Хроматографическая дактилоскопия путем сопоставления шаблонов для данных, собранных с помощью комплексной двумерной газовой хроматографии

Резюме

Этот протокол представляет собой подход к отпечаткам пальцев и исследованию многомерных данных, собранных с помощью комплексной двумерной газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Специальные алгоритмы распознавания образов (сопоставление шаблонов) применяются для изучения химической информации, зашифрованной в летучей фракции оливкового масла экстра-класса (т.е. волатиломе).

Аннотация

Обработка и оценка данных являются критическими этапами комплексной двумерной газовой хроматографии (GCxGC), особенно в сочетании с масс-спектрометрией. Богатая информация, зашифрованная в данных, может быть очень ценной, но труднодоступной для эффективного доступа. Плотность и сложность данных могут привести к длительному времени разработки и потребовать трудоемких, зависящих от аналитиков процедур. Таким образом, эффективные, но доступные инструменты обработки данных являются ключом к распространению и принятию этого передового многомерного метода в лабораториях для ежедневного использования. Протокол анализа данных, представленный в этой работе, использует хроматографическую дактилоскопию и сопоставление шаблонов для достижения цели высокоавтоматизированной деконструкции сложных двумерных хроматограмм в отдельные химические признаки для расширенного распознавания информативных паттернов в отдельных хроматограммах и в наборах хроматограмм. Протокол обеспечивает высокую согласованность и надежность при незначительном вмешательстве. В то же время аналитический надзор возможен в различных условиях и функциях ограничений, которые могут быть настроены для обеспечения гибкости и способности адаптироваться к различным потребностям и целям. Здесь показано, что сопоставление шаблонов является мощным подходом к исследованию оливкового масла экстра-вирджин. Перекрестное выравнивание пиков выполняется не только для известных мишеней, но и для нецелевых соединений, что значительно увеличивает характеризацию мощности для широкого спектра применений. Приведены примеры, подтверждающие эффективность классификации и сравнения хроматографических паттернов из выборочных наборов, проанализированных в аналогичных условиях.

Введение

Комплексная двумерная газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрическим детектированием времени пролета (GC×GC-TOF MS) на сегодняшний день является наиболее информативным аналитическим подходом для химической характеристики сложных образцов^1,2,3,4,5. В GC×GC колонны последовательно соединяются и сопряжены модулятором (например, термо- или клапанным фокусировальным интерфейсом), который улавливает элюющие компоненты из колонны первого измерения⁽¹D) перед их повторным впрыском в столбец второго измерения⁽²D). Эта операция выполняется в течение фиксированного периода времени модуляции(P_M),обычно в диапазоне от 0,5 до 8 с. С помощью тепловой модуляции процесс включает крио-улавливание и фокусировку элюируемой полосы с некоторыми преимуществами для общей мощности разделения.

Хотя GC×GC является методом двумерного разделения, процесс создает последовательные значения данных. Детекторный аналого-цифровой (A/D) преобразователь получает выход хроматографического сигнала на определенной частоте. Затем данные хранятся в определенных проприетарных форматах, которые содержат не только оцифрованные данные, но и связанные метаданные (информацию о данных). Аналого-цифровой преобразователь, используемый в системах GC×GC, помогает отображать интенсивность хроматографического сигнала в цифровом числе (DN) в качестве функции времени в двух аналитических измерениях. Одноканальные детекторы (например, пламенно-ионизационный детектор (FID), детектор захвата электронов (ECD), детектор хемилюминесценции серы (SCD) и т. Д.) Производят одиночные значения за время отбора проб, тогда как многоканальные детекторы (например, масс-спектрометрический детектор (MS)) производят несколько значений (как правило, в спектральном диапазоне) за время отбора проб во время аналитического запуска.

Для визуализации ^2-Dданных разработка начинается с растеризации значений данных одного периода модуляции (или цикла) в виде столбца пикселей (элементов изображения, соответствующих событиям детектора). Вдоль ординаты (ось Y, снизу вверх) визуализируется время разделения ²D. Пиксельные столбцы последовательно обрабатываются таким образом, что абсцисса ^(осьX, слева направо) сообщает о времени разделения 1 D. Это упорядочение представляет ^{данные 2}D в правосторонней декартовой системе координат с порядковым номером ^{удержания 1}D в качестве первого индекса в массиве.

Обработка данных ²D хроматограмм дает доступ к более высокому уровню информации, чем необработанные данные, что позволяет обнаруживать ^{пики 2}D, идентифицировать пики, извлекать данные ответа для количественного анализа и перекрестного сравнительного анализа.

Пиковые паттерны ²D можно рассматривать как уникальный отпечаток образца, а обнаруженные соединения — как мелочные признаки для эффективного перекрестного сравнительного анализа. Этот подход, известный как шаблонная дактилоскопия^6,7,был вдохновлен биометрической дактилоскопией^6. Автоматические биометрические системы проверки отпечатков пальцев, по сути, опираются на уникальные характеристики кончиков пальцев: бифуркации и окончания хребтов, локализованные и извлеченные из чернильного оттиска или подробных изображений. Эти характеристики, называемые особенностями minutiae, затем перекрестно сопоставляются с доступными сохраненными шаблонами^8,9.

Как упоминалось выше, каждая схема разделения GC×GC состоит из ²D пиков, рационально распределенных по двумерной плоскости. Каждый пик соответствует одному анализируемым, имеет свой информативный потенциал и может рассматриваться как единый признак для сравнительного анализа паттернов.

Здесь мы представляем эффективный подход к химической дактилоскопии GC×GC-TOF MS с тандемной ионизацией. Цель состоит в том, чтобы всесторонне и количественно каталогизировать признаки из набора хроматограмм.

По сравнению с существующим коммерческим программным обеспечением или встроенными процедурами^{10, 11,}которые используют подход пиковых функций, дактилоскопия на^основе шаблонов характеризуется высокой специфичностью, эффективностью и ограниченным вычислительным временем. Кроме того, он обладает внутренней гибкостью, которая позволяет перекрестно выравливание минутных особенностей (т.е. ^{пиков 2}D) между сильно смещенными хроматограммами, приобретенными различными приборами или в долгосрочных исследованиях^12,13,14.

Основные операции предлагаемого метода кратко описаны, чтобы направить читателя к хорошему пониманию сложности ^2-Dшаблона и информационной мощи. Затем, исследуя матрицу выходных данных прибора, выполняется химическая идентификация и известные целевые аналиты, расположенные над двумерным пространством. Затем шаблон целевых пиков строится и применяется к серии хроматограмм, полученных в рамках одной аналитической партии. Метаданные, связанные со временем удержания, спектральными сигнатурами и ответами (абсолютными и относительными), извлекаются из перевыровненных шаблонов целевых пиков и принимаются для выявления композиционных различий в наборе выборок.

В качестве дополнительного, уникального этапа процесса на предварительно целевых хроматограммах также выполняется комбинированная нецелевая и таргетная (UT) дактилоскопия, чтобы расширить потенциал отпечатков пальцев как на известные, так и на неизвестные аналиты. Процесс создает шаблон UT для действительно всестороннего сравнительного анализа, который может быть в значительной степени автоматизирован.

В качестве заключительного этапа способ выполняет перекрестное выравнивание признаков в двух параллельных сигналах детектора, полученных с высокими и низкими энергиями ионизации электронов (70 и 12 эВ).

Протокол является достаточно гибким в поддержке анализа одной хроматограммы или набора хроматограмм и с переменной хроматографией и / или несколькими детекторами. Здесь протокол демонстрируется с коммерчески доступным пакетом программного обеспечения GC×GC (см. Таблицу материалов),объединенным с библиотекой MS и поисковым программным обеспечением (см. Таблицу материалов). Некоторые из необходимых инструментов доступны в другом программном обеспечении, и подобные инструменты могут быть реализованы независимо от описаний в литературе Рейхенбаха и его коллег^{15,16,17,18,19.} Исходные данные для демонстрации получены из исследования оливкового масла экстра-вирджин (EVO), проведенного в лаборатории авторов^14. В частности, летучая фракция (т.е. волатиломе) итальянских масел EVO отбирается методом твердофазной микроэкстракции (HS-SPME) и анализируется GC×GC-TOF MS для захвата диагностических отпечатков пальцев для качества и сенсорной квалификации образцов. Подробная информация о пробах, условиях отбора проб и аналитической настройке приведена в Таблице материалов.

Шаги 1–6 описывают предварительную обработку хроматограмм. Шаги 7–9 описывают обработку и анализ отдельных хроматограмм. Шаги 10–12 описывают создание и сопоставление шаблонов, которые являются основой для анализа перекрестной выборки. Шаги 13–16 описывают применение протокола к набору хроматограмм, а шаги 14–16 для анализа UT.

протокол

1. Импорт необработанных данных

ПРИМЕЧАНИЕ: При этом создается двумерный растровый массив для визуализации и обработки.

1. Запустите программное обеспечение для образов.
2. Выберите | файлов Импорт; перейдите и выберите файл необработанных данных, полученный системой GC×GC-TOF MS под названием "VIOLIN 101.lsc"(Дополнительный файл 1); затем нажмите кнопку Открыть. Хроматограмма открывается в этом программном обеспечении.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Формат файла необработанных данных зависит от производителя прибора. Программа импортирует различные форматы файлов, перечисленные в руководстве пользователя.
3. В диалоговом окне «Импорт» установите для параметра Период модуляции(P_M) значение 3,5 с; затем нажмите кнопку ОК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые программы для приобретения могут не записывать период модуляции.
4. Выберите | файлов Сохранить изображение как; перейти в нужную папку; введите название "Масло 1 RAW.gci" (Дополнительный файл 2); затем нажмите кнопку Сохранить.

2. Сдвиг фазы модуляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Это помещает все пики в каждом цикле модуляции в один и тот же столбец изображения, включая пики, которые оборачиваются вокруг конца периода модуляции в пустое время следующего периода модуляции^20.

1. Выберите | обработки Фаза сдвига.
2. В диалоговом окне «Фаза сдвига» установите для параметра «Сумма сдвига» значение -0,8 с; затем нажмите кнопку ОК.

3. Базовая коррекция²¹

1. Выберите графический | Нарисуйте прямоугольник.
2. Щелкните и перетащите указатель, чтобы нарисовать прямоугольник на изображении, где пики не обнаружены.
3. Выберите инструменты | Визуализация данных; обратите внимание на среднее и стандартное отклонение сигнала детектора, здесь 21,850 ± 1,455 SD безудельного цифрового номера (DN); затем закройте инструмент.
4. Выберите | обработки Правильная базовая линия.

4. Раскраска хроматографического изображения с помощью карты значений и цветовой карты²⁰

1. Выберите просмотр | Раскрасить.
2. В диалоговом окне «Раскраска» выберите вкладку «Импорт/экспорт»; выбрать #AAAA (Дополнительный файл 3)пользовательской цветовой карты, предоставляемой в качестве дополнительного материала; затем нажмите кнопку Импорт.
3. В элементах управления Сопоставление значений задайте для диапазона значений минимальное и максимальное значения; затем нажмите кнопку ОК.

5. Обнаружение ²D-пиков (т.е. BLOB-объектов) для аналитов¹⁸

1. Выберите | обработки Обнаружение больших двоичных объектов с настройками по умолчанию; затем обратите внимание, что некоторые пики разделены и есть ложные обнаружения.
2. Выберите Настроить | Настройки | Обнаружение больших двоичных объектов; затем установите значение Smoothing на 0,1 для первого измерения и 2,0 для второго измерения и установите минимальный объем (т.е. пороговое значение для суммированных значений) на 1,00 E6; затем нажмите кнопку ОК.
3. Выберите | обработки Обнаружение больших двоичных объектов с новыми настройками; затем наблюдайте за улучшениями.

6. ²D пиковая фильтрация

ПРИМЕЧАНИЕ: Это сделано для автоматического удаления бессмысленных обнаружений из-за кровотечения колонны вдоль ¹D и ударов или хвостов вдоль ²D.

1. Выберите | обработки Интерактивное обнаружение больших двоичных объектов.
2. Обратите внимание на параметры обнаружения больших двоичных объектов; затем нажмите кнопку Обнаружить.
3. В построителе расширенных фильтров нажмите кнопку Добавить; затем в диалоговом окне Новое ограничение выберите Хранение II; затем нажмите кнопку ОК.
4. В ползунках Ограничение задайте минимальное и максимальное время ^{удержания фильтра 2}D, чтобы уменьшить количество ложных пиков без потери истинных пиков.
5. Нажмите Применить; затем нажмите кнопку Да, чтобы сохранить параметры обнаружения с новым фильтром.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для решения конкретных проблем обнаружения, таких как обнаружение ионно-пикового обнаружения или деконволюция для коэлюций^19,могут потребоваться более продвинутые инструменты.

7. Калибровка линейных показателей удержания

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг²² (I^T)для определенного времени удержания в наборе стандартов индекса удержания (RI) (обычно n-алканов).

1. Выберите Настроить | | таблицы RI Индекс удержания (Col I).
2. В диалоговом окне Конфигурация таблицы RI нажмите кнопку Импорт; затем выберите файл калибровки RI (в формате CSV с именем, временем хранения и индексом хранения) с именем «Таблица LRI.csv» – (Дополнительный файл 4).
3. Выберите | файлов Сохранить изображение A. Перейдите в нужную папку; введите название "Масло 1 LRI CALIBRATED.gci" (Дополнительный файл 5); затем нажмите кнопку Сохранить.

8. Поиск пиковых спектров в библиотеке NIST17 MS²³

1. Выберите Настроить | Настройки | Библиотека поиска.
2. В диалоговом окне «Библиотека поиска» установите для параметра «Тип спектра» значение «ПикОВЫЙ MS», для параметра «Порог интенсивности» значение «100», для параметра «Тип поиска NIST» — значение «Простой (сходство), для параметра «Тип столбца NIST RI» — значение «Стандартный полярный» и для параметра «Допуск NIST RI» значение 10; затем нажмите кнопку ОК. NIST MS Search предлагает множество других настроек, которые здесь установлены по умолчанию.
3. Выберите | обработки Библиотека поиска для всех больших двоичных объектов.

9. Просмотр и исправление идентификации анализируемого вещества

1. На инструментальной палитре установите для режима курсора значение BLOB-| Выберите Большие двоичные объекты.
2. В представлении Изображение щелкните правой кнопкой мыши нужный пик.
3. В диалоговом окне Свойства большого двоичного объекта проверьте свойства большого двоичного объекта; затем щелкните Список попаданий.
4. Проверьте список попаданий; затем, если идентификация неверна, установите флажок рядом с правильной идентификацией.
5. В диалоговом окне Свойства большого двоичного объекта введите Имя группы, чтобы обозначить химический класс и любые другие требуемые метаданные; затем нажмите кнопку ОК.
6. Выберите | файлов Сохранить изображение как; перейти в нужную папку; введите название "Масло 1 COLORIZED для шаблона construction.gci" (Дополнительный файл 6); затем нажмите кнопку Сохранить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот файл включен в дополнительный архив, который можно открыть для шага 10.

10. Создайте шаблон с целевыми пиками¹⁵

1. В представлении «Изображение» (все еще в режиме «Выбор больших двоичных объектов» с шага 9.1) выберите нужные пики щелчком по первому пику и CTRL + щелкните по дополнительным пикам.
2. На инструментальной палитре нажмите кнопку Добавить в шаблон.
3. После завершения шаблона выберите Файл | Сохранить шаблон; укажите имя папки и файла; затем нажмите кнопку Сохранить.
4. Выберите | файлов Закрыть изображение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе эти инструкции продолжаются с шаблоном, созданным для включения желаемых целевых пиков, доступных как «Целевой tamplate.bt»(Дополнительный файл 7).

11. Сопоставьте и примените шаблон

ПРИМЕЧАНИЕ: Сопоставление распознает шаблон шаблона в обнаруженных пиках новой хроматограммы. Применение идентификаторов совпадающих наборов и других метаданных в новой хроматограмме из шаблона.

1. Выберите | файлов Открыть изображение; перейдите и выберите файл хроматограммы "Oil 2 COLORIZED.gci"(Дополнительный файл 8)(который предварительно обработан); затем нажмите кнопку Открыть.
2. На инструментальной палитре установите для режима курсора значение Шаблон | Выберите Объекты.
3. Выберите | шаблона Загрузить шаблон.
4. В диалоговом окне Загрузка шаблона нажмите кнопку Обзор; перейти и выбрать шаблон целевых пиков"Целевой template.bt"(Дополнительный файл 7); затем нажмите кнопку Открыть.
5. В диалоговом окне Загрузка шаблона нажмите кнопку Загрузить,а затем Заблокировка.
6. В представлении Изображение щелкните правой кнопкой мыши пик шаблона; затем проверьте свойства его объекта, включая qCLIC и эталонный MS.
7. Выберите | шаблона Интерактивный шаблон сопоставления и преобразования.
8. В интерфейсе интерактивного матча щелкните Сопоставить все; затем просмотрите результаты сопоставления как в таблице, так и на изображении, в котором каждый пик шаблона помечен незаполненными кругами и, если совпадение сделано, есть ссылка на заполненный круг для обнаруженного пика.
9. Редактируйте совпадения по желанию; при этом нажмите кнопку Применить, чтобы перенести метаданные из шаблона в хроматограмму.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ограничения сопоставления, такие как qCLIC, помогают сопоставить правильный паттерн среди обнаруженных пиков новой хроматограммы. Параметры ограничения включают тип сигнатуры MS, используемой в качестве ссылки на шаблон(пиковый MS или BLOB MS),и пороговые значения спектрального сходства (direct Match Factor (DMF) и Reverse Match Factor (RMF)). Здесь параметры устанавливаются на основе предыдущих исследований^13,14 для ограничения ложноотрицательных совпадений: пик MS и DMF и порог подобия RMF 700.

12. Преобразование шаблона для существенно отличающегося хроматографии

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не является необходимым, если только хроматографические условия существенно не изменяются, что приводит к смещению шаблона с новой хроматограммой, как это может иметь место в случае долгосрочных исследований или после установки новой колонки. В таких случаях шаблон может быть геометрически преобразован в хроматографической плоскости времени удержания, чтобы лучше соответствовать новой хроматограмме^12,13. В этом примере пиковые паттерны шаблона и хроматограммы похожи, но отличаются геометрией времени удержания, как это было бы видно для разных хроматографических условий.

1. Повторите шаги 11.2–11.5, за исключением перехода, выбора и загрузки целевого шаблона 2.bt (дополнительный файл 9).
2. Выберите | шаблона Интерактивный шаблон матча; затем нажмите кнопку Изменить преобразование.
3. В интерфейсе Transform Template измените масштабы ¹D и ²D, переводы и сдвиги, чтобы лучше выровнять шаблон с обнаруженными пиками; затем щелкните Преобразовать шаблон.
4. С помощью преобразованного шаблона нажмите кнопку Изменить соответствие; затем повторите шаги 11.8–11.9.

13. Выполнение комбинированного нецелевого и целевого анализа по набору хроматограмм

ПРИМЕЧАНИЕ: Комбинированный нецелевой и целевой (UT) шаблон, также называемый шаблоном признаков ^24,25,при сопоставлении с каждым из набора хроматограмм, устанавливает соответствия между нецелевыми и целевыми аналитами, затем для распознавания образов извлекаются последовательные перекрестные выборочные признаки.

1. Выполните предварительную обработку (шаги 1–6) и сопоставление шаблонов UT (шаги 11.1–11.9) для всех хроматограмм в наборе (т.е. ²D хроматограмм масел). Кроме того, можно автоматизировать этот шаг с помощью программного обеспечения проекта или аналогичного программного обеспечения, не описанного здесь.
2. Запустите программное обеспечение Investigator.
3. Выберите | файлов Открытый анализ; затем выберите и откройте «Feature Jove su 70 eV.gca»(Дополнительный файл 10).
4. Нажмите кнопку ОК, чтобы открыть и просмотреть результаты.
5. Нажмите на вкладку «Соединения», чтобы просмотреть значения метрик и статистику для конкретных аналитов (т. Е. Целевых аналитов с соответствующими химическими названиями) или нецелевые аналиты с идентификаторами (#), выровненными по всем хроматограммам, затем выполните следующие шаги.
   1. Перейдите на вкладку Атрибуты, чтобы просмотреть значения и статистику для конкретных метрик по хроматограммам.
   2. Перейдите на вкладку Сводка, чтобы просмотреть сводную статистику как по соединениям, так и по функциям. Если хроматограммы относятся к разным классам, как в данном случае масла, полученные из оливок, собранных в двух разных регионах Италии, то на вкладке «Сводка» перечислены статистические данные о соотношении Фишера (F и FDR), которые дают представление об особенностях различения между классами.
   3. Просматривайте различные диаграммы на всех вкладках и при необходимости выполняйте анализ главных компонентов (PCA) на вкладке Атрибуты.

14. Изменение шаблона UT для параллельного анализа MS

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ проводили как с 70 эВ, так и с 12 эВ (т.е. высокими и низкими) энергиями ионизации электронов^26,27.

1. Откройте одну из 12 эВ хроматограмм, например, «Масло 1 12 эВ RAW.gci»(Дополнительный файл 11), выполнитепредварительную обработку (шаги 1–6) и загрузите шаблон UT «Шаблон UT 70 relaxed.bt»(Дополнительный файл 12),как описано в шагах 11.1–11.6. Файлы предоставляются в качестве дополнительного материала.
2. При необходимости отрегулируйте шаблон в соответствии с обнаруженными пиками 12 эВ, как описано на шаге 12. Здесь нет существенного перекоса, потому что тандемные сигналы мультиплексированы. Однако следует отметить, что, поскольку различные настройки ионизации приводят к различным фрагментациям, необходимо ослабить ограничения qCLIC на спектральное сходство DMF и RMF (здесь не продемонстрировано).
3. Выберите | файлов Сохранить шаблон; укажите имя папки и файла, например, "UT template 12.bt"(Дополнительный файл 13); затем нажмите кнопку Сохранить.

15. Выполнение комбинированного нецелевого и целевого анализа по 12 эВ хроматограммам

1. Выберите | файлов Открытый анализ; затем выберите и откройте "Feature Jove su 12 eV.gca" - Дополнительный файл файла 14 предоставляется.
2. Нажмите кнопку ОК, чтобы открыть и просмотреть результаты.
3. Нажмите на вкладку «Соединения», чтобы просмотреть значения метрик, обратитесь к ответам 12 эВ и статистике для конкретных аналитов (т. Е. Целевых аналитов с соответствующими химическими названиями) или нецелевые аналиты с (#) идентификаторами, выровненными по всем хроматограммам, а затем выполните шаги ниже.
   1. Перейдите на вкладку Атрибуты, чтобы просмотреть значения и статистику для конкретных метрик по хроматограммам.
   2. Перейдите на вкладку Сводка, чтобы просмотреть сводную статистику как по соединениям, так и по характеристикам при 12 эВ. Если хроматограммы относятся к разным классам, как в данном случае масла, полученные из оливок, собранных в двух разных регионах Италии, то на вкладке «Сводка» перечислены статистические данные о соотношении Фишера (F и FDR), которые дают представление об особенностях различения между классами.
   3. Просмотрите различные диаграммы, доступные на всех вкладках, и при необходимости выполните анализ главных компонентов (PCA) на вкладке Атрибуты.

Результаты

Паттерны GC×GC-TOF MS из высококачественного волатилома оливкового масла первого отжима демонстрируют около 500 пиков ²D выше порога отношения сигнал/шум (SNR), 100. Такой порог был определен предыдущими исследованиями пищевых летучих веществ^14,27 как минимальный относительный сигнал над порогом для получения надежных спектров для перекрестного сравнительного анализа. Компоненты распределены по хроматографическому пространству в соответствии с их относительным удержанием в двух хроматографических измерениях и, в частности, на основе их летучести/полярности в ¹D и летучести в ²D. Здесь комбинация колонн является полярной × полуполярной (т.е. Carbowax 20M × OV1701).

Шаблон ²D показывает высокую степень порядка. Относительные схемы удержания для гомологичных рядов и классов показаны на рисунке 1А с аннотациями (графики для групп и пузырьков для пиков) для линейных насыщенных углеводородов (черный), ненасыщенных углеводородов (желтый), линейных насыщенных альдегидов (синий), мононенасыщенных альдегидов (красный), полиненасыщенных альдегидов (лосось), первичных спиртов (зеленый) и короткоцепочечных жирных кислот (циано).

Обнаруженные ^{пики 2}D затем могут быть идентифицированы путем сравнения среднего спектра MS, извлеченного из всего пика ²D (спектрBLOB) или из наибольшего спектра(спектр вершины). На рисунке 2 показаны выходные данные поиска высшего спектра для BLOB-объекта 5 и возвращается совпадение высокого сходства (первые 10 обращений) для (E)-2-гексенала. Исследуемые базы данных — это базы данных, предварительно выбранные аналитиком на этапе 8 метода.

Идентификация проверяется активным индексированием хранения. Для ^{пиков 2}D было рассчитано экспериментальное значение I^T, так что на этом этапе поиск в библиотеке расставляет приоритеты результатов с когерентными значениями табличного I^T. Окна допусков могут быть настроены на основе опыта аналитиков, надежности значений базы данных в соответствии со стационарной фазой и применяемых аналитических условий. Новые инструменты для интеллектуальной калибровки линейных показателей удержания без экспериментальной калибровки с n-алканами были недавно разработаны и обсуждены в исследовании Reichenbach et al^19.

Коллекция идентифицированных 2 D пиков (т.е. целевых пиков) может ^бытьпринята для построения шаблона целевых пиков для быстрого установления надежных соответствий между тем же соединением во всех образцовых хроматограммах. Коллекция целевых пиков шаблона визуализирована на рисунке 1B. Красные круги соответствуют 196 целевым соединениям, включая два внутренних стандарта (IS), связанных с шаблонными пиками с линиями соединения. IS используются для нормализации отклика, а линии связи помогают визуализировать, какой из включенных IS будет принят для нормализации каждого ²D пикового / blob-ответа.

На рисунке 1Bзаполненные круги указывают на положительные совпадения между пиком шаблона и фактическим шаблоном, в то время как пустые круги предназначены для пиков шаблона, для которых соответствие не было проверено. Ложноотрицательные совпадения могут быть ограничены соответствующим выбором пороговых параметров, эталонных спектров и функций ограничения^13,14,18,19. Для сложных паттернов с множественными соэлюциями рекомендуются функции обнаружения пиков ионов, основанные на спектральной деконволюции, и могут быть допустимым вариантом^19. Метаданные пиков шаблона показаны на увеличенной панели рисунка 1B для (E)-2-hexenal.

Специфика сопоставления шаблонов основывается на возможности применения функций ограничения, ограничивающих положительное соответствие тем пикам-кандидатам, которые, попадая в окно поиска алгоритма, имеют спектральное сходство MS выше определенного порога. При этом на шаге 11 пороги подобия²³ были установлены на уровне 700 согласно предыдущим экспериментам, направленным на определение оптимальных параметров, ограничивающих ложноотрицательные совпадения^14. Выделенные области пиковых свойств шаблона на рисунке 1B показывают информацию об эталонной строке спектра MS и функции ограничения qCLIC (т.е. (Match("

Применяя шаблон ко всем хроматограммам набора, можно столкнуться со сложными ситуациями, как в случае частичного смещения паттернов. Это может быть связано с несоответствиями температуры печи, нестабильностью расхода/давления газа-носителя или с ручным вмешательством в систему, как в случае замены колонны или модулятора петли-капиллярной замены^14,28. На рисунке 3 показана ситуация частичного несоответствия между целевым шаблоном и собственно хроматограммой. Для минимальных перекосов интерактивные преобразования шаблона(рисунок 3,панель управления) могут изменить пики шаблона для лучшего соответствия. После изменения положения шаблон можно сопоставить для установления соответствия. В примере пики шаблона(рисунок 3,шаг 12) правильно совпадают с фактическим ^{шаблоном 2}D. В случае серьезных перекосов, не обсуждаемых здесь, повторение действий match-transform-update может итеративно адаптировать положение пиков шаблона к фактическому пиковой модели^12,13,14.

Здесь целевые пики (т.е. известные аналиты) обеспечивают около 40% хроматографического результата (196 целевых пиков в среднем около 500 обнаруживаемых пиков). Остальные 60% соединений вместе с информацией, которую они приносят, не учитываются при целевом анализе. Чтобы сделать исследование действительно всеобъемлющим, следует также установить последовательное перекрестное выравнивание нецелевых пиков ²D. Первое приложение, в котором сопоставление шаблонов было распространено на все обнаруживаемые аналиты, касалось сложного волатилома обжаренного кофе^7. Этот процесс автоматизирован с помощью программного обеспечения (например, Investigator), показанного здесь на шагах 14–15.

В этом процессе предварительно целевые изображения, принадлежащие исследуемому набору образцов (20 образцов), используются для определения надежных пиков путем перекрестного сопоставления всех шаблонов изображения^29. Впоследствии строится композитная хроматограмма, по которой можно идентифицировать надежные пики и пиковые ^{области UT (т.е. 2}D пики следа) в так называемом шаблоне признаков^17.

Для анализов, полученных при 70 эВ, процесс определил 144 надежных пика с ослабленной^{надежностью, 29,}76 из которых относятся к целевому списку пиков. Основываясь на этих 144 надежных пиках, процесс выравнивает все хроматограммы в соответствии со средним временем удержания надежных пиков, а затем объединяет их для создания составной хроматограммы. На рисунке 4 показан список всех образцов, маркированных в соответствии с регионом добычи нефти (слева) и список надежных пиков/объемов blob в каждом образце (справа).

Шаблон нецелевого объекта состоит из ²D пиков из аналитов, обнаруженных в составной хроматограмме, показанной на рисунке 5A,которые соответствуют шаблону надежных пиков (n = 168 – красные круги для целевых пиков и зеленые круги для нецелевых пиков). Масс-спектры композитных пиков, а также время их удержания регистрируются вшаблоне признаков, как показано для (Z)-3-гексенола ацетата в увеличенной области. Пиковые области показаны на рисунке 5B в виде графики красного цвета; вместо этого они определяются контурами всех ^{пиков 2}D, обнаруженных в составной хроматограмме (n = 3578).

Когда неконтролируемое распознавание образов с помощью анализа главных компонентов применяется к целевому распределению пиков в пределах 20 проанализированных образцов, сицилийские и тосканские масла группируются отдельно, предполагая, что педоклиматические условия и терруар влияют на относительную распространенность летучих веществ. Результаты показаны на рисунке 6A, а результаты PCA из надежного распределения пиков показаны на рисунке 6B. Эти два подхода перекрестно подтверждают, что масла из разных географических районов имеют разные, в то время как когерентные химические сигнатуры, будь то целевые или нецелевые соединения, или и то, и другое, нанесены на карту.

Наконец, программное обеспечение позволяет быстро и эффективно переупостилировать шаблоны по параллельным каналам обнаружения. В этом приложении предлагается повторное выравнивание для тандемных ионизационных сигналов. Источник ионов МС мультиплексирует между двумя энергиями ионизации (т.е. 70 и 12 эВ) с частотой захвата 50 Гц на канал^30. Два результирующих хроматографических паттерна тесно связаны, в то время как спектральные данные (т.е. спектральные сигнатуры и ответы) приносят дополнительную информацию с различными динамическими диапазонами отклика^26,27. Выровненные паттерны позволяют извлекать признаки^{(пики 2}D и пиковые области) с помощью одновыводных идентификаторов (т. Е. Химические названия для целевых пиков и уникальная нумера # для нецелевых пиков и пиковых областей).

Сопоставление шаблонов обеспечивает эффективное перекрестное выравнивание. В этой ситуации нет большого перекоса, но ограничения MS должны быть ослаблены, чтобы позволить совпадения для пиков UT. С другой стороны, избранные пиковые области UT, которые не имеют ограничений MS, быстро сопоставляются без каких-либо ложноотрицательных совпадений. На рисунке 5C показана увеличенная площадь хроматограммы 12 эВ, где сопоставлен шаблон объекта, построенный из данных 70 эВ. Надежные пики UT положительно совпадают из-за пониженных ограничений qCLIC (например, порог DMF на уровне 600). Следует отметить, что при 12 эВ обнаружено меньше пиков из-за ограниченной фрагментации, вызванной низкой энергией ионизации.

Рисунок 1: Бидименсиональный контурный график и целевой шаблон. (A) Контурный график летучей фракции оливкового масла экстра-вирджин из Тосканы. Упорядоченные узоры гомологических рядов и классов выделены различными цветами и линиями: линейные насыщенные углеводороды (черная линия и ^{контуры 2}D), ненасыщенные углеводороды (желтый), линейные насыщенные альдегиды (синий), мононенасыщенные альдегиды (красный), полиненасыщенные альдегиды (лосось), первичные спирты (зеленый) и короткоцепочечные жирные кислоты (циано). (B) Чрезмерно наложенный целевой шаблон известных аналитов (красные круги) с линиями связи, связывающими внутренние стандарты (ИС). Панели показывают метаданные ²D пиковых/BLOB-объектов (Деканал) или пиковые свойства шаблона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Поиск Apex MS. Вывод поиска apex MS для BLOB-объекта 5. Список записей базы данных с наибольшим соответствием по сходству и связанных метаданных, доступных из библиотеки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Перестройка шаблона. Рабочий процесс, иллюстрирующий шаги, позволяющие переуравностить шаблон путем преобразования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Интерфейс GC Investigator. Панель исследователя со всеми выбранными изображениями, помеченными в соответствии с регионом добычи нефти (слева) и списком достоверных пиков/объемов сгустков в каждом образце (справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Целевой и UT шаблон. (A)Надежные пики в результате автоматизированной обработки на этапе 11; красные круги соответствуют известным аналитам, в то время как зеленые круги неизвестны. На наложенной панели свойства объекта шаблона отображаются для (Z)-3-гексенала. (B) Увеличенная область, которая показывает пики UT (красные и зеленые круги) и пиковые области (красная графика) шаблона UT, сопоставленные с образцом масла, полученным при энергии ионизации 70 эВ. (C) Шаблон UT, подобранный на образце масла, полученном при энергии ионизации 12 эВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Участки загрузки PCA. Они показывают естественную конформацию образцов (масел из Тосканы и Сицилии), поскольку они являются результатом(A)целевого распределения пиков или(B)распределения пиков UT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эти файлы.

Обсуждение

Визуализация данных GC×GC-TOF MS является фундаментальным шагом для правильного понимания результатов, достигнутых с помощью комплексных двумерных разделений. Графики изображений с настраиваемой окраской позволяют аналитикам оценить различия в отклике детектора и, следовательно, дифференциальное распределение компонентов образца. Такой визуальный подход полностью меняет взгляд аналитиков на интерпретацию и разработку хроматограмм. Этот первый шаг, однажды понятый и уверенно используемый хроматографами, открывает новую перспективу в дальнейшей обработке.

Другим фундаментальным аспектом обработки данных является доступность полной матрицы данных (т.е. спектральных данных и ответов MS) для всех точек выборки, каждая из которых соответствует одному событию детектора. В этом отношении ²D достигает пика интеграции, так что совокупность событий детектора, соответствующих одному анализируемым данным, представляет собой критический шаг. В текущем протоколе обнаружение ^{пиков 2}D основано на алгоритме¹⁸ водосбора с некоторыми адаптациями, включенными для улучшения чувствительности обнаружения в случае частичного совместного элюирования соединений. Чтобы сделать этот процесс более конкретным, необходимо провести деконволюцию и принять более сложные процедуры. Это возможно путем выполнения обнаружения ионного пика для данных MS; алгоритм обрабатывает массив данных и изолирует отклик от отдельных аналитов на основе спектральных профилей^19,31.

Важный, но критический этап протокола и любого процесса интерпретации данных GC×GC-MS связан с идентификацией аналитов. Эта процедура, предложенная в шагах 8 и 9, при отсутствии подтверждающего анализа с аутентичными стандартами, должна быть тщательно проведена аналитиком. Автоматизированные действия доступны в любом коммерческом программном обеспечении; они включают оценку сходства спектральных сигнатур MS по отношению к собранным эталонным спектрам (т.е. спектральным библиотекам) и оценку соотношений характеристик между ионами квалификатора/квантора. Однако для устранения неоднозначности идентификации изомеров необходимы дополнительные подтверждающие критерии. В протоколе предлагается принять линейные индексы удержания для определения приоритетности списка кандидатов; ограничение здесь относится к доступности данных хранения и их согласованности.

Основной характеристикой, которая делает этот подход уникальным, является сопоставление шаблонов^12,13,15,29. Сопоставление шаблонов позволяет ^{распознавать 2-D}образы очень эффективным, специфическим и интуитивно понятным способом. Он может быть установлен с точки зрения чувствительности и специфичности путем применения настраиваемых пороговых значений и/или функций ограничений, в то время как аналитик может контролировать процедуру, активно взаимодействуя с параметрами функции преобразования. Особенность этого процесса заключается в возможности перекрестного выравнивания целевой и нецелевой информации о пиках между образцами однородной партии, а также между образцами, полученными в одинаковых номинальных условиях, несмотря на средне- и сильное смещение. Преимущества этой операции связаны с возможностью сохранения всех идентификаций целевых аналитов, что является трудоемкой задачей для аналитика, и всех метаданных, сохраненных для целевых и нецелевые пики из предыдущих сессий разработки.

Сопоставление шаблонов также очень эффективно с точки зрения вычислительного времени; Файлы данных MS с низким разрешением состоят примерно из 1–2 Гб упакованных данных, в то время как анализ MS с высоким разрешением может достигать 10–15 Гб за один аналитический запуск. Сопоставление шаблонов не обрабатывает полную матрицу данных каждый раз, но сначала выполняет выравнивание времени хранения между хроматограммами с использованием пиков шаблона, затем обрабатывает пики кандидатов в окне поиска для их соответствия по времени хранения со ссылкой в шаблоне. В случае сильного перекоса, наиболее сложной ситуации, глобальные полиномиальные преобразования второго порядка работали лучше, чем локальные методы, при одновременном сокращении вычислительного^{времени 13}.

Для того, чтобы метод GC×GC широко распространился за пределы научных кругов и исследовательских лабораторий, инструменты обработки данных должны облегчать основные операции по визуализации и проверке хроматограмм; идентификация аналитов должна дать возможность принятия стандартизированных алгоритмов и процедур (например, алгоритм поиска NIST и калибровка I^T); и межскладовой анализ должен быть интуитивно понятным, эффективным и подкрепляться интерактивными инструментами. Предлагаемый подход удовлетворяет эти потребности, предлагая расширенные варианты и инструменты для решения сложных ситуаций, таких как совместное элюирование аналитов, калибровка нескольких аналитов, анализ группового типа и параллельное выравнивание обнаружения.

Справочная литература хорошо охватывает многие возможные сценарии, в которых GC×GC и, в более общем плане, комплексная двумерная хроматография предлагают уникальные решения и надежные результаты, которые не могут быть достигнуты с помощью ¹D-хроматографии в однократном анализе. ^5,32,33 Хотя GC×GC является самым мощным инструментом, который увеличивает способность и чувствительность разделения, всегда существуют ограничения на мощность разделения, чувствительность и другие системные возможности. По мере приближения к этим системным ограничениям анализ данных становится все более сложным. Поэтому исследования и разработки должны продолжать совершенствовать аналитические инструменты, имеющиеся в нашем распоряжении.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min.	Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia	PN 054796	Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min.
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from .	Mega, Legnano, Milan, Italy	PN MEGA-1701
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC	SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy	Project VIOLIN (Ager - Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare)		Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14
Gas chromatograph: Model 7890B GC	Agilent Technologies Wilmington DE, USA
GC Image GC×GC edition V 2.9	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Image processing software	GC Image LLC, Lincoln, Nebraska		https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html
Mass spectrometer: BenchTOF-Select	Markes International Llantrisant, UK
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6)	Merck-Millipore/Supelco	PN: 68982
Modulator controller: Optimode v2.0	SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy
Modulator: KT 2004 loop type	Zoex Corporation Houston, TX, USA
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3	National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD		https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17
n-alkanes C8-C40 for retention indexing	Merck-Millipore/Supelco	PN: 40147-U
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv	Merck-Millipore/Supelco	PN: 100795
Solid Phase Microextraction fiber	Merck-Millipore/Supelco	PN 57914-U
α- /β-thujone (CAS 546-80-5)	Merck-Millipore/Sigma Aldrich	PN: 04314