JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол подробно адаптированный метод для получения, расширения и криопресервного мозга микрососудистых эндотелиальных клеток, полученных путем дифференциации человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, а также для изучения свойств гемового барьера мозга в модели ex vivo.

Аннотация

Микрососудистые эндотелиальные клетки мозга (BMECs) могут быть дифференцированы от индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) для разработки ex vivo клеточных моделей для изучения функции гемового мозга барьера (BBB). Этот измененный протокол содержит подробные шаги по получению, расширению и криопресервированию БМЕК от человеческих iPSCs с использованием различных доноров и реагентов, чем те, которые сообщалось в предыдущих протоколах. iPSCs обрабатываются с существенным 6 средних в течение 4 дней, а затем 2 дней человека эндотелиальной сыворотки свободной культуры среды дополняется основным фактором роста фибробластов, ретинойной кислоты и B27 дополнения. В день 6, клетки суб-культурных на коллагена / фибронектина матрицы в течение 2 дней. Иммуноцитохимия проводится в день 8 для анализа маркеров BMEC с использованием CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 и SLC2A1. Западный blotting выполняется для подтверждения выражения маркера BMEC, и отсутствие SOX17, эндодермальный маркер. Ангиогенный потенциал демонстрируется с прорастания анализа. Транс-эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER) измеряется с помощью электродов палочки и вольтомметра, начиная с 7-го дня. Деятельность транспортера Efflux для АТФ, связывающего кассетный субсемейный член B 1 и АТФ, связывающего кассетный субсемейный член C 1, измеряется с помощью многоэтажного считыватель на 8-й день. Успешное выведение BMECs подтверждается наличием соответствующих клеточных маркеров, низким уровнем SOX17, ангиогенным потенциалом, транспортерной активностью и значениями TEER 2000 Ω x cm2. BMECs расширены до дня 10 перед passaging на свежеокрашенных коллагена / фибронектина пластин или криоконсервированных. Этот протокол демонстрирует, что BMECs, полученные iPSC, могут быть расширены и пролететь по крайней мере один раз. Однако снижение значений TEER и более низкая локализация маркеров BMEC наблюдались после криоконсервации. БМЕК могут быть использованы в экспериментах совместной культуры с другими типами клеток (нейроны, глиа, перициты), в трехмерных моделях мозга (орган-чип и гидрогель), для васкуляризации органоидов мозга, а также для изучения дисфункции BBB при нейропсихиатрических расстройствах.

Введение

Функция гемово-мозгового барьера
Гемово-мозговой барьер (BBB) образует границу, которая ограничивает движение веществ из крови в мозг. BBB состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток мозга (BMECs), которые образуют монослой, выстилающий сосуды. БМЕК вместе со астроцитами, нейронами, перицитами, микроглией и внеклеточной матрицей образуют нервно-сосудистый блок. BMECs имеют жестко регулируемую параклеточную структуру, которая позволяет BBB поддерживать высокое транс-эндотелиальное электрическое сопротивление (TEER), которое ограничивает пассивную диффузию и служит индикатором барьернойцелостности 1,2. BMECs также имеют белки, которые помогают с трансклеточного движения, такие как эндоцитоз, трансцитоз, и трансмиграции, а также экстравазии лейкоцитов во время иммунногоответа 3. BMECs полагаться на приток и эффлюкс транспортеров для питания и удаления отходов, для того, чтобы поддерживать гомеостатический баланс в головном мозге3. Например, solute перевозчика семьи 2 члена 1 (SLC2A1) является приток транспортер отвечает за движение глюкозы через BBB4, в то время как efflux транспортеры, такие как ATP связывания кассеты субсемейный член B 1 (ABCB1) и ATP связывания кассеты субсемейный член C 1 (ABCC1) несут ответственность за возвращение субстратов обратно в кровоток3,5,7. ABCB1 субстраты включают морфин, verapamil4, и антипсихотики, такие как оланзапин ирисперидон 8, в то время как транспортер ABCC1 имеет различные субстраты, включая сульфатные конъюгаты, винкристин, и глюкуронидконъюгирует 4.

Применение моделей BBB при психических расстройствах
BBB дисфункция была вовлечена в ряд неврологических и психических расстройств, в том числе шизофрении и биполярногорасстройства 9,10. В последнее время, iPSC полученных ex vivo клеточных моделей в настоящее время используются для допроса клеточных и молекулярных основ психических расстройств, но эти модели в настоящее время не принимают во внимание потенциальную роль, которую играет нейроваскулатура11,12,13. Предполагается, что периферические воспалительные цитокины, циркулирующие вкрови,могут негативно повлиять на BBB14,15,16,17,но есть также доказательства для параклеточных18,19,20,21,22, трансцеллюлярные23,24,25,26,27,28,29,и внеклеточнойматрицы 20,29,30,31,32 аномалии способствует дисфункции BBB. Нарушение BBB может привести к содержанию крови, поступающих в мозг паренхима и активации астроцитов и / или микроглии, чтобы освободить провоспалительные цитокины, которые, в свою очередь, инициироватьвоспалительные реакции 33, которые могут иметь пагубные последствиядля мозга 34. BMECs являются основным компонентом BBB и изучения структуры и функции этих клеток может повысить понимание дисфункции BBB в неврологических и психических расстройств.

Альтернативные модели BMEC
До разработки эффективных протоколов для получения BMECs от iPSCs1,6,35,36, исследователи использовали увековеченные BMECs37 для изучения функции BBB. Тем не менее, многие из этих моделей не смогли достичь желаемого BBB фенотипов, такой физиологический диапазон значений TEER38,39. Использование iPSCs имеет то преимущество, сохраняя генетический фон человека, из которого клетки получены. Ученые активно работают над созданием iPSC-производных ex vivo микросреду модели, которые резюмируют структуру и функцию человеческого мозга. Исследователи разработали методы для получения BMECs, которые структурно и физиологически похожи на BMECs найти in vivo. Методы получения очищенных популяций БМЕК, полученных из iPSC, требуют ряда различных шагов, при этом в последние нескольколет оптимизированы протоколы 1,6,35,36. Как правило, БМЕК, полученные iPSC, культурированы в среде Essential 6 (E6) в течение 4 дней, а затем в течение 2 дней в эндотелиальной сыворотке человека свободной среды (hESFM) дополняется основным фактором роста фибробластов (bFGF), ретинойной кислоты (RA), и B27 дополнения. Клетки затем культури на коллагена IV (COL4) и фибронектина (FN) матрицы для получения 90% однородных BMECs1.

Идентичность БМЕК подтверждается иммунофлуоресценцией, показывающей совместное выражение белков BMEC, включая тромбоцитно-эндотелиарную молекулу адгезии клеток-1 (PECAM1), SLC2A1, и жесткие белки соединения, такие как плотный белок соединения 1 (TJP1), occludin (OCLN) и claudin-5 (CLDN5)6. Прорастание анализы были использованы для подтверждения ангиогенного потенциала IPSC полученных БМЕК. 6 Целостность BMECs BBB оценивается наличием физиологических значений IN vitro TEER (2000 х см2) 37иизмеримой активностью для транспортеров эффлюкса, таких как ABCB1 и ABCC11,6,36. Недавние методологические достижения группы Lippmann привели к iPSC-производным протоколам BMEC с уменьшенной экспериментальной изменчивостью и повышенной воспроизводимостью1. Однако неизвестно, могут ли они быть расширены и выйти за пределы субподготовной стадии. Наш измененный протокол направлен на решение этой проблемы путем прохода BMECs, полученных iPSC, за 8-й день и оценки того, могут ли они быть дополнительно расширены, чтобы сохранить свойства BBB после криоконсервации. Хотя никакие исследования не описали прохождение IPSC полученных BMECs, протокол существует для криоконсервации BMEC, который сохраняет физиологические свойства BBB после прохождения замораживания оттепелицикла 40. Тем не менее, не известно, после криоконсервации BMECs могут быть провечены и сохранить свойства BBB.

BMECs, полученные из iPSCs с помощью протокола Lippmann были использованы для моделирования BBB нарушения неврологических расстройств, таких как болезнь Хантингтона7. Такие БМЕК, полученные iPSC, также использовались для исследования влияния бактериальной инфекции, такой как Neisseria meningitidis или Group B Streptococcus на нарушение гембо-CSF барьера и BBB соответственно41,42. Кроме того, используя IPSC полученных BMECs от 22q удаления синдрома пациентов с шизофренией, исследователи наблюдали увеличение межклеточной молекулы адгезии-1 (ICAM-1), основные молекулы адгезии в BMECs, которые помогают с набором и экстравазиилейкоцитов в мозг 43. Взятые вместе, эти исследования демонстрируют полезность IPSC полученных БМЕК для изучения BBB нарушения в сложных нейропсихиатрических расстройств.

протокол

Человеческие iPSCs были перепрограммированы из фибробластов здоровых доноров, используяпротокол,утвержденный Институциональный обзор советов Массачусетской больницы общего профиля и больницы Маклин, и характеризуется как описано впредыдущих исследованиях 44,45,46.

ПРИМЕЧАНИЕ: Кратко, фибробласты были перепрограммированы на iPSC через MRNA основе генетического перепрограммирования47. IPSCs были сохранены в среде стволовых клеток (СКМ) (см. список материалов) и хранились при плотности 1,2 х 102 клеток/мл с 1 мл СКМ, 10 МКМ с ингибитором киназы биоассоциированных белков (ROCKi) Y-27632 и 10% (v/v) диметилсульфидом (DMSO), в криоконсервированных флаконах в жидком азоте при -160 градусов по Цельсию. Все следующие процедуры, приведенные ниже, осуществляются в кабинете по биобезопасности, если не указано иное.

1. Подвал мембраны матрицы разбавления и пластины покрытия

  1. Разбавленный (1:50) фактор роста уменьшил мембранную матрицу подвала, очищенную от опухоли Энгельбрет-Холм-Рой в модифицированной игленной среде Дулбекко (DMEM) без фенола красного цвета.
  2. Пластины культуры клеток пальто с соответствующим количеством разбавленной мембранной матрицы подвала (т.е. 6-хорошо пластины 1mL, 12-хорошо пластины 0,5 мл) и инкубировать эти пластины при 37 градусов по Цельсию, по крайней мере 1 час.

2. Техническое обслуживание iPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное слияние на колодец в 6-хорошо плоской нижней пластины составляет 1,2 х 106 клеток.

  1. Оттепель криоконсервированных iPSCs в СКМ с 10 МКМ Y-27632 и пластины на 6-хорошо пластины покрыты разбавленным фактором роста снижение мембранной матрицы подвала.
  2. Поддерживайте iPSC в СКМ с 10 МКМ Y-27632 в течение первых 24 часов после оттаивания. Переключитесь на свежую среду через 24 часа.
  3. Поддерживайте iPSC в СКМ до тех пор, пока клетки не достигнут 80-90% слияния перед проемом.
    1. Рассчитайте, сколько iPSCs потребуется для дифференциации путем умножения желаемой плотности для дифференциации (15600ячеек/см 2)по площади поверхности колодеца. Для 6-ну плоский дно пластины, умножить 15600 клеток /см 2 на 9,6см 2 в общей сложности 149 760 клеток / хорошо.
  4. Чтобы пройти, мыть клетки с Хэнкса сбалансированного раствора соли (HBBS). Затем инкубировать клетки неизиматической этилендиаминтетраатетической кислотой (ЭДТА) (см. список материалов) в течение 5 минут при 37 градусов по Цельсию.
    1. Используйте сотовый скребок, чтобы аккуратно снять клетки. Соберите ячейки в свежем СКМ.
    2. Плитные клетки на пластинах клеточной культуры, покрытых разбавленным СКМ, и поддерживают клетки, описанные в шаге 2.3, или хранят их на уровне1,2 х 10 6 клеток/мл в 1 мл СКМ, 10 МК Y-27632 и 10% DMSO (v/v) в криоконсервированных флаконах в жидком азоте при температуре -160 градусов по Цельсию.

3. Дифференциация iPSCs на BMECs

ПРИМЕЧАНИЕ: Неизиматический ЭДТА разделяет клетки на сгустки. Энзиматическая ЭДТА (см. таблицу материалов) разделяетклетки на одноклеточную подвеску. Ретинойная кислота (РА) должна быть защищена от света.

  1. Вымойте iPSCs один раз с фосфатным буферным салином Dulbecco (DPBS). Инкубировать с энзиматической ЭДТА (1 мл для 6-хорошо пластины, 0,5 мл для 12-хорошо пластины, и 0,25 мл для 24-хорошо пластины) в течение примерно 5 минут при 37 градусов по Цельсию, чтобы дать одной клеточной подвески.
  2. Соберите клетки и центрифугу при температуре 300 х г (относительная центробежная сила) в течение 5 минут при комнатной температуре. Реуспендные клеточные гранулы в СКМ, содержащие 10 МКМ Y-27632.
  3. Определите плотность клеток с помощью Trypan Blue и автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра устройства. Клетки плиты при плотности 15600клеток/см 2 или 149 760 клеток/хорошо 6-хорошо плоской нижней пластины (с площадью поверхности 9,6см 2/хорошо) в СКМ, содержащей 10 МК Y-27632 в течение 24 часов.
  4. Инициировать дифференциацию через 24 часа, изменив SCM на E6 среды. Изменение E6 среды ежедневно в течение следующих 4 дней.
  5. На 4-й день дифференциации замените E6 medium hESFM, дополненным разбавленной (1:200) добавкой B27, 20 ng/mL bFGF и 10 МКГ РА. Не меняй эту среду в течение следующих 48 часов.
  6. Приготовьте 200 мл hESFM с разбавленным (1:200) B27, смешайте 1 мл 50x концентрированной добавки B27 до 199 мл hESFM.
  7. Подготовьте 20 нг/мл буфера bFGF путем восстановления 50 мкг bFGF в 250 МКЛ буфера Трис (5 мМ Трис, рН 7,6, 150 мМр NaCl), чтобы сделать 200 мкг/мл фондового раствора. Подготовь 200 мл hESFM, содержащий 20 нг/мл bFGF, смешивая 20 мл 200 мкг/мл bFGF с 200 мл hESFM.
  8. Приготовьте 10 МКМ РА, сначала сделав 40 мг/мл раствора запасов РА, добавив 2,5 мл DMSO до 100 мг порошка РА. Разбавить эту концентрацию до 3 мг/мл, чтобы сделать 10 мМ бульонный раствор. Подготовь 200 мл hESFM, содержащий 10 МКМ РА, смешивая 200 МКЛ из 10 МКМ РА в 200 мл hESFM.

