах или толстых тканей. Во-вторых, часто трудно предсказать, когда отдельные клетки будут делиться в vivo. В-третьих, физиология тканей может быстро ухудшаться во время культуры ex vivo. В этом протоколе мы описываем легко доступные методы для живого и фиксированного анализа дрозофилы меланогастер сперматозитов, как они проходят meiotic клеточных делений в полностью нетронутыми яичками. Эти клетки идеально подходят для живого, экс-виво-анализа, потому что они легко доступны со стандартными оптическими методами, такими как конфокальная микроскопия, они делятся в предсказуемое время и места, и нетронутыми яичками могут быть сохранены в культуре ex vivo до около 24 ч. Кроме того, дрозофилы сперматозиты большие круглые клетки (примерно 20-30 мкм в диаметре), которые не меняют форму, когда они делятся, что делает их идеальными для высокого разрешения, замедленного изображения клеточных компонентов, таких как шпиндельный аппарат и цитоплазматические органеллы. Хотя эти клетки проходят мейоз в отличие от митоза, многие из основных процессов деления клеток очень похожи между этими двумя механизмами деления клеток^6. Эти преимущества, в сочетании с мощными drosophila генетических инструментов, сделали Drosophila сперматоцитов широко используется модель для анализа ex vivo основных процессов деления клеток, включая образование шпинделя и регулирование, цитокинез, и органеллы ремоделирования и секционирования^7,,99,10,11.

Сперматоциты являются клетки, которые находятся на мейотической стадии сперматогенеза. В Drosophila, сперматогенез начинается с группой зародышевых стволовых клеток, которые расположены в небольшой области или "хаб" на одном полюсе яичка^12,13. Эти клетки делятся на асимметричный митоз, что приводит к одному дифференцированному сперматогоногу. Сперматогония затем проходят четыре синхронных митозы для производства группы из 16 клеток, которые остаются тесно связаны в одной кисты. На этом этапе клетки переходят от митотического к мейотическому клеточному циклу и называются сперматоцитами. Сперматоциты проводят около двух-трех дней в расширенной стадии G2 клеточного цикла, во время которого они резко растут и претерпевают цитологические изменения в подготовке к двум мейотическим делениям и последующем спермиогенезу^13,14. Вся группа из 16 сперматозитов в пределах одной кисты затем ввести первый мейотического деления в то же время. Таким образом, несколько мейотических сперматозитов могут быть изображены одновременно, как они проходят через деление клеток. Первое meiotic разделение продолжает сярвые для приблизительно 1.5 h и последовано за почти немедленно вторым meiotic разделением, принося 64 полные сперматидов которые идут дальше продифференцировать в возмужалые spermatozoa.

Уникальное преимущество использования сперматозитов для изучения деления клеток в живой, нетронутой ткани является то, что группы или кисты клеток постоянно прогрессируют через различные стадии сперматогенеза, и клетки на всех стадиях сперматогенеза обычно могут быть определены в любой данный яичка (см. Рисунок 3A). Таким образом, это относительно легко найти мейотических клеток в целых яичках. Как правило, мы фокусируем наш анализ на первом, а не на втором мейозе, потому что эти клетки гораздо больше и более поддаются изображению с высоким разрешением, но весь процесс, охватывающий оба мейотических деления, может быть успешно отображен. Следует также отметить, что общий протокол для подготовки тести и культуры могут быть использованы для анализа других процессов сперматогенеза, а также, таких, как ранее митотических стволовых клеток или сперматогонических подразделений или цитологические изменения, которые происходят, как сперматозоиды созревают в сперматозоид¹⁵. Многие из этих аспектов сперматогенеза очень сохраняются между Дрозофилой и людьми¹⁶.

