Рабочий процесс количественной протеомики с использованием множественного мониторинга реакций на основе обнаружения белков из ткани мозга человека

Резюме

Протокол направлен на введение использования тройного квадрупольного масс-спектрометра для мониторинга множественных реакций (MRM) белков из клинических образцов. Мы обеспечили систематический рабочий процесс, начиная от подготовки образцов до анализа данных для клинических образцов со всеми необходимыми мерами предосторожности.

Аннотация

Протеомный анализ ткани человеческого мозга за последнее десятилетие значительно улучшил наше понимание мозга. Тем не менее, расстройства, связанные с мозгом, по-прежнему являются основной причиной смертей во всем мире, что требует еще большего понимания их патобиологии. Традиционные методы, основанные на антителах, такие как западное блоттинг или иммуногистохимия, страдают от низкой пропускной способности, помимо того, что они трудоемкие и качественные или полукоачественные. Даже обычные подходы, основанные на масс-спектрометрии, не могут предоставить убедительных доказательств в поддержку определенной гипотезы. Подходы к целенаправленной протеомике в значительной степени основаны на гипотезах и отличаются от обычных подходов к протеомике дробовика, которые давно используются. Мониторинг множественных реакций является одним из таких целевых подходов, который требует использования специального масс-спектрометра, называемого тандемным квадрупольным масс-спектрометром или трехквадрупольных масс-спектрометрами. В текущем исследовании мы систематически освещали основные шаги, связанные с выполнением успешного тандемного квадрупольного процесса протеомики на основе масс-спектрометрии с использованием ткани мозга человека с целью представления этого рабочего процесса более широкому исследовательской аудитории.

Введение

В течение последнего десятилетия быстрое развитие масс-спектрометрии (МС) в сочетании с более глубокое понимание методов хроматографии значительно помогло в продвижении протеомики на основе РС. Методы, основанные на молекулярной биологии, такие как западное блоттинг и иммуногистохимия, уже давно страдают от проблем воспроизводимости, медленного времени обработки, изменчивости между наблюдателями и их неспособности точно количественно оценивать белки, и это лишь некоторые из них. С этой целью превосходная чувствительность высокопроизводительных подходов к протеомике продолжает предлагать молекулярным биологам альтернативный и более надежный инструмент в их стремлении лучше понять роль белков в клетках. Тем не менее, подходы к протеомике дробовика (Data dependent Acquisition или DDA) часто не могут обнаружить низкие обильные белки в сложных тканях, помимо того, что они в значительной степени зависят от чувствительности и разрешения инструмента. За последние пару лет лаборатории по всему миру разрабатывали такие методы, как Data Independent Acquisition (DIA), которые требуют увеличения вычислительной мощности и надежного программного обеспечения, которое может обрабатывать эти очень сложные наборы данных. Тем не менее, эти методы все еще находятся в процессе разработки и не очень удобны для пользователя. Целевые подходы протеомики на основе РС обеспечивают идеальный баланс между высокопроизводительный характер подходов к РС и чувствительностью подходов молекулярной биологии, таких как ИФА. Целевой эксперимент по протеомике на основе масс-спектрометрии фокусируется на обнаружении белков или пептидов, основанных на гипотезах, из экспериментов по протеомике на основе открытия дробовика или через доступную литературу^1,2. Множественный мониторинг реакций (MRM) является одним из таких целевых подходов MS, который использует тандемный квадрупольный масс-спектрометр для точного обнаружения и количественной оценки белков / пептидов из сложных образцов. Метод предлагает более высокую чувствительность и специфичность, несмотря на необходимость использования инструмента с низким разрешением.

Квадруполь состоит из 4 параллельных стержней, каждый из которых соединен с диагонально противоположным стержнем. Флуктуирующее поле создается между квадрупольными стержнями путем подачи переменных напряжений ВЧ и постоянного тока. На траекторию ионов внутри квадруполя влияет наличие одинаковых напряжений на противоположных стержнях. Применяя радиочастотное напряжение к постоянному току, траектория ионов может быть стабилизирована. Именно это свойство квадруполя позволяет использовать его в качестве массового фильтра, который может избирательно пропускать определенные ионы. В зависимости от необходимости квадруполь может работать как в статическом, так и в сканирутном режиме. Статический режим позволяет проходить только ионам с заданным m/z, что делает режим очень селективным и специфичным для интересующих ионов. Режим сканирования, с другой стороны, позволяет проходить ионам во всем диапазоне m/z. Таким образом, тандемные квадрупольные масс-спектрометры могут работать 4 возможными способами: i) первый квадруполь, работающий в статическом режиме, а второй – в режиме сканирования; ii) первый квадруполь, работающий в режиме сканирования, а второй – в статическом режиме; iii) оба квадруполя, работающие в режиме сканирования; и iv) оба квадруполя, работающие в статическом режиме^3. В типичном эксперименте MRM оба квадруполя работают в статическом режиме, что позволяет контролировать конкретные прекурсоры и их результирующие продукты после фрагментации. Это делает технику очень чувствительной и избирательной, что позволяет проводить точную количественную оценку.

Для молекулярных биологов ткань мозга человека и ее клетки являются сокровищницей. Эти замечательные единицы вечно интересного органа человеческого тела могут обеспечить молекулярное и клеточное понимание его функционирования. Протеомные исследования мозговой ткани могут не только помочь нам понять системное функционирование здорового мозга, но и клеточные пути, которые дисрегулируются при заболевании^4. Однако мозговая ткань со всей ее неоднородностью является очень сложным органом для анализа и требует согласованного подхода для лучшего понимания изменений на молекулярном уровне. Следующая работа описывает весь рабочий процесс, начиная с извлечения белков из мозговой ткани, создания и оптимизации методов анализа MRM, до проверки целей(рисунок 1). Здесь мы систематически освещаем основные шаги, связанные с успешным экспериментом на основе MRM с использованием ткани человеческого мозга с целью представления техники и ее проблем более широкому исследовательской аудитории.

протокол

Это исследование включает образцы мозговой ткани от людей-участников, рассмотренные и одобренные TMH и IITB IEC - (IITB-IEC/2018/019). Участники предоставили свое информированное и письменное согласие на участие в этом исследовании.

1 Извлечение белка из мозговой ткани

1. Взвесьте около 50 мг мозговой ткани и промыть ткань 300 мкл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) с помощью микропипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг выполняется для удаления любой крови на внешней поверхности ткани и должен быть повторен при необходимости. Желательно удалить как можно больше крови из ткани, так как это мешает последующей оценке и обработке белка.
2. После промывки PBS добавьте 300 мкл лизисного буфера (buffer A) в трубку, содержащую ткань. Буфер А содержит 8 М мочевины, 50 мМ Tris pH 8,0, 75 мМ NaCl, 1 мМ_MgCl2 и коктейль ингибитора протеазы (согласно инструкциям производителя).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выход белка варьируется в зависимости от нескольких факторов, начиная от условий, в которых хранятся образцы, количества исходного материала и эффективности обработки образцов во время обработки. Уменьшают объем буфера А пропорционально при работе с количеством ткани ниже 50 мг.
3. Разжижайте ткань с помощью зондового ультразвукового аппарата, сохраняя трубку на ледяной ванне. Используйте следующие параметры для обработки ультразвуком: амплитуда 40%, цикл вкл. и выключение 5 секунд в течение 2:30 мин.
4. Продолжайте гомогенизацию тканей с помощью бисерного битерного битера, чтобы полностью лизезовать ткань.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап следует выполнять на средней скорости в течение 90 секунд с последующей инкубацией на льду в течение 3-5 минут.
5. Центрифугируют содержимое пробирки при 6 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Переложите супернатант в свежий тюбик и однородно перемешайте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте аликвоты образца и храните при -80°C до дальнейшего использования.

2 Количественная оценка и проверка качества белка

1. Количественно оценить образцы до пищеварения, используя стандартный график, составленный с известными концентрациями BSA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что анализ, используемый для оценки белка, совместим с буфером, используемым для получения лизата белка. Проверьте качество лизата белка, икомпустив гель SDS-PAGE.

3 Переваривание белка

1. Возьмите 50 мкг белка в микроцентрифужной трубке и уменьшите белки, добавив Tris 2-карбоксиэтилфосфин (TCEP) таким образом, чтобы конечная концентрация была 20 мМ. Инкубировать содержимое при 37 °C в течение 1 ч.
2. После инкубации алкилируют восстановленные белки, добавляя йодоацетамид (IAA) в пробирку таким образом, чтобы его конечная концентрация была 40 мМ. Инкубировать тюбик в темноте в течение 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте IAA заново непосредственно перед его добавлением в тюбик.
3. Добавьте буфер В в пробирку, содержащую восстановленные и алкилированные белки таким образом, чтобы конечная концентрация мочевины в пробирке была менее 1 М.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер B состоит из 25 мМ Tris (рН 8,0) и 1 мМ_CaCl2 и используется для разбавления образцов. При разбавлении убедитесь, что содержимое трубки имеет рН 8 для оптимального переваривания белка после добавления трипсина.
4. Добавьте трипсин в соотношении фермента к белку 1:30 и инкубируют трубки в течение ночи при 37 °C с постоянным встряхиванием.
5. После переваривания сконцентрируйте переваренный продукт в вакуумном концентраторе. На этом этапе пептиды могут быть либо восстановлены и обессолины, либо сохранены при -80 °C для будущего использования.

4 Обессоливание и количественная оценка пептидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Обессоливание или очистка пептидов необходимы перед загрузкой образцов для LC-MS / MS. Соли и другие загрязняющие вещества в образце могут засорить колонны и привести к повреждению прибора. Процесс может быть выполнен с использованием коммерчески доступных наконечников ступеней или колонн C18.

1. Активируйте наконечник стадии с помощью 20 мкл 50% ацетонитрила (ACN) в 0,1% муравьиной кислоты (FA). Центрифугировать содержимое в 1000 х г в течение 1 минуты и выбросить поток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Условия центрифугирования одинаковы до конца процедуры.
2. Добавьте 20 мкл 100% ACN в 0,1% FA и центрифугируют содержимое, как на этапе 4.1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги активации можно повторить пару раз.
3. После активации пропустите 20 мкл восстановленного пептидного образца через наконечник ступени и центрифугу, как это выполнено на этапе 4.1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не отбрасывайте поток на этом шаге.
4. Повторите этап 4.3 с прохождением через не менее 5 раз, чтобы обеспечить максимальное связывание пептидов с наконечником ступени.
5. Пропустите 20 мкл 0,1% FA через наконечник ступени и отбросьте поток через него.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите этот шаг еще два раза для получения лучших результатов.
6. Элюдирует связанные пептиды в свежей микрофьюжной трубке путем прохождения возрастающих концентраций ACN, т.е. на 40%, 60% и 80% соответственно.
7. Высушите пептиды в вакуумном концентраторе и приступайте к количественной оценке пептидов.
8. Восстановить высушенные пептиды в 0,1% FA и количественно оценить с помощью метода^{Scopes 5.}

5 Подготовка перечня переходных процессов для окончательных целевых показателей

ПРИМЕЧАНИЕ: Переход относится к паре прекурсоров (Q1) к продукту (Q3) m/z значений в эксперименте MRM. Пептид может иметь от одного до многих переходов, с одинаковым значением Q1, но разными значениями Q3. Тройной квадрупольный масс-спектрометр требует информации о переходах для обнаружения пептидов и их продуктов. Следовательно, прежде чем начать целевой эксперимент, необходимо подготовить список переходов. Это можно сделать с помощью онлайн-репозитория SRMAtlas⁶ (https://db.systemsbiology.net/sbeams/cgi/PeptideAtlas/GetTransitions) или программного обеспечения с открытым исходным кодом под названием Skyline⁷ (https://skyline.ms/project/home/software/Skyline/begin.view).

1. Загрузите недавний файл FASTA протеома человека из UniProt (https://www.uniprot.org/) и создайте фоновый файл протеома, вставив его в Skyline. В настройках пептидов перейдите в раскрывающийся список Фоновый протеом и нажмите Добавить. Лента в файле последовательности FASTA протеома человека. Убедитесь, что выбрана эта база данных и значение разрешенного пропущенного расщепления установлено в 0, прежде чем переходить к следующему шагу.
2. Теперь под вкладкой Фильтр в настройках пептидов разграничьйте длину принимаемых пептидов от 8 до 25 аминокислот.
3. В разделе Параметры переходана вкладке Фильтр установите для параметра Сборы прекурсоров значение 2,3, для параметра Ионные заряды — значение 1 и для параметра Типы ионов значение y. Ионы продукта могут быть выбраны в зависимости от выбора пользователя. Выберите N-терминал для пролин для специальных ионов и оставьте все остальные параметры по умолчанию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки пептида и перехода могут варьироваться в зависимости от эксперимента.
4. Вставьте интересующие пептиды или белки, нажав на Edit и перейдя к Insert. Чтобы вставить белки, скопируйте их идентификаторы присоединения и вставьте конкретные пептиды, скопируйте пептидные последовательности. Программное обеспечение сопоставляет идентификаторы присоединения с фоновым протеомом, а список переходов создается на основе настроек пептида и перехода.
5. Экспортируйте список переходов. Убедитесь, что в раскрывающемся списка Тип инструментавыбран правильный инструмент. Для экспериментов по оптимизации можно разделить списки переходов на более мелкие числа, установив желаемое количество переходов на файл в Skyline. Это гарантирует, что инструмент не будет перегружен для экранировать слишком много переходов за один прогон. Количество переходов необходимо дополнительно оптимизировать, чтобы получить один метод - об этом мы упоминаем далее в разделе уточнения метода.

6 LC параметров

1. Используйте бинарную систему растворителей с водным растворителем, содержащим 0,1% FA (растворитель A), и органическим растворителем, содержащим 80% ACN (растворитель B).
2. Установите температуру колонки на 45 °C.
3. Установите градиент LC 10 мин с расходом 450 мкл/мин (как показано в таблице S1).

7 параметров MS

ПРИМЕЧАНИЕ: Объясненный анализ был разработан и оптимизирован для тройного квадрупольного масс-спектрометра TSQ Altis.

1. Оптимизируйте параметры выполнения, такие как разрешение Q1 и Q3, время ожидания и время цикла - по одному параметру за раз. Мы считаем, что разрешение 0,7 для Q1 и Q3 работает лучше всего. Время цикла или время выдержки, возможно, потребуется настроить в соответствии с количеством переходов и средней пиковой шириной контролируемых пептидов.
2. Используйте параметры MS в таблице S2 и таблице S3. Общая продолжительность метода составляет 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры остаются неизменными для всех запусков во время и после уточнения метода, если не указано иное. Для нового эксперимента может возникнуть необходимость в изменении определенных параметров в зависимости от типа образца и этапов обработки образца.

8 Последовательность выполнения и контроля качества инструмента

1. Готовят смесь из воды: метанол: изопропанол: ацетонитрил в соотношении 1:1:1:1. Используйте эту смесь в качестве заготовки.
2. Подготовьте пептиды для любого стандартного образца, который может быть использован для последовательного мониторинга производительности инструмента. Это будет использоваться в качестве стандарта контроля качества. Мы обнаруживаем пептиды из дигестов BSA, которые были оптимизированы и дают хороший и последовательный ответ в течение несколькихдней (рисунок 2).
3. Для запуска образцов последовательность должна начинаться с пары пробелов, за которыми следуют стандартные образцы QC и клинические образцы. Всегда следите за тем, чтобы между двумя последовательными образцами была одна заготовка.
4. Для удобства сравнения убедитесь, что каждый раз вводятся равные количества и объемы каждого образца.

9 Уточнение метода

1. Проанализируйте предварительные данные, полученные из объединенных образцов с помощью Skyline. Ищите правильный пик, переходы и параметры, такие как форма пика и интенсивность, чтобы выбрать наилучшие результаты. Сохраните файл как новый проект Skyline.
2. Используйте библиотеку, чтобы найти наиболее подходящий пик и, следовательно, наилучший возможный список переходов. Библиотека представляет собой набор пиков MS / MS, доступных из литературы или домашних экспериментов.
3. Экспортируйте новый список переходов из недавно сохраненного проекта Skyline и используйте этот список переходов, чтобы создать новый метод. Получите данные из нового созданного метода и повторите процесс уточнения переходов с помощью Skyline.
4. После того, как список пептидов и переходов будет завершен после анализа данных с использованием Skyline, настройте метод, опробовав различные перестановки времени цикла и времени ожидания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование тяжелых меченых синтетических пептидов и пептидов с индексируемым временем удержания (iRT) облегчает уточнение метода^8,9. Поэтому желательно, чтобы тонкая настройка метода была выполнена с использованием этих пептидов.
5. Используя сведения о времени хранения из экспериментов по уточнению, создайте запланированный окончательный метод (имеющий определенное окно сбора).
6. Подготовьте образцы для отдельных субъектов. Данные будут получены для этих образцов с использованием окончательного запланированного метода.
7. После получения данных можно выполнить дальнейший анализ и групповое сравнение путем импорта необработанных файлов в Skyline.

Результаты

Мы провели относительную количественную оценку 3 белков из 10 образцов, по 5 образцов из каждой группы пациентов с аномалиями в головном мозге. Эти белки включали аполипопротеин A-I (APOA-I), виментин (VIM) и никотинамидфосфорибозилтрансферазу (NAMPT), которые, как известно, выполняют различные ро?...

Обсуждение

Такие методы, как иммуногистохимия и вестерн-блоттинг, считались золотыми стандартами для проверки белковых мишеней в течение многих лет. Эти методы находят применение даже сегодня с незначительными изменениями в протоколе и небольшой зависимостью от технологии, что делает их очень ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
TSQ Altis mass spectrometer	Thermo	TSQ02-10002
uHPLC - Vanquish	Thermo	VQF01-20001
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110