4. Покрытие коллагена IV (COL4) и фибронектина (FN) Матрица для очистки IPSC-производных BMEC

  1. Добавьте 2 мл стерильной воды в 2 мг FN, чтобы сделать 1 мг/мл раствора FN бульона. Добавьте 5 мл стерильной воды в 5 мг COL4, чтобы сделать 1 мг/мл раствора COL4.
    1. Разрешить FN растворяться в течение по крайней мере 30 минут при температуре 37 градусов по Цельсию и COL4 растворяться при комнатной температуре.
  2. Разбавить раствор бульона FN в стерильной воде до конечной концентрации 100 мкг/мл и раствор запаса COL4 до конечной концентрации 400 мкг/мл.
  3. Покрыть желаемые пластины (6-хорошо пластины - 1 мл раствора COL4/FN, 12-хорошо пластины 0,5 мл, 24-хорошо пластины 0,25 мл, и 12-трансвелл фильтрованной пластины 0,25 мл) со смесью 400 мкг / мл COL4 и 100 мкг / мл FN.
  4. Инкубационые пластины в течение как минимум 2 часов или на ночь при 37 градусах Цельсия; для трансвелл фильтрованных пластин, как минимум 4 часа рекомендуется.

5. Суб-культура и очистка БМЕК, полученных из iPSC

ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация с энзиматической ЭДТА может занять более 15 минут в зависимости от слияния клеток на 6-й день дифференциации.

  1. На 6-й день дифференциации, мыть клетки дважды с DPBS. Инкубировать с 1 мл энзиматической ЭДТА, по крайней мере 15 минут при 37 градусов по Цельсию, пока одна подвеска ячейки не будет получена.
  2. Собирайте клетки с помощью центрифугации при температуре 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Реуспендные клеточные гранулы со свежим hESFM с разбавленной (1:200) добавкой B27, 20 ng/mL bFGF и 10 МКМ РА.
  3. Семенные клетки на пластинах, покрытых смесью 400 мкг/мл COL4 и 100 мкг/мл FN. Семенные клетки, используя соотношение 1 колодец 6-хорошо пластины до 3 скважин 12-хорошо пластины, 3 скважины 12-трансвелл фильтрованной пластины, или 6 скважин 24-хорошо пластины.
  4. Семя недифференцированных iPSCs от той же линии ячейки на COL4/FN покрытием 12-трансвелл фильтрованной пластины, как отрицательный контроль для анализа TEER.
  5. После 24 часов суб-культирования, изменить средний на hESFM с B27 дополнения только. После этого шага не требуется никаких средних изменений.

6. Прорастание анализа

  1. Соберите BMECs, полученные в день 8 iPSC, и посеять их на 100 000 клеток/хорошо на 24-хорошо плоскую нижнюю пластину, недавно покрытую 200 йл/см2 мембранной матрицы подвала.
  2. Лечить эти клетки с hESFM с разбавленным (1:200) B27 и 40 нг/мл сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGFA165).
  3. Наблюдайте за ячейками каждые 24 часа и меняйте носитель каждые два дня.

7. Иммуноцитохимия (ICC)

ПРИМЕЧАНИЕ: МЦК осуществляется на 24-хорошо плоских нижних пластин.

  1. После 48 часов субподряда (день 8), мыть клетки дважды с DPBS. Исправьте клетки с 4% параформальдегидом (PFA) в течение 20 минут.
  2. Вымойте клетки три раза с DPBS, 5 минут на стирку. Предблокираторные клетки в течение 1 часа при комнатной температуре в DPBS с 5% ослиной сывороткой и 0,3% Triton X-100 (v/v).
  3. Инкубация первичными антителами: мышь анти-человек-PECAM1 (1:100, запас 0,5 мг/мл), кролик анти-человек-TJP1 (1:200, запас 0,53 мг/мл), мышь анти-человека-CLDN5 (1:200, запасы 0,5 мг/мл), мышь анти-человек-OCLN (1:200, запас 0,5 мг/мл), и кролика анти-человека-SLC2A1 (1:100, запас 0,2 мг / мл) в DPBS содержащие 5% осла сыворотки на ночь при 4 градусов по Цельсию.
    1. Промыть клетки один раз с DPBS, а затем мыть пять раз в течение 5 минут за стирку с DPBS.
  4. Инкубационые клетки со вторичными антителами: осел-анти-кролик Alexa Fluor 555 (1:200) и осел-анти-мышь 488 (1:200) в DPBS, содержащий 5% ослиной сыворотки в течение 1 часа.
  5. После этой инкубации добавьте тригидрохлорид тригидрат Hoechst 33342 разбавленный (1:1000) в DPBS в течение 10 минут.
    1. Удалите раствор Hoechst 33342 и смойте один раз DPBS и промойте четыре раза DPBS в течение 5 минут за стирку.
  6. Визуализация клеток на флуоресценции микроскопов для искать выражения и локализации клеток органов.

8. Измерение и анализ TEER

ПРИМЕЧАНИЕ: Корни 12-Transwell фильтрованные пластины оснащены фильтрами, состоящими из 1,12см 2 полиэтиленовых терефталат мембран и 0,4 микрометра пор. Измерения TEER получены в техническом (3 на скважину) и биологических репликациях (3 скважины на линию клетки и/или состояние).

  1. Через 24 часа после субподряда (день 7) измеряйте TEER с помощью электродов палочки и вольтомметра каждые 24 часа. Обратитесь к voltohmmeter руководство пользователя для конкретных инструкций по получению измерений.
    1. Для измерения TEER, зарядить вольтомметр инструмент накануне вечером. Слегка протрите инструмент и электроды палочки с 70% этанола, прежде чем поместить их в защитный капюшон.
    2. Включите питание и откалибровать ohm метр в зависимости от рекомендации производителя.
    3. Подключите электроды палочки и промыть электроды с 70% этанола следуют DPBS.
    4. Поместите более короткий конечный электрод в транс-хорошо вставить (апиальная камера) и больше конца в базолатеральной камере.
    5. Первая мера пустой колодец, который покрыт COL4 / FN только. Затем измерьте другие скважины.
    6. Быстро промыть палочкой электродов с 70% этанола следуют DPBS при измерении различных условий (т.е. измерения различных клеточных линий).
  2. После всех измерений (в Ω) были зарегистрированы, промыть палочки электродов с 70% этанола, а затем стерильной воды. Аккуратно протрите электрод и дайте ему высохнуть в защитной капот.
  3. Среднее тройное значение TEER (в Ω) из пустой колодец и вычесть это среднее значение из каждого сырья TEER значение условием.
    1. Средние вычитаемые значения и умножить их на 1,12см 2 (площадь поверхности 12-трансвелл вставки).
    2. Используйте преобразованные значения из шага 6 для создания графика, показывающего значение TEER и стандартные ошибки для каждого дня измерения TEER.

9. Деятельность и анализ транспортера Efflux

ПРИМЕЧАНИЕ: Efflux транспортер деятельности анализ выполняется на 24-хорошо плоский дно пластины. Транспортеры Efflux, представляющие интерес, включают ABCB1 и ABCC1. Рекомендуется, чтобы каждое условие выполнялось в три раза с помощью контрольных скважин (т.е. пустых скважин без соответствующих ингибиторов).

  1. После 48 часов субподготовки (день 8), инкубационые клетки с 10 МК Вальсподар (ингибитор ABCB1) или 10 МКМ MK571 (ингибитор ABCC1) в течение 1 часа при 37 градусов по Цельсию.
    1. Приготовьте запас 10 мМ Вальсподар, растворив 5 мг порошка (1214,64 г/мол) в 412 МКЛ ДМСО и разбавляя до рабочей концентрации 10 МКМ. Например, чтобы сделать 10 мл hESFM с 10 МКМ Вальсподар, смешать 10 МКЛ из 10 мМ Валсподар бульон с 10 мл hESFM.
    2. Приготовьте запас 10 мМ МК571, растворив 5 мг порошка (537,07 г/мол) в 931 л и разбавляя до рабочей концентрации 10 МКМ. Например, чтобы сделать 10 мл hESFM с 10 МК571, смешайте 10 МЛ 10 мМ МК571 с 10 мл hESFM.
  2. Через 1 час инкубируют клетки с 10 ЗМ родамин 123 (субстрат ABCB1) или 10 МК 2',7'-дихлордигидрофлюорецеин диацетат (H2DCFDA, ABCC1 субстрат) с или без их соответствующих ингибиторов в течение 1 часа при 37 градусов по Цельсию.
    1. Приготовьте 10 мМ родамин 123 путем растворения 10 мг порошка (380,82 г/мол) в 875 МКЛ ДМСО и разбавьте к рабочей концентрации 10 МКМ. Например, сделать 10 мл hESFM с 10 мкм родамина 123, смешать 10 МЛ 10 мМ родамин 123 бульона с 10 мл hESFM.
    2. Приготовьте 10 мМ H2DCFDA путем растворения 50 мг порошка (487,29 г/мол) в 10,26 мл ДМСО и разбавляют до рабочей концентрации 10 МКМ. Например, сделать 10 мл hESFM с 10 мкм родамина 123, смешать 10 МЛ 10 мМ родамин 123 бульона с 10 мл hESFM.
  3. Вымойте клетки дважды с 0,5 мл DPBS и лиза с помощью DPBS, содержащего 5% Triton-X (v/v).
  4. Измерьте флуоресценцию лизированных клеток с помощью многоплавного или микропластиного считывателя (см. список материалов).
    1. Установите флуоресцентный прибор для считывания пластин до 485 нанометров и выбросов 530 нанометров и измерьте флуоресценцию на этих длинах волн.
    2. Для скважин, не используемых в анализе транспортера, мыть клетки дважды с DPBS перед фиксацией их с 4% PFA для количественной оценки ядер клеток.
  5. Инкубировать клетки с Hoechst 33342 тригидрохлорид тригидрат разбавленных (1:1000) в DPBS в течение 10 минут. Изображение несколько визуальных полей в каждой хорошо для расчета среднего ядра клеток рассчитывает с помощью флуоресценции микроскопов.
  6. Подсчитайте ядра, использующие Фиджи, и нормализуйте значения флуоресценции на основе каждой клетки по этим подсчетам.
    1. Рассчитайте среднее накопление флуоресценции, вычитая сырое значение накопления флуоресценции для каждого условия из его соответствующего пустого значения.
    2. Средние вычитаемые значения для каждого условия.
    3. Разделите средние значения с шага 9.6.1 на средние значения ячеев. Используйте эти значения для нормализации значений флуоресценции на основе на ячейку.
    4. Используйте нормализованные значения для создания графического представления для каждого условия ингибитора и выполнения любого необходимого статистического анализа.