Дрозофилы сперматоцитов начинают достигать мейотической фазы сперматогенеза во время третьей стадии личинок в звезде развития Drosophila ¹³. Таким образом, яички, изолированные от стадий жизненного цикла, начиная с третьей личинок в звезде и в том числе куски и взрослые могут быть использованы для анализа деления сперматоций. Несколько отличных протоколов доступны для извлечения яичек из взрослых самцов мух для живого и фиксированного анализа сперматогенеза^17,,18,,19. Эти протоколы могут быть предпочтительнее для изучения поздних стадиях сперматогенеза или, если генетические маркеры, которые видны только у взрослых должны быть использованы. Протокол фокусируется вместо этого на подготовке тести из личинок и ранних куколок, потому что яички на этих стадиях имеют несколько преимуществ, которые имеют непосредственное отношение к анализу деления клеток с высоким разрешением, замедленной микроскопией. Во-первых, яички от личинок и куски меньше, чем у взрослых, и клетки в органе менее переполнены. Из-за этого, деление сперматоцитов часто можно изображением вблизи внешней поверхности личиночных яичек, без необходимости проникать через несколько слоев светосеющих тканей. Во-вторых, взрослые яички двигаются ритмично из-за сокращений прикрепленных органов аксессуаров, и эти движения делают замедленное изображение отдельных клеток сложной задачей. И в-третьих, личинок яички являются выгодными при изучении генных мутаций, которые вызывают pupal или взрослых летальности. Наши методы оптимизированы для долгосрочной культуры яичек на стадии микроскопа, что позволяет для визуализации нескольких раундов деления клеток или прогрессирования отдельных клеток через несколько стадий сперматогенеза в том же препарате. Мы также описываем протокол фиксации и иммуностоинга целых яичек. В целом, наши протоколы особенно полезны для тех, кто заинтересован в изучении деления клеток в нетронутой ткани, и способность сочетать анализ сперматозитов с высокоуступчивыми генетическими инструментами Drosophila делает это особенно мощным подходом.

протокол

1. Подготовка животных, инструментов и средств массовой информации для вскрытия

1. Крест мужчины и женщины мух, чтобы получить потомство желаемого генотипа. Полезные трансгенные маркеры для идентификации и постановки мейотических сперматозитов включают GFP-тубулин для обозначения мейотического шпинделя и RFP-histone 2A для обозначения хромом⁸. Используйте от пяти до десяти самок на крест и поддерживать кресты на стандартной мухи пищи во флаконах в инкубаторе 25 градусов по Цельсию до тех пор, пока третий instar личинки начинают ползать по бокам флакона (4-5 дней). Ранние белые куски начнут формироваться на день позже.
2. Получить две пары прямых щипцы с прекрасными советами. Убедитесь, что кончики острые, даже в длину, и прямой(рисунок 1A). Используйте эти щипточки только для вскрытия, и крышка с 10 юл пипетки советы, когда не используется.
3. Подготовьте инструмент скальпеля.
   1. Вставьте тупой конец черного анодированного стального штифта насекомых в штырь держатель, и скрутить винт держателя, чтобы обеспечить штифт на месте. Используя пару щипц и под рассекающим микроскопом, схватите булавку насекомого посередине и согните его, чтобы сформировать внутренний угол 135 "(рисунок 1B). Острый конец предназначен для резки ткани, в то время как край используется для передачи яичек между каплями носителя.
   2. Крышка с наконечником пипетки 1000 л, когда они не используются.
4. Работая в капюшоне культуры ткани, подготовить 5 мл aliquots средств массовой информации Шнайдера и хранить на 4 кВ до времени использования. Когда готовы начать вскрытия, тепло й 5 мл медиа aliquot до комнатной температуры. Затем перенесите разогретую среду для вскрытия в шприц 10 мл и прикрепите фильтр шприца 0,22 мкм.

2. Рассечение яичек из ларьков и ранних купаний

1. Используйте шприц для заполнения фильтра, чтобы исключить три капли носителя (по 50 л каждый) в верхней, средней и нижней части стеклянной горки.
2. Используйте рассекающий зонд для передачи от пяти до десяти третьих личинок в звезде или ранних кусков (кукула, которые все еще белые или желтые) на верхнюю каплю. Аккуратно агитировать личинок и кусков в средствах массовой информации с вскрытия зонда для удаления любой пищи или мусора.
3. Под рассекающим микроскопом, поверните одну личинку или куколку на своей стороне с рассекающим зондом для того чтобы определить 2 двусторонних яички если присытствыю, то которые появляются как овальные сформированные полупрозрачные структуры в задней трети тела (Рисунок 2A, B). Звери, которым не хватает яичек, являются женскими и должны быть отброшены.
4. Когда самец личинки или кулачица найден и чист, переместить его на вторую каплю носителей. Повторяйте до тех пор, пока 3 или 4 мужских личинок и/или куски не будут переведены на вторую каплю носителей.
5. Работая во второй капли носителей, хватать одну самецскую личинку или кукуницу с парой щипцов в его середине области, просто передние яички. Используйте вторую пару щипков, чтобы аккуратно разорвать животное пополам.
6. Держите задний конец личинки или куколки вниз на стеклянной горке с парой щипц. Начиная только рядом с щипцы, нажмите вниз на кутикулу с помощью края скальпеля инструмент и переместить скальпель к разрезу конца животного. Это позволит изгнать внутренние органы животного, которые включают в себя кишки, жировые тела и яички.
7. Аккуратно дразнить друг от друга яички из остальных органов. Яички ясны, овальной формы органов, встроенных в ленты жира тела(рисунок 2C).
8. Переносите яички по одному на третью каплю носителей. Для этого вставьте край скальпеля под жировое тело, поднимите ткань из носителя и быстро переместите ее на третью каплю.
9. Кроме того, если не хватает жира тела по-прежнему прилагается к яичкам, чтобы успешно поднять ткани, осторожно передать ткани с помощью стекла Пастер pipette, который был предварительно увлажненный с вскрытием средств массовой информации.
10. Используйте острый конец скальпеля инструмент мягко отрезать избыток жира тела от яичек, оставляя только небольшой край жира тела по краям(Рисунок 2C). Это не обязательно, чтобы удалить все жировое тело, и попытка сделать это, скорее всего, приведет к повреждению или разрыв яичек.
11. Повторите выше шаги для всех мужских личинок на стеклянной горке.
12. Приступить к шагу 3 или шаг 5.

3. Монтаж яичек для live микроскопических изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура монтажа была адаптирована из недавно опубликованного протокола для визуализации drosophila личиночного мозга нейроблассов²⁰. Дополнительные сведения можно найти в этой ссылке.

1. Используйте фильтр шприц, чтобы депонировать одну каплю носителей Шнайдера (около 30 л) на центр 50-мм газопроницаемого блюда культуры.
2. Используйте предварительно увлажненный пастерный пипетку, чтобы перенести подготовленные яички в каплю на газопроницаемом блюде. Яички, как правило, плавают на поверхность капли.
3. Используйте инструмент скальпеля, чтобы аккуратно нажать яички вниз на газпроницаемой мембраны. Позаботьтесь о разрыве газопроницаемой мембраны острой точкой скальпеля. Нажмите все яички в центр капли.
4. Используйте 1 мл шприца, наполненного галоуглеродным маслом, чтобы сделать четыре капли масла, около 30 л каждая, на газпроницаемой мембране. Пространство капли масла вокруг капли средств массовой информации, содержащей яички, чтобы соответствовать четырем углам 22 мм стекла крышкой.
5. Выровняй углы 22-мм стеклянного покрывала с четырьмя каплями галоуглеродного масла и аккуратно опустите крышку на носители и масло. Разрешить coverslip урегулировать и для средств, содержащих яички распространяться между каплями масла.
6. Удалите избыток носителя, чтобы крышка оседална на поверхности яичек. При наблюдении яичек под рассекающим микроскопом, вставьте угол деликатной задачи протрите в средствах массовой информации под крышкой, чтобы фитиль от небольшого количества жидкости. Wick прочь достаточно средств массовой информации, пока стекло coverslip просто вступает в контакт с поверхностью крупнейших яичек. Очень важно не удалить слишком много носителей и снизить coverslip слишком далеко, так как это будет оказывать давление на яички и привести их к разрыву (см. Рисунок 5).

4. Live Изображения меиотических сперматоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Сперматоциты могут быть изображены с помощью лазерного сканирования или спиннинг диска конфокальный микроскоп. Система должна иметь достаточную скорость и чувствительность, чтобы избежать фотоотбеления флуоресцентных белков или фотоповреждения тканей.

1. Поместите каплю масла погружения на стеклянный покрывало чуть выше яичек. Переверните блюдо и поместите его на стадии микроскопа и переместить микроскоп цели (40x или 60x) в масло, пока он не чуть ниже яичек. Используйте передаваемый свет, чтобы найти один яичко и привести его в фокус.
2. Во время захвата быстрых изображений с конфокал, переместить яички вокруг, чтобы изучить организацию клеток. Один конец яичка будет иметь много маленьких, плотно упакованных ячеек. Этот конец содержит зародышевые стволовые клетки и сперматого. Двигаясь к другому концу органа, выявляя все более крупные клетки, организованные в дискретные кластеры или кисты. Эти крупные клетки являются сперматоцитами(Рисунок 3A).
3. При визуализации GFP-тубулин, определить сперматоцитов, которые начнутся мейоз в течение 30-60 минут при наличии двух ярких микротрубочных астр (т.е. центросомы), расположенных в коре головного мозга клетки(Рисунок 3B, C).
4. После того, как киста мейотических сперматозитов была определена, создать параметры приобретения для захвата z-стеки изображений с течением времени. Как правило, приобретение 15-20 изображений, расположенных на 1,5 мкм друг от друга в z-измерении, достаточно, чтобы захватить полный объем нескольких сперматозитов в пределах одной кисты.
5. Приобретайте полный z-стеки каждые 2 мин, если изображение всего первого мейотического деления, которое занимает около 1,5 часов. Можно использовать более быстрые темпы приобретения, особенно если только конкретное событие мейоза, чтобы быть проанализированы. Тем не менее, позаботьтесь, чтобы не вызвать фотоотбеление или фотоповреждения из-за повторного воздействия образца на лазерное возбуждение.
6. Используйте непрерывную автоматическую систему управления фокусировкой, чтобы предотвратить фокусный дрейф в течение длительного времени приобретения. Контроль температуры образца на стадии микроскопа, как правило, не является необходимым, предполагая, комнатная температура примерно 22-23 градусов по Цельсию. Если контроль температуры доступен, поддерживайте образец при температуре на стадии микроскопа на уровне 25 градусов по Цельсию.
7. Если мейотические сперматозиты не найдены, храните образец в течение нескольких часов или на ночь в инкубаторе 25 градусов по Цельсию и изображение снова.

5. Фиксация и иммуностоидинг

1. От шага 2.10 выше, используйте стеклянный пипетка Pasteur для переноса яичек в скважину в 9-словесной стеклянной рассекающей тарелке, содержащей 0,5 мл 8% параформальдегида PBSTx (фосфат буферный сосуд с 0,3% Triton X-100). Убедитесь, что яички лежат на дне тарелки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параформальдегид является токсичным и должны быть обработаны с перчатками в дым капот.
2. Исправьте яички в течение 20 минут при комнатной температуре.
3. Перенесите яички в колодец, содержащий 0,5 мл PBSTx. Вымойте в течение 5 минут с нежным возбуждением. Повторите шаг мытья в новых скважинах со свежим PBSTx еще два раза.
4. Разбавить первичные антитела до желаемой концентрации в 0,5 мл PBSTx, содержащий 5% бычьего сывороточная альбумин (BSA) в 1,5 мл микроцентрифуговой трубки. Перенесите яички из 9-колодца, рассекающего блюдо, в трубку разбавленных первичных антител и инкубация на ночь при 4 градусах Цельсия с нежным раскачиванием или орехами.
5. Вымойте яички в 0,5 мл PBSTx в течение 5 минут в колодце 9-колодец рассекающей блюдо. Повторите шаг мытья со свежим PBSTx еще два раза.
6. Разбавить вторичные антитела в 250 Л PBSTx, содержащих 5% BSA и обойтись в чистый колодец 9-колодец рассекающей блюдо. При желании добавьте DAPI, чтобы запятнать ДНК. Перенесите яички в колодец, содержащее вторичные антитела, накройте полиэтиленовой пленкой и инкубируют в темноте нежным возбуждением в течение 4 часов при комнатной температуре.
7. Перенесите яички в чистый колодец, заполненный 0,5 мл PBSTx. Промойте свежим PBSTx дважды в течение 5 мин и в третий раз за 30 мин.

6. Монтаж фиксированных яичек

1. Перенесите яички из последней стирки на слайд стеклянной микроскопии с помощью пипетки Pasteur. При необходимости используйте край скальпеля, чтобы подтолкнуть яички вниз на поверхность слайда.
2. Используйте угол деликатной задачи протрите фитиль от лишнего жидкости из яичек. Удалите как можно больше жидкости.
3. Нанесите на яички 30-50 л микроскопии.
4. Поместите 22 мм coverslip на падение монтажа среды и позволяют coverslip урегулировать и монтаж среды распространяться под крышкой. При необходимости нанесите мягкое давление на крышку, чтобы выжать излишки монтажной среды и дать крышке отдохнуть на поверхности яичек.
5. Используйте лак для ногтей, чтобы запечатать края крышки.

Результаты

Когда этот протокол будет успешно выполнен, яички останутся полностью нетронутыми для визуализации с помощью конфокальной микроскопии или других методов флуоресценции микроскопии. Как видно на рисунке 3A, клеточная организация яичек сохраняется, и прогрессирование кл...

Обсуждение

Мы описали протокол для подготовки личинок или ранних яичек pupal Drosophila, оптимизированный для долгосрочной, живой визуализации деления клеток сперматоцитов. Это мощный метод анализа деления клеток в физиологическом контексте нетронутой ткани. Сила этого метода еще больше расширяе?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22 mm x 22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium