Регистрация внутрикавернозного давления на модели крысы с повреждением кавернозного нерва

Резюме

Этот протокол описывает разработку стабильной модели радикальной простатэктомии с двусторонним повреждением кавернозного нерва, связанной с эректильной дисфункцией и измерением внутрикавернозного давления.

Аннотация

Модель двустороннего повреждения кавернозного нерва (КН) крысы широко использовалась для моделирования клинического повреждения кавернозного нерва, связанного с эректильной дисфункцией (ЭД), для оценки эффекта клинических терапевтических методов. Тем не менее, методы построения модели травмы КН несовершенны и разнообразны в области исследований ОНП. Именно травма ЦН является наиболее часто используемым методом в последние годы. Целью данного исследования является подробное описание процедуры построения модели двусторонней травмы ЦНС крысы и измерения регистрации внутрикавернозного давления (ВЧД), что позволяет получить надежную и воспроизводимую модель травмы крысы. В данной работе успешно разработан метод травмы ЦН при раздавливании гемостата с использованием иглы шприца в качестве жесткой опоры и гемостата с резиновой втулкой. Кроме того, этот метод позволяет сделать вывод о том, что напряжение 1,0 В, частота 20 Гц и ширина импульса 5 мс являются оптимизированными параметрами стимуляции для регистрации ВЧД в модели двусторонней травмы ЦН.

Введение

ЭД является одним из распространенных заболеваний у взрослых мужчин. По оценкам, к 2025 году число пациентов с ЭД в мире достигнет 322 миллионов^1. Одно многоцентровое обширное выборочное обследование в Китае показывает, что доля ЭД, вызванной операциями на органах малого таза или травмами, составляет около 8%². Несмотря на постоянное совершенствование хирургических техник и хирургических инструментов, заболеваемость ЭД все еще остается высокой. Считается, что развитие и прогрессирование ЭД после нервосберегающей радикальной простатэктомии (РП) способствует повреждению кавернозного нерва, приводящему к атрофии гладкой мускулатуры кавернозного тела, апоптозу эндотелиальных клеток и патологическому ремоделированию ^3,4.

Для изучения механизма гемодинамики и гистопатологических изменений повреждения ЦН, связанного с ЭД, было разработано и оценено несколько различных типов животных моделей повреждения ЦН, включая грызунов, собак, кошек и обезьян ^5,6,7. Основываясь на преимуществах в затратах и воспроизводимости, двусторонняя модель травмы ЦНС на крысе стала наиболее распространенной моделью для оценки ЭД после радикальной хирургии таза⁸. Тем не менее, в многочисленных литературных работах сообщалось о различных формах повреждения нервов, принципиальные различия которых заключаются в подходах к повреждению нервов (раздавливание, замораживание, пересечение и иссечение)^9,10,11. Кроме того, разнообразие подходов к повреждению нервов может привести к несогласованности параметров регистрации внутрикавернозного давления (ВЧД) в модели крысы, что определяет точность и оценку ВЧД⁸. Тем не менее, стандартизированного метода индуцирования повреждения нерва и регистрации ВЧД модели пока не существует.

Таким образом, данное исследование направлено на построение более надежной и воспроизводимой модели двусторонней травмы крысы при ЦН. Этот метод дает подробное описание процедуры построения модели и измерения ВЧД, что может быть полезно для изучения механизмов ЭД и разработки эффективных методов лечения в будущем.

протокол

В этом исследовании использовались пятнадцать взрослых самцов крыс породы Спрэг-Доули (в возрасте 3 месяцев) весом от 300 до 350 г. Все процедуры на животных проводились в соответствии с Рекомендациями NIH по уходу и использованию лабораторных животных и с одобрения Комитета по уходу за животными и их использованию в пятой аффилированной больнице Университета Сунь Ятсена. Животные были размещены в комфортабельном помещении с контролируемой температурой и освещением.

1. Материалы подготовки к хирургической процедуре

1. Подготовьте следующие инструменты: скальпель, тканевые ножницы, нитевые ножницы, изгибающие щипцы, тканевые щипцы, микрохирургические щипцы, кровоостанавливающие щипцы от комаров Хартмана, стерильные хирургические листы, держатель микроигл, крысиные абдоминальные ретракторы, а также систему сбора и обработки биологических сигналов (см. Таблицу материалов).
   1. Перед операцией простерилизовать все хирургические инструменты. Используйте спиртовые салфетки (70% этанол) для очистки области операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические инструменты должны быть стерилизованы путем погружения спиртом в течение ночи.
2. Подготовьте систему регистрации давления
   1. Подсоедините шприц объемом 10 мл, содержащий гепариновый физиологический раствор, и иглу для подкожных инъекций 25 G к 3-ходовому запорному крану с трубкой (длиной 20 см). Промойте стерилизованную трубку стерильным гепариновым раствором (200 Ед/мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заполнение пробирки гепариновым физиологическим раствором позволяет избежать попадания пузырьков воздуха в систему.
3. Поднимите иглу 25 G на 20 см (как раз на длину трубки) над рабочей площадкой животного. Затем проверьте точность измерения системы регистрации давления с помощью промывки или постукивания.

2. Подготовка животного

1. Обезболивание крыс путем внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия (60 мг/кг) (см. Таблицу материалов).
   Примечание: Для подтверждения достаточной глубины анестезии была проведена оценка ритма спонтанного дыхания и рефлексов крысы путем защемления задней лапы.
2. Наносите мазь на двусторонние глаза, чтобы избежать сухости роговицы.
3. После подтверждения правильной анестезии побрейте нижнюю половину живота, шею и промежность с помощью электробритвы. Положите крысу в лежачем положении на грелку (37 °C). Надевайте медицинские перчатки для поддержания стерильных условий во время хирургических процедур.

3. Изоляция ЦНС и процедура травмирования

1. С помощью скальпеля сделайте 4-сантиметровый разрез через кожу по нижней, средней линии живота. Чтобы полностью обнажить мочевой пузырь и простату, используйте тканевые ножницы и тканевые щипцы, чтобы сделать надлежащий разрез через подкожную фасцию, мышечную ткань и брюшину.
2. Используйте абдоминальный ретрактор крысы для увеличения карты операционного поля. Используйте впитывающие ватные палочки, чтобы отделить простату от прилегающих тканей, таких как связки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большой тазовый ганглий (МПГ) и КН могут быть обнаружены в одной из двух дорсолатеральных областей предстательной железы.
3. С помощью угловых микроножниц надрежьте фасцию, расположенную над CN на 1-6 мм дистальнее MPG. Затем наложите шов 9-0 под ЦН с помощью микрохирургических щипцов.
4. Поместите иглу шприца (25 G) под ЦН, на 5 мм дистальнее МПГ. Затем поставьте гемостат в светлую структуру сэндвича «наконечник гемостата-игла шприца-нерв-наконечник гемостата» (рисунок 1 и рисунок 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Игла шприца должна быть отшлифована.
5. Нанесите гемостат с полным закрытием кончика на расстоянии 5 мм от ганглия на 1 мин, затем извлеките гемостат и иглу шприца (рис. 2).
6. Слегка приподнимите нерв с помощью шва 9-0 и поместите крючки биполярного электрода (см. Таблицу материалов) вокруг CN на 2-4 мм дистальнее MPG (Рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Две пары MPG и CN работали одинаково.

4. Катетеризация кавернозного тела и стимуляция КН для измерения ВЧД

1. Промойте трубку стерильным гепариновым физиологическим раствором (200 Ед/мл) перед введением его в кавернозное тело.
2. Удерживайте иглу 25 G и держите направление вставки параллельно ходу кавернозного тела (Рисунок 3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Белочная оболочка должна быть растянута для облегчения введения.
3. Введите иглу 25 G на 6 мм в кавернозное тело (рисунок 3). Промойте трубку и слегка надавите на кавернозное тело, чтобы оценить чувствительность датчика (Рисунок 4). Чтобы предотвратить случайное падение, зафиксируйте трубу на рабочем столе скотчем.
4. Для стимуляции КН используют следующие параметры: напряжение 1,0 В, частота 20 Гц, длительность импульса 5 мс. Применяйте 1 минуту стимуляции с 5 минутами отдыха между следующей стимуляцией.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поверните 3-позиционный запорный кран в сторону канала датчика давления при начале измерения.

5. Послеоперационный уход

1. Положите крыс на подогретую подушку (37 °C) и внимательно следите за ними для восстановления после анестезии.
2. Для послеоперационного контроля боли дайте нестероидные противовоспалительные препараты (такие как карпрофен, 0,5 мг/кг, подкожное введение) (см. Таблицу материалов), когда крысы полностью выздоровеют.
3. Переместите крыс в асептическую клетку и наблюдайте за ними в течение 2 дней, чтобы оценить состояние питания послеоперационной раны, психическое состояние и инфекцию.

Результаты

В ходе хирургической процедуры была получена типичная кривая ответа ВЧД с использованием этого протокола с рекомендуемыми настройками стимуляции. Кривая реакции ВЧД мгновенно повышается при стимуляции нерва и снижается при прекращении стимуляции (Рисун...

Обсуждение

ЭД является тяжелым осложнением операции на органах малого таза или травмы. Несмотря на проведение нервосберегающей операции, частота возникновения ЭД при радикальной простатэктомии (^{РП) составляет} примерно 14-90%. Из-за проблемной регенерации травмы КН к?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
25 G needle	BD Bioscience	367391
Abdominal retractor	RWD Life Science	R22009-01
Animal operating pad	Provided by Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Bending forceps	RWD Life Science	F12011-10
Biological signal acquisition and processing system	Techman Software	BL-420S
Bipolar electrode	Techman Software	AC0047
Carprofen	Sigma-Aldrich	MFCD00079028
HARTMAN mosquito hemostatic forceps	RWD Life Science	F22002-10
Heparin	Shanghai Aladdin Biochemical Technology	2608411
Micro needle holder	RWD Life Science	F31047-12
Microsurgery forceps	RWD Life Science	F11001-11
Scalpel	RWD Life Science	S32003-12
Sodium pentobarbital	Guangdong Provincial Key Laboratory of Biomedical Imaging	NA
Sprague–Dawley rat	Guangdong Medical Laboratory Animal Center	GDMLAC-035
Thread scissors	RWD Life Science	S15001-11
Tissue forceps	RWD Life Science	F13019-12
Tissue scissors	RWD Life Science	S13029-14