In Vitro и In Vivo Доставка гипертермии магнитных наночастиц с использованием специальной системы доставки

Резюме

Этот протокол представляет методы и методологию, необходимые для точной доставки гипертермии магнитных наночастиц с использованием сложной системы доставки и мониторинга.

Аннотация

Гипертермия уже давно используется при лечении рака. Методы варьировались от внутриопухолевой вставки горячих железных стержней до системно доставляемых магнитных наночастиц, нацеленных на антитела, при температурах от 39 ° C (уровень лихорадки) до 1000 ° C (электрокоагуляция) и времени лечения от секунд до часов. Температурно-временная зависимость (тепловая доза) диктует эффект с высокими тепловыми дозами, приводящими к абляции тканей и более низким тепловым дозам, приводящим к сублетальным эффектам, таким как увеличение кровотока, накопление лекарств и иммунная стимуляция. Одним из наиболее перспективных современных медицинских методов лечения является гипертермия магнитных наночастиц (mNPH). Этот метод включает в себя активацию магнитных наночастиц, которые могут быть доставлены системно или внутриопухолево, с неинвазивным, нетоксичным переменным магнитным полем. Размер, конструкция и ассоциация магнитных наночастиц, а также частота и напряженность поля магнитного поля являются основными детерминантами нагрева. Мы разработали сложные приборы и методы для доставки воспроизводимой гипертермии магнитных наночастиц в больших и малых животных моделях и культивируемых клетках. Этот подход, использующий непрерывный мониторинг температуры в режиме реального времени в нескольких местах, позволяет доставлять четко определенные тепловые дозы в ткань-мишень (опухоль) или клетки, ограничивая при этом нагрев нецелевой ткани. Точный контроль и мониторинг температуры на нескольких участках и использование стандартного алгоритма (кумулятивный эквивалент минут при 43 °C / CEM43) позволяет точно определять и количественно оценивать тепловую дозу. Наша система, которая допускает широкий спектр температур, тепловых доз и биологических эффектов, была разработана путем сочетания коммерческих приобретений и собственных инженерных и биологических разработок. Эта система была оптимизирована таким образом, чтобы обеспечить быстрое преобразование между методами ex vivo, in vitro и in vivo. Целью этого протокола является демонстрация того, как проектировать, разрабатывать и внедрять эффективную технику и систему для обеспечения воспроизводимой и точной гипертермии магнитной наночастицы (mNP).

Введение

Гипертермия исторически использовалась в терапии рака, либо отдельно, либо в сочетании с другими методами лечения. Хотя он имеет долгую историю использования, наиболее выгодный метод доставки этого лечения все еще обсуждается и зависит от места и местоположения заболевания. Методы доставки гипертермии включают микроволновые, радиочастотные, сфокусированные ультразвуковые, лазерные и металлические наночастицы (такие как золото или оксид железа)1,2,3,4. Эти методы доставки могут привести к диапазону температур лечения от уровня лихорадки до сотен градусов С. Биологический эффект гипертермии зависит, прежде всего, от применяемых температур и длительности лечения⁵. Для этой рукописи мы фокусируемся на гипертермии магнитных наночастиц (mNPH). Этот метод позволяет фокусировать, локализовать, хорошо контролировать и контролировать изменения температуры, используя нетоксичные, одобренные FDA наночастицы оксида железа.

Одной из ловушек других модальностей гипертермии является отсутствие точного клеточного таргетинга; Гипертермия не имеет по своей сути высокого терапевтического соотношения, поэтому необходима тщательная термометрия и таргетирование⁶. mNPH позволяет системную или внутриопухолевую инъекцию mNP, при этом тепло генерируется только там, где находятся mNP, тем самым нацеливая лечение непосредственно на опухоль. mNPH может быть эффективным, когда магнитные наночастицы расположены внутри или снаружи клетки. Для терапии рака общий обзор mNPH заключается в том, что магнитные наночастицы вводятся (внутриопухолево или внутривенно), затем применяется переменное магнитное поле, заставляя магнитные полюса наночастиц постоянно выравниваться, что приводит к локализованному нагреву клеток и^тканей, связанных с наночастицами ^7,8 . Регулируя объем наночастиц и частоту/силу переменного магнитного поля (AMF), можно тщательно контролировать температуру, генерируемую внутри ткани.

Это лечение хорошо работает при опухолях, которые находятся вблизи поверхности тела, так как более глубокие опухоли требуют более сильного AMF, поэтому риск вихретокового нагрева увеличивается^{на 9}. Имеются данные о том, что гипертермия используется клинически в качестве монотерапии, однако часто гипертермия сочетается с лучевой терапией или химиотерапией, что приводит к более целенаправленному противораковому эффекту 10,11,12. Клинические доказательства гипертермии, работающей в сочетании с лучевой терапией, рассматриваются в предыдущей публикации¹³. Наша лаборатория успешно лечила различных животных, от мышей до свиней и спонтанного рака собак, используя метод mNPH 12,14,15. Этот протокол предназначен для тех, кто заинтересован в исследовании эффектов лечения локализованной гипертермии, либо отдельно, либо в сочетании с другими методами лечения.

Одним из наиболее важных факторов гипертермии является возможность измерения и понимания в режиме реального времени тепловой дозы, доставляемой в ткань мишени / опухоли. Стандартным способом расчета и сравнения дозы является демонстрация кумулятивного эквивалента минут нагрева при 43 °C; данный алгоритм позволяет сравнивать дозы независимо от системы доставки, максимальную и минимальную температуры (в пределах определенного диапазона) и параметры нагрева/охлаждения ^5,16. Расчет CEM лучше всего подходит для температур от 39 до 57 °C⁵. Например, в некоторых исследованиях, которые мы проводили, мы выбрали тепловую дозу CEM43 30 (т.е. 30 мин при 43 °C). Выбор этой дозы позволил посмотреть на безопасный, эффективный, иммуногенетический эффект in vitro, как отдельно, так и в сочетании с однократной дозой облучения¹⁷.

При гипертермии магнитных наночастиц существует несколько факторов, которые необходимо учитывать при построении соответствующей системы доставки. Конструкция контрольно-измерительных приборов включает в себя важные факторы безопасности, такие как использование чиллера для обеспечения того, чтобы оборудование для доставки магнитного поля оставалось прохладным даже при работе на высокой мощности, и отказоустойчивые процедуры, которые предотвращают включение системы, если все системы оценки температуры, мощности и управления не были активированы. Кроме того, существуют важные биологические факторы, которые необходимо учитывать как для ситуаций in vivo, так и in vitro. При использовании культивируемых клеток необходимо обрабатывать в питательных средах и поддерживать постоянную жизнеспособную температуру, чтобы избежать физиологических изменений, которые могут повлиять на результаты. Для отдельных типов наночастиц важно знать удельную скорость поглощения (SAR) при расчете параметров нагрева на основе AMF. Точно так же важно знать концентрацию mNP/Fe в клетках и тканях, которая необходима для достижения желаемого нагрева. Методы in vivo требуют еще большего внимания к деталям, так как животное должно поддерживаться под наркозом во время лечения, а температура тела животного поддерживалась на нормальном уровне на протяжении всего лечения. Снижение температуры тела животного, как это происходит под наркозом, может повлиять на общие результаты в отношении тепловой дозы обрабатываемой ткани.

В этой рукописи мы обсуждаем методы, используемые для проектирования и построения универсальной системы гипертермии магнитных наночастиц, а также важные факторы использования, которые необходимо учитывать. Описанная система обеспечивает надежную, последовательную, биологически приемлемую, безопасную и хорошо контролируемую доставку гипертермии магнитных наночастиц. Наконец, следует отметить, что исследования mNPH, которые мы проводим, часто включают другие методы лечения, такие как лучевая, химиотерапия и иммунотерапия. Чтобы эти результаты были значимыми, важно определить, как доставляемое тепло может повлиять на эффективность и / или токсичность для безопасности других модальностей (или наоборот) и благополучие животного. По этой причине и в дозиметрических и терапевтических ситуациях, упомянутых ранее, важно уделять строгое внимание точности дозирования магнитной наночастицы гипертермии и непрерывным измерениям температуры ядра и цели. Целью этого протокола является предоставление простого, последовательного метода и описания для доставки безопасной и эффективной гипертермии магнитных наночастиц.

протокол

Программа по уходу и использованию животных Дартмутского колледжа аккредитована Американской ассоциацией по аккредитации ухода за лабораторными животными (iAAALAC) и придерживается всех руководящих принципов и правил UDSA и NIH (Управление по благополучию лабораторных животных). Все исследования in vivo были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Дартмутского колледжа (IACUC). Процедура эвтаназии придерживается Руководящих принципов AVMA 2020 года для эвтаназии животных.

1. Контрольно-измерительные приборы/проектирование системы

1. Проектируйте пользовательскую антенну AMF (катушку), чтобы она представляла собой замкнутый контур, выбирая формы для создания желаемого магнитного поля. Используйте формулы индуктивности и характеристики из выбора генератора мощности для проектирования совместимых катушек для создания желаемого поля. Используйте различные конструкции для экспериментов in vitro и in vivo.
2. Убедитесь, что индуктивность антенны AMF находится в допустимом диапазоне электрогенератора. Добавьте или вычтите конденсаторы, чтобы сопоставить (настроить) антенну с электрогенератором.
3. Для экспериментов in vitro спроектируйте 14-виточную спиральную катушку, внутренний диаметр 2 см и длину 14 см, которая может содержать трубки объемом 1,5 мл, что позволяет обрабатывать несколько образцов одновременно. Изолируйте катушку виниловым полимером и используйте полистирольную прокладку для отделения катушки от труб. Подробная информация о спецификации и соображениях по проектированию представлена в Дополнительном файле 1.
4. Для экспериментов in vivo приобретите изготовленную на заказ винтовую катушку для всего тела от производителя с запатентованной информацией о конструкции. Используйте 8 мм квадратные трубки (так как они создают более равномерное поле в отверстии катушки) и концентратор в целевой зоне обработки. Сделайте концентратор длиной 5,0 см, в общей сложности 5 витков, что приведет к внутреннему диаметру 3,6 см, внешнему диаметру 5,2 см и расположите его в целевой зоне обработки. Окружите катушку поликарбонатной оболочкой.
5. Используйте в качестве источника питания генератор AMF с регулируемой мощностью и частотой, рассчитанный на 10 кВт или более. Индуктивность соответствует источнику питания и антеннам/катушкам в диапазоне от 0,62 до 1,18 мкГн (мкГн), что позволяет использовать частоты в диапазоне от 30 до 300 кГц. Охладите генератор с помощью оборотной воды с помощью центробежного наддувного насоса, давление которого регулируется до 50 фунтов на квадратный дюйм.
6. Охладите катушки с помощью 5,6-тонного охлаждающего чиллера, который перекачивает 25% теплоносителя на основе этиленгликоля, разбавленную водой через антенну AMF. Установите температуру чиллера таким образом, чтобы антенна не нагревала и не охлаждала образец.
7. Для содержания животных сконструируйте трубчатый держатель, который может быть подвешен в центре катушки с воздушным зазором 0,5 см между держателем и поверхностью катушки. Подключите регулируемый кондиционированный воздушный насос, который циркулирует воздух через оболочку вокруг катушки, и установите его для поддержания нормальной температуры ядра животного. Подключите анестезиологический аппарат к трубчатому держателю животного рядом с головой животного, чтобы обеспечить надлежащую доставку анестезии.
8. Для удержания клеток создайте устройство, которое циркулирует воду с водяной бани через распорку, где размещены трубки. Установите температуру этой водяной бани так, чтобы трубы были окружены водой при 37 °C.
9. Используйте волоконно-оптические зонды для мониторинга температуры в опухоли, сердцевине животного и окружающей среде животного или для исследований in vitro, контролируя температуру клеточной гранулы и воды, окружающей трубки.
10. Используйте магнитные наночастицы оксида железа размером 100 нм для всех экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация и удельная скорость поглощения (SAR) являются двумя характеристиками, которые необходимо учитывать при выборе наночастиц, поскольку они непосредственно влияют на возможный нагрев и тепловую дозу¹⁸.

2. Гипертермия in vitro

1. Культивирование клеток мышиной меланомы B16F10 в среде RPMI с 10% FBS и 1% Pen/strep. Плита 150 000 ячеек/скважина в 6-луночных плитах, с 2 мл полной среды.
2. Определить соответствующее лечение для каждой лунки, т.е. клеток без мНП и без АМФ, клеток с мНП и без АМФ, клеток без мНП и АМФ, клеток с мНП и АМФ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, убедитесь, что существуют соответствующие средства контроля при сочетании гипертермии с другой терапией. AMF выполняется в стандартной исследовательской стендовой лаборатории, оснащенной необходимыми возможностями питания и охлаждения.
3. Через 24 ч после нанесения покрытия добавить мНП в соответствующие скважины, как это было определено на предыдущем этапе. Добавьте мНП до концентрации 3 мг железа/мл. Обеспечьте распределение мНП по всей скважине либо путем создания стоковой среды/раствора mNP (удаление старых носителей, добавление этого решения), либо путем добавления mNP непосредственно и мягко закручивающихся пластин для однородного распределения.
4. Начинают обработку через 48 ч после добавления мНП, когда скважины на 80% сливаются, путем удаления среды и промывки скважин свежими средами. Удалите носитель.
5. Добавьте 0,5 мл трипсина к каждой пролеченной болезни и осторожно закрутите. Используйте микроскоп, чтобы проверить, что клетки отсоединены.
6. Добавьте 1 мл среды в каждую лунку, чтобы собрать клетки в трубки по 1,5 мл. Соберите все клетки из колодца (~1 х 10⁶ клеток). Используйте четко обозначенную отдельную трубку для каждой скважины.
7. Отжимают трубки по 60 х г в течение 2-3 мин, чтобы ячейки гранулировались. Сохраните гранулу в среде.
8. Поместите трубки в распорку, полную воды внутри катушки. Установите температуру водяной бани таким образом, чтобы среда и гранула ячейки поддерживались при 37 °C. Контролируйте температуру внутри трубки и водяной бани с помощью отдельных волоконно-оптических датчиков температуры.
9. Включите чиллер, проверьте, что охлаждающая жидкость течет через катушку. Включите источник питания и отрегулируйте процент максимума в соответствии с требуемым полем. Управляйте 14-оборотной электромагнитной катушкой, работающей от генератора мощностью 10 кВт, на частоте 165 кГц и 23,87 кА/м (300 Oe).
10. Поместите отдельный волоконно-оптический датчик температуры в одну из трубок. Обрабатывают клетки до тех пор, пока не будет установлена заранее определенная протоколом тепловая доза. Примером может служить 30 мин при 43 °C (CEM43 из 30).
11. Повторное суспендирование клеток в среде, которая находится в их трубках, и повторное покрытие в новые 6 пластин скважин. Четко обозначьте новые пластины. Цель состоит в том, чтобы повторно покрыть все собранные клетки (~ 1 х 10⁶ клеток).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Новые 6 луночных пластин должны быть использованы для обеспечения того, чтобы культивируемые клетки получали обработку. Если старые пластины используются, на пластинах все еще могут оставаться клетки, которые не были успешно трипсинизированы.
12. При необходимости для следующей экспериментальной процедуры лизируйте клетки для анализа экспрессии РНК или белка.

3. Гипертермия in vivo

1. Клеточная культура и инокуляция
   1. Культивирование клеток мышиной меланомы B16F10 в среде RPMI с 10% FBS и 1% Pen/strep. Используйте тарелки/тарелки, которые обеспечат достаточное количество клеток для прививки нужного количества животных. Например, тарелки толщиной 10 100 мм, покрытые 100 000 клеток, будут сливаться с достаточным количеством клеток для инъекций 20 мышей в течение 48 ч.
   2. Трипсинизируют клетки и собирают с помощью чистых сред RPMI (без FBS или пера / стрептококка).
   3. Подсчитайте клетки и создайте раствор для нужной концентрации клеток, исходя из объема прививки и номеров мышей.
   4. Обезболивайте 6-недельную самку мышей C57Bl/6, используя испаренный изофлуран и кислород. Поместите животных в коробку из плексигласа с 5% изофлурана и 95% кислорода до индуцирования. После индуцирования удалите животное и используйте лицевой конус с 2% изофлурана для выполнения этапов 3.1.5-3.1.7 и 3.3.3-3.3.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для анестезии во время лечения используйте встроенное обезболивающее средство. Следуйте стандартным институциональным протоколам для мышиной анестезии. Перед экспериментами на животных обеспечьте соответствующее одобрение IACUC. После анестезии верните животное в клетку и следите за выздоровлением, чтобы убедиться в отсутствии осложнений.
   5. Проверьте отсутствие реакции на корректирующие рефлексы.
   6. Побрейте правый фланг с помощью электробритвы.
   7. Очистите область инъекции спиртовой салфеткой. Вводят 1-2 х 10⁶ клеток, используя стеклянный шприц 100 мкл с иглой 28 Г, диспергированной в 50 мкл среды внутрикожно на бритой правой стороне анестезированного.
2. Рост опухоли/инъекция наночастиц
   1. Измерьте опухоли в 3 измерениях с помощью суппортов (длина, ширина и глубина) и рассчитайте объемы по (длина х ширина х глубина х π)/6.
   2. Когда объемы опухоли достигнут 120^мм3 (+/- 20^мм3), поместите животных на исследование. Разработайте исследование, обеспечив наличие соответствующих контрольных и лечебных групп, включая когорты комбинированной терапии (т. Е. Контроль, мНПЗ, радиацию и комбинацию).
   3. Обезболивание мышей, которые будут получать mNP, как описано в 3.1.4.
   4. Очистите область спиртовой салфеткой. Вводят mNP в опухоль за 3 ч до лечения AMF. Вводят таким объемом, чтобы доза составляла 7,5 мг железа/^см3 опухоли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неопубликованные данные лаборатории свидетельствуют о том, что максимальное поглощение mNP происходит через 3-6 ч.
3. Лечение АМФ
   1. Обезболить мышь и поместить на грелку для поддержания температуры ядра.
   2. Проверьте отсутствие реакции на корректирующие рефлексы. Снимите ушную бирку или любые другие металлические предметы на мыши.
   3. Осторожно поместите смазанный волоконно-оптический температурный зонд в прямую кишку мыши.
   4. Поместите катетер в опухоль, удалив иглу. Обрежьте катетер так, чтобы он не высовывался из опухоли слишком сильно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Волоконно-оптические температурные катетеры помещаются и удаляются, пока мыши находятся под общим наркозом, т.е. катетеры находятся на месте только во время процедуры нагрева опухоли. Мышам дают одну подкожную дозу препарата для обезболивания НПВП, кетопрофена (5 мг / кг), во время процедуры. Мы не наблюдали краткосрочного или долгосрочного дискомфорта или заболеваемости, связанных с установкой катетеров.
   5. Вставьте в катетер волоконно-оптический температурный зонд с 3 датчиками. Катетер защищает волоконно-оптические датчики температурного зонда.
   6. Прикрепите ректальный и внутриопухолевый зонд к хвосту животного, чтобы они оставались на месте.
   7. Поместите мышь в трубку объемом 50 мл, головой вниз. Трубка должна иметь отверстие возле головки, куда будет соединяться и доставляться анестезия.
   8. Поместите трубку в установленную катушку и снова подключите анестезию.
   9. Поместите волоконно-оптический температурный зонд в трубку, чтобы измерить температуру окружающей среды.
   10. Включите чиллер и убедитесь, что охлаждающая жидкость циркулирует.
   11. Проверьте и убедитесь, что компьютерное программное обеспечение отображает различные температуры, и начните запись, чтобы расчет CEM43 отображался в режиме реального времени. Требуемая доза CEM43 – это ранее определенная доза.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем включить магнит, убедитесь, что к животному не прикреплены металлические предметы, так как они будут быстро нагреваться. Кроме того, убедитесь, что у всех в комнате нет кардиостимулятора, и для них безопасно находиться там.
   12. Включите магнит при низком проценте мощности.
   13. Убедитесь, что волоконно-оптические датчики температуры регистрируют изменения температуры. Температура будет увеличиваться после активации AMF по мере увеличения поля. Убедитесь, что температура ядра животного остается на уровне 38 °C. Регулируйте температуру ядра с помощью кондиционированной воздушной рубашки.
   14. Отрегулируйте напряженность магнитного поля, изменив мощность на генераторе, используя встроенный контрольный диск, который в свою очередь контролирует уровень температуры в опухоли.
   15. Отключение AMF после того, как желаемая доза, как ранее определено пользователем (например, CEM43 40), достигается внутри опухоли.
   16. Как только AMF будет выключен, извлеките трубку из катушки.
   17. Извлеките мышь из трубки, извлекая различные зонды и катетер. При необходимости пометьте животное новой металлической ушной биркой.
   18. Как только обработка будет завершена, выключите чиллер.
   19. Выздоравливайте животных после анестезии, гарантируя отсутствие осложнений. Следите за их поведением, чтобы обеспечить возвращение к нормальной жизни.

Результаты

Исследования in vitro
Клетки будут достигать и поддерживать желаемую температуру и тепловую дозу только в том случае, если количество и концентрация магнитных наночастиц /железа и AMF соответствующим образом совпадают. При использовании магнитных наночастиц для нагрева клеток i...

Обсуждение

Проектирование и реализация данной системы обеспечивает возможность проведения точных и воспроизводимых in vitro и in vivo экспериментов по гипертермии магнитных наночастиц. Крайне важно, чтобы система была спроектирована таким образом, чтобы частота AMF и напряженность поля адекватно соот?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
.25% Trypsin	Corning	45000-664	available from many companies
1.5 mL tubes	Eppendorf	Eppendorf 22363204	available from many companies
B16F10 murine melanoma cells	American Type Culture Collection	CRL-6475
C57/Bl6 mice	Charles river	027C57BL/6	6-week-old female mice
Chiller	Thermal Care	NQ 5 series	chiller that cools the coil
Coolant fluid	Dow Chemical Company	Dowtherm SR-1	antenna cooling fluid
Fetal Bovine serum	Hyclone	SH30071	available from many companies
fiber optic probes, software and chassis	FISO		FISO evolution software used to read the temperatures
IR camera	Flir		infrared camera to monitor unintentional heating
iron oxide nanoparticles	micromod Partikeltechnologie GmbH	Bionized NanoFerrite	dextran coated iron oxide nanoparticles
mouse coil, solenoid	Fluxtrol	custom built
penicillin/streptomycin	Corning	45000-652	available from many companies
RF generator	Huttinger	TIG 10/300	power source
RPMI media	Corning	45000-396	available from many companies