10. Пассирование, расширение и криоконсервирование БМЕКов

  1. Пополнить день 8 культур BMEC со свежим hESFM дополняется разбавленной (1:200) B27 и позволяют клеткам расширяться еще на два дня на матрице COL4/FN.
  2. Пальто новой 12-Transwell фильтрованной пластины и 24-хорошо плоский дно пластины с 400 мкг / мл COL4 и 100 мкг / мл FN и инкубировать в течение 4 часов.
  3. На 10-й день промывка клеток с DPBS и инкубации с 1 мл энзиматической ЭДТА, по крайней мере 15 минут при 37 градусов по Цельсию, пока одна подвеска ячейки не будет получена.
  4. Собирайте клетки с помощью центрифугации при температуре 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
    1. Чтобы криопресервовать эти клетки, повторно подать клеточные гранулы со свежим hESFM с 30% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS) и 10% DMSO.
    2. Храните BMECs, полученные iPSC, в криоконсервированных флаконах в контейнере изопропанола в течение первых 24 часов при -80 градусов по Цельсию, а затем поместите в жидкий азот для длительного хранения при -160 градусов по Цельсию.
    3. Для прохождения этих клеток, повторного использования клеточных гранул со свежим hESFM дополняется разбавленной (1:200) B27.
  5. Семенные клетки на покрытых пластинах, подготовленных в шаге 10.2. Семенные клетки, использующие соотношение 1 скважины 6-хорошо пластины до 3 скважин 12-трансвелл фильтрованной пластины и 6 скважин 24-хорошо пластины. Разрешить клетки расти и расширяться в течение 24 часов.
  6. На 11-й день измерьте TEER, следуя шагам, перечисленным в шаге 8.
  7. На 12-й день выполните МУС, выполнить следующие шаги, перечисленные в шаге 9.
  8. Чтобы разморозить криоконсервированные БМЕКи, поместите криоконсервированные флаконы в теплую воду или ванну с бисером при 37oC. Затем перенесите размороженые БМЕКи на 5 мл hESFM, дополненные разбавленным (1:200) B27.
    1. Собирайте клетки с помощью центрифугации при температуре 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре. Повторное ослабление клеток в hESFM дополняется разбавленным (1:200) B27, 10 МКМ РА и 10 МК Y-27632.
    2. Через 24 часа переключитесь средний на hESFM, дополненный разбавленным (1:200) B27 и 10 МК Y-27632 без РА.

Результаты

Дифференциация BMEC
Следует точно следовать нескольким важным шагам в этом протоколе(рисунок 1). E6 среднего использования на день 1 имеет важное значение, так как он часто используется для получения нейроэктодерм линии от iPSCs в течение относительно короткого пе?...

Обсуждение

Модификации и устранение неполадок

В этом протоколе мы внесли некоторые изменения в использование широко используемой внеклеточной матрицы и средств культуры клеток во время культивирования iPSC для производных БМЕК(рисунок 1). Эти изменения не ?...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом психического здоровья Биобехавиоальные исследования Награды для инновационных новых ученых (BRAINS) Премия R01MH113858 (К.К.), Национальные институты здравоохранения премии KL2 TR002542 (PL). Национальный институт психического здоровья клинического научного развития премии K08MH086846 (в Р.К.), Сидней R Baer Jr Фонд Грант (P.L.) Дорис Дьюк Благотворительный фонд клинического научного развития премии (R.K.), Райан Лихт Сан Биполярный фонд (в Р.К.), Филлис и Джером Лайл Раппапорт Фонд (К.К.), Гарвардский институт стволовых клеток (R.K.) и Стив Уиллис и Элисса Фрейд (R.K.). Мы благодарим доктора Энни Катурию за ее критическое чтение и отзывы о рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetateSigma AldrichD6883-50MG
AccutaseSigma AldrichA6964-100mL
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgGLife TechnologiesA-21202
Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgGLife TechnologiesA-31572
B27 SupplementThermo Fisher Scientific17504044
CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAbCell Signaling3528S
CLDN5 (Claudin-5)Thermo Fisher Scientific35-2500
Collagen IV from human placentaSigma AldrichC5533-5mg
Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 8670
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)Corning353046
Corning Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)Corning353047
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)Corning3460
Countess slidesThermo Fisher ScientificC10228
DMEM/F12 (without phenol red)Thermo Fisher Scientific A1413202
DMSOSigma AldrichD2438-50mL
Donkey serumSigma AldrichD9663-10ML
DPBS (+/+)Gibco/Thermo Fisher Scientific14040-117
Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2World Precision InstrumentsN/A
Essential 6 Medium (Thermo Fisher)Thermo Fisher ScientificA1516401
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma AldrichF2442
FibronectinSigma AldrichF2006-2mg
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413202
Hanks' Balance Salt Solution with calcium and magnesium Thermo Fisher Scientific24020-117
Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570
Human endothelial serum-free mediumThermo Fisher Scientific11111044
InCell Analyzer 6000General ElectricN/A
Invitrogen Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificN/A
MK-571Sigma AldrichM7571-5MG
NutriStemStemgent01-0005
OccludinThermo Fisher Scientific33-1500
Paraformaldehyde 16%Electron Microscopy Services15710
Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate ReaderPerkin ElmerN/A
Recombinant Human VEGF 165Peprotech100-20
Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)Peprotech100-18B
Retinoic acidSigma AldrichR2625-100MG
Rhodamine 123Sigma Aldrich83702-10MG
SLC2A1 (GLUT-1)ThermoFisherPA1-21041
SOX17Cell Signaling81778S
TJP-1 (ZO-1)ThermoFisherPA5-28869
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificT10282
Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)Sigma AldrichSML0572-5MG
Versene solutionThermo Fisher Scientific15040066
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)Tocris/Thermo Fisher Scientific1254

Ссылки

  1. Neal, E. H., et al. A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs. Stem Cell Reportsorts. 12, 1380-1388 (2019).
  2. Smith, Q. R., Rapoport, S. I. Cerebrovascular Permeability Coefficients to Sodium, Potassium, and Chloride. Journal of Neurochemistry. 46, 1732-1742 (2006).
  3. Liebner, S., et al. Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease. Acta Neuropathologica. 135, 311-336 (2018).
  4. Sanchez-Covarrubias, L., Slosky, L., Thompson, B., Davis, T., Ronaldson, P. Transporters at CNS Barrier Sites: Obstacles or Opportunities for Drug Delivery. Current Pharmaceutical Design. 20, 1422-1449 (2014).
  5. Stamatovic, S., Keep, R., Andjelkovic, A. Brain Endothelial Cell-Cell Junctions: How to "Open" the Blood Brain Barrier. Current Neuropharmacology. 6, 179-192 (2008).
  6. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, 783-791 (2012).
  7. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, 1365-1377 (2017).
  8. Eum, S., Lee, A. M., Bishop, J. R. Pharmacogenetic tests for antipsychotic medications: clinical implications and considerations. Dialogues in Clinical Neuroscience. 18, 323-337 (2016).
  9. Najjar, S., et al. Neurovascular Unit Dysfunction and Blood–Brain Barrier Hyperpermeability Contribute to Schizophrenia Neurobiology: A Theoretical Integration of Clinical and Experimental Evidence. Frontiers in Psychiatry. 8, 83 (2017).
  10. Pollak, T. A., et al. The blood-brain barrier in psychosis. Lancet Psychiatry. 5, 79-92 (2018).
  11. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  12. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18, 471-479 (2017).
  13. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 1-2 (2016).
  14. Hwang, Y., et al. Gene expression profiling by mRNA sequencing reveals increased expression of immune/inflammation-related genes in the hippocampus of individuals with schizophrenia. Translational Psychiatry. 3, 321 (2013).
  15. Kim, S. Transcriptome sequencing of the choroid plexus in schizophrenia. Translational Psychiatry. 11, (2016).
  16. Lizano, P., et al. Association of Choroid Plexus Enlargement With Cognitive, Inflammatory, and Structural Phenotypes Across the Psychosis Spectrum. American Journal of Psychiatry. 176, 564-572 (2019).
  17. Harris, L. W., et al. The Cerebral Microvasculature in Schizophrenia: A Laser Capture Microdissection Study. PLoS ONE. 3, 3964 (2008).
  18. Greene, C., Hanley, N., Campbell, M. Claudin-5: gatekeeper of neurological function. Fluids and Barriers of the CNS. 16, 3 (2019).
  19. Maes, M., Sirivichayakul, S., Kanchanatawan, B., Vodjani, A. Breakdown of the Paracellular Tight and Adherens Junctions in the Gut and Blood Brain Barrier and Damage to the Vascular Barrier in Patients with Deficit Schizophrenia. Neurotoxicity Research. 36, 306-322 (2019).
  20. Katsel, P., Roussos, P., Pletnikov, M., Haroutunian, V. Microvascular anomaly conditions in psychiatric disease. Schizophrenia - connection. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 77, 327-339 (2017).
  21. Pouget, J. G., et al. Genome-Wide Association Studies Suggest Limited Immune Gene Enrichment in Schizophrenia Compared to 5 Autoimmune Diseases. Schizophrenia Bulletin. 42, 1176-1184 (2016).
  22. Luo, X., et al. Systematic Prioritization and Integrative Analysis of Copy Number Variations in Schizophrenia Reveal Key Schizophrenia Susceptibility Genes. Schizophrenia Bulletin. , 15 (2014).
  23. Cai, H. Q., et al. Increased macrophages and changed brain endothelial cell gene expression in the frontal cortex of people with schizophrenia displaying inflammation. Molecular Psychiatry. , (2018).
  24. Katsel, P., Davis, K. L., Gorman, J. M., Haroutunian, V. Variations in differential gene expression patterns across multiple brain regions in schizophrenia. Schizophrenia Research. 77, 241-252 (2005).
  25. de Klerk, O. L., et al. Regional increase in P-glycoprotein function in the blood-brain barrier of patients with chronic schizophrenia. Psychiatry Research: Neuroimaging. 183, 151-156 (2010).
  26. Hoosain, F. G., et al. Bypassing P-Glycoprotein Drug Efflux Mechanisms: Possible Applications in Pharmacoresistant Schizophrenia Therapy. BioMed Research International. 2015, 1-21 (2015).
  27. Kimchi-Sarfaty, C., et al. A "Silent" Polymorphism in the MDR1 Gene Changes Substrate Specificity. Science. 315, 525-528 (2007).
  28. Martínez-Magaña, J. J., et al. Exploratory Analysis of Rare and Novel Variants in Mexican Patients Diagnosed with Schizophrenia and Dementia. Revista de Investigación Clínica. 71, 1879 (2019).
  29. Girard, S. L., et al. Increased exonic de novo mutation rate in individuals with schizophrenia. Nature Genetics. 43, 860-863 (2011).
  30. Xu, B., et al. De novo gene mutations highlight patterns of genetic and neural complexity in schizophrenia. Nature Genetics. 44, 1365-1369 (2012).
  31. Kurian, S. M. Identification of blood biomarkers for psychosis using convergent functional genomics. Molecular Psychiatry. 22, (2011).
  32. Prata, D. P., Costa-Neves, B., Cosme, G., Vassos, E. Unravelling the genetic basis of schizophrenia and bipolar disorder with GWAS: A systematic review. Journal of Psychiatric Research. 114, 178-207 (2019).
  33. Trépanier, M. O., Hopperton, K. E., Mizrahi, R., Mechawar, N., Bazinet, R. P. Postmortem evidence of cerebral inflammation in schizophrenia: a systematic review. Molecular Psychiatry. 21, 1009-1026 (2016).
  34. Busse, S., et al. Different distribution patterns of lymphocytes and microglia in the hippocampus of patients with residual versus paranoid schizophrenia: Further evidence for disease course-related immune alterations. Brain, Behavior, and Immunity. 26, 1273-1279 (2012).
  35. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160 (2015).
  36. Hollmann, E. K., et al. Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 14, 9 (2017).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Barichello, T. Transepithelial/Transendothelial Electrical Resistance (TEER) to Measure the Integrity of Blood-Brain Barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19, 1872-1874 (2005).
  39. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 33 (2013).
  40. Wilson, H. K., Faubion, M. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Cryopreservation of Brain Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells Is Enhanced by Rho-Associated Coiled Coil-Containing Kinase Inhibition. Tissue Engineering Part C: Methods. 22, 1085-1094 (2016).
  41. Martins Gomes, S. F., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells as a Cellular Model to Study Neisseria meningitidis Infection. Frontiers in Microbiology. 10, 1181 (2019).
  42. Kim, B. J., et al. Modeling Group B Streptococcus and Blood-Brain Barrier Interaction by Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Brain Endothelial Cells. mSphere. 2, 00398 (2017).
  43. Crockett, A. M., et al. Disruption of the Blood-Brain Barrier in 22q11.2 Deletion Syndrome. biorXiv. , (2019).
  44. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9, 321 (2019).
  45. Kathuria, A., et al. Transcriptomic Landscape and Functional Characterization of Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cerebral Organoids in Schizophrenia. JAMA Psychiatry. , (2020).
  46. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 34 (2020).
  47. Warren, L., Lin, C. mRNA-Based Genetic Reprogramming. Molecular Therapy. 27, 729-734 (2019).
  48. Eaton, S. L., et al. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. Journal of Visualized Experiments. , 52099 (2014).
  49. Wang, P., Rodriguez, R. T., Wang, J., Ghodasara, A., Kim, S. K. Targeting SOX17 in Human Embryonic Stem Cells Creates Unique Strategies for Isolating and Analyzing Developing Endoderm. Cell Stem Cell. 8, 335-346 (2011).
  50. Blume, L. F., Denker, M., Kunze, T., et al. Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability. Pharmazie. , 19-24 (2010).
  51. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D. G., Robey, P. G. Human Pluripotent Stem Cell Culture: Considerations for Maintenance, Expansion, and Therapeutics. Cell Stem Cell. 14, 13-26 (2014).
  52. Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. NeuroReport. 29, 588-593 (2018).
  53. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  54. Baruah, J., Vasudevan, A. The Vessels Shaping Mental Health or Illness. Open Neuroimaging Journal. 13, 1-9 (2019).
  55. Lopes, R., Soares, R., Coelho, R., Figueiredo-Braga, M. Angiogenesis in the pathophysiology of schizophrenia - comprehensive review and a conceptual hypothesis. Life Sciences. 128, 79-93 (2015).
  56. Wilson, H. K., Canfield, S. G., Hjortness, M. K., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Exploring the effects of cell seeding density on the differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cells. Fluids and Barriers of the CNS. 12, 13 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

165

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены