Контраст трех методов инокуляции, используемых для определения расы неизвестных Fusarium oxysporum f.sp. нивеум Изолирует

Резюме

Управление фузариозным увяданием арбуза требует знания присутствующих рас патогенов. Здесь мы описываем методы посева корневых, зараженных ядер и модифицированных методов посева в лоток, чтобы продемонстрировать их эффективность в расовом типировании патогенного гриба Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Аннотация

Фузариозное увядание арбуза (Citrullus lanatus), вызванное Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), вновь появилось в качестве основного производственного ограничения в юго-восточной США, особенно во Флориде. Внедрение комплексных стратегий борьбы с вредителями, таких как устойчивые к расе сорта, требует информации о разнообразии и плотности популяции патогена на полях производителей. Несмотря на некоторый прогресс в разработке молекулярных диагностических инструментов для идентификации изолятов патогенов, определение расы часто требует подходов к биоанализу.

Типирование расы проводилось методом корневой прививки, метода зараженного ядра и модифицированного метода погружения в лоток с каждым из четырех арбузных дифференциалов (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Изолятам присваивается обозначение расы путем расчета заболеваемости через пять недель после прививки. Если менее 33% растений для конкретного сорта были симптоматическими, они были классифицированы как устойчивые. Те сорта, у которых заболеваемость превышает 33%, были признаны восприимчивыми. В этой статье описываются три различных метода инокуляции для определения расы, корнеплодства, зараженного ядра и модифицированной прививки в лотке, применение которых варьируется в зависимости от экспериментального проекта.

Введение

Почвенные грибы, входящие в состав видового комплекса Fusarium oxysporum (FOSC), являются эффективными гемибиотрофными патогенами растений, которые могут вызывать серьезные заболевания и потерю урожая в различных культурах¹. Фузариозное увядание арбуза, вызванное F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), за последние несколько десятилетий увеличилось по масштабам, заболеваемости и тяжести во всем мире ^2,3. У рассады симптомы фузариозного увядания часто напоминают затухание. У старых растений листва становится серой, хлоротической и некротической. В конце концов, увядание растений прогрессирует до полного коллапса растений и смерти⁴. Прямая потеря урожая происходит из-за симптомов и гибели растений, в то время как косвенная потеря урожая может произойти из-за повреждения солнцем, вызванного устранением листового полога⁵. Половое размножение и связанные с ним репродуктивные структуры никогда не наблюдались у F. oxysporum. Однако патоген продуцирует два типа бесполодных спор, микро- и макроконидии, а также более крупные, долгосрочные структуры выживания, называемые хламидоспорами, которые могут выживать в почве в течение многих лет⁶.

FOSC классифицируется на специальные formae на основе наблюдаемых диапазонов хозяев, обычно ограниченных одним или несколькими видами-хозяевами¹. Хотя недавние исследования показали, что этот видовой комплекс может состоять из 15 различных видов, конкретные виды, которые заражают арбуз, в настоящее время неизвестны⁷. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) — название групп штаммов, которые заражают исключительно Citrullus lanatus или одомашненный арбуз ^8,9. Штаммы F. oxysporum в большинстве патогенных специальных форм демонстрируют определенные уровни разнообразия в отношении их генетических компонентов и вирулентности по отношению к виду-хозяину. Например, один штамм может инфицировать все сорта хозяина, в то время как другой может заражать только более восприимчивые сорта. Чтобы учесть такие вариации, эти группы неофициально классифицируются по расам на основе эволюционных отношений или общих фенотипических характеристик. В пределах Фона четыре расы (0, 1, 2 и 3) были охарактеризованы на основе их патогенности по отношению к набору избранных сортов арбуза, причем открытие расы 3 произошло недавно¹⁰.

Несмотря на это кажущееся разнообразие, морфологии спор или гиф не различимы между расами фон, а это означает, что молекулярные или фенотипические анализы необходимы для идентификации уникальной расы^{изолята 11}. Молекулярные исследования выявили некоторые генетические различия. Например, роль эффекторов Secreted in Xylem (SIX) изучалась в течение многих лет у F. oxysporum, и некоторые из этих эффекторов были расположены на хромосомах, которыми обменивались во время горизонтального переноса генов¹². Например, SIX6 встречается в гонках Фон 0 и 1, но не в гонках 2¹³. ШЕСТЬ эффекторов были вовлечены в патогенность F. oxysporum f. sp. lycopersici и F. oxysporum f. sp. cubense, которые вызывают увядание Fusarium на помидорах и бананах соответственно 14,15,16,17. Анализ SIX эффекторных профилей среди штаммов F. oxysporum f. sp. spiniciae, патогена Fusarium wilt на шпинате, позволил классифицировать, который точно отражает генетическое и фенотипическое разнообразие¹⁸. Однако различия между механизмами вирулентности рас фон в настоящее время не совсем понятны, а молекулярные анализы, разработанные при их использовании, показали противоречивые и неточные результаты¹⁹. Таким образом, фенотипические результаты анализов инфекции в настоящее время являются лучшим способом классификации изолятов.

F. oxysporum первоначально заражает хозяев через корни, прежде чем пробиться вверх по ксилеме²⁰. Это делает прямую прививку корней данного сорта хозяина эффективным способом выполнения расового типирования и является основой методов корневой и лотковой инокуляции²¹. Когда F. oxysporum не заражает хозяина, он находится в почве и может оставаться в состоянии покоя в течение многих лет. Выращивание восприимчивых сортов арбуза в почве из области интересов является одним из способов проверки на наличие фона. Расширение этого метода за счет включения сортов различных известных уровней устойчивости в почве, которая преднамеренно заражена фоном, также является хорошим способом выполнения расового типирования (таблица 1) и является основой метода посева зараженных ядрами. Модифицированный метод погружения в лоток представляет собой вариацию оригинального метода погружения в лоток, который позволяет быстро исследовать много растений и полевых изолятов, где можно быстро исследовать многие растения и полевые изоляты²². Важными факторами быстрого и успешного биоанализа расового типирования являются использование сортов, которые имеют документально подтвержденные различия в устойчивости к различным расам патогенов, обеспечение того, чтобы инокулят был биологически активным и обильным во время инфекции, поддержание среды, благоприятной как для патогена, так и для хозяина, и использование последовательной системы оценки тяжести или заболеваемости. В настоящем документе описываются корнеплодные^23,24, зараженные ядра^25,26 и модифицированные методы погружения в лоток²² для фенотипического расового типирования, основанные на принципах, описанных выше.

протокол

1. Определение расы методом root-dip (RDM)

1. Подготовка экспериментальной среды
   1. Поскольку выраженность симптомов сильно зависит от условий окружающей среды, поддерживайте растения в контролируемой зоне. Мониторинг относительной влажности, температуры, фотопериода и интенсивности света (рисунок 1).
      1. Установите температуру 26-28 °C, относительную влажность до 50-75% и установите 16-часовой фотопериод для обеспечения адекватного роста и здоровья растений.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения гипоксии, увядания рассады и/или гниения семян не переувлажняйте и не допускайте стоячей воды вокруг рассады.
      2. Используйте две люминесцентные лампы, каждая с не менее чем 1850 люменами света и цветовой температурой 2 800 К на банк света для поддержки роста фотосинтеза.
      3. Держите территорию в чистоте и используйте гигиенические методы, включая удаление отходов почвы и растительного мусора, чтобы предотвратить повреждение вредителями и случайные инфекции.
   2. Условия посадки
      1. Заполните 8 x 16 ячеек (ширина 25 см x длина 50 см), начиная с посадочной среды, и постучите вниз, чтобы слегка сжать почву (рисунок 2).
      2. Получите семена четырех различных сортов: Black Diamond/Sugar Baby, Charleston Grey/Allsweet/Dixielee, Calhoun Grey и PI-296341-FR.
      3. Сейте семена с их верхушкой (заостренным концом), направленной вверх на глубину, равную их длине. После того, как семена посеяны, засыпьте среду, содержащую захороненные семена, 100% Землей Фуллера или другой бентонитовой глиной, альтернативной глубине 0,3175-0,635 см.
      4. Опламляйте квартиры, чтобы смочить среду, не создавая стоячей или сливающейся воды. После этого держите среду влажной, запотевая в течение 20 с каждые 180 минут или поливая вручную один раз в день до прорастания семян в течение примерно 5 дней. После прорастания поливайте один раз в день и по мере необходимости поддерживать рост рассады.
   3. Подготовка СМИ
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обе среды изготовлены твердыми с дополнительным гранулированным агаром, чтобы обеспечить сбор спор путем соскабливания поверхности.
      1. Осветленная среда сока V8 (V8)
         1. Приготовьте 500 мл осветленного сока V8 (V8)²⁷ , добавив 100 мл осветленного V8 оригинального 100% овощного сока с 1% CaCO₃ до 400 мл дистиллированной воды.
         2. Добавить 7,5 г гранулированного агара.
         3. Хорошо перемешайте ингредиенты, автоклав и дайте остыть до 50 °C перед выливанием в стерильные чашки Петри.
      2. Четверть крепости картофеля декстроза агар среды (qPDA)
         1. Приготовьте среду qPDA, добавив 4,5 г гранулированного агара в 500 мл дистиллированной воды, добавьте 3,8 г агара декстрозы картофеля.
         2. Хорошо перемешайте ингредиенты, автоклав и дайте остыть до 50 °C, прежде чем вылить 12-15 мл в стерильные чашки Петри.
2. Подготовка экспериментальных методов лечения
   1. Подготовьте инокулятор.
      1. Через пять дней после посадки (dpp) поместите инфильтрированные бумажные диски (диаметром 1-1,25 см), содержащие предпочтительный изолят F. oxysporum , на одну пластину V8 и одну qPDA и храните их в инкубаторе (~28 °C) в течение восьми дней²⁸ (рисунок 3A).
      2. На восьмой день роста грибков и за день до прививки (см. раздел 1.3.2) перенесите пластины V8 и qPDA из инкубатора в шкаф биобезопасности.
      3. Для каждого изолята нанесите 6 мл стерилизованной деионизированной воды на каждую культуральную пластину V8 и qPDA.
      4. Вытесните конидии путем соскабливания стерильного клеточного распределителя по поверхности среды (рисунок 3B). Сложите жидкую конидиальную суспензию и переложите ее в стерильную культуральную трубку объемом 50 мл (рисунок 3C).
      5. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока общий объем конидиальной суспензии жидкости в культуральной трубке объемом 50 мл не составит приблизительно 12 мл.
      6. Прежде чем перейти к другому изоляту, на поверхность стерилизуйте рабочую зону и разбрасыватель клеток спиртом. Стерилизуйте клеточный распределитель, пропуская его через горелку Бунзена после погружения в ≥70% этанол.
      7. После того, как жидкие конидиальные суспензии были перенесены в культуральные трубки для всех изолятов, количественно оцените количество спор. Во-первых, вихрьте индивидуальную культуральную трубку объемом 50 мл и дозируйте 10 мкл в каждую камеру гемацитометра. Затем рассчитайте количество спор в гемацитометре, как описано ранее²⁹.
      8. Готовят окончательный раствор инокулята путем переноса расчетного объема на 10⁶ +10% в другую стерильную культуральную трубку и доводят общий объем до 30 мл путем добавления стерильной деионизированной воды.
      9. Храните эти культуральные тубы в течение ночи при температуре 8 ± 1 °C.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать без потери конидиальной жизнеспособности, о чем свидетельствуют неопубликованные данные.
3. Прививка
   1. Подготовьте прививку.
      1. Перед днем прививки плотно поливайте тринадцатидневную рассаду до несущей способности почвы.
      2. Предварительно обозначьте колья соответствующей информацией, включая изолят, подлежащий испытанию, сорт арбуза и дату прививки.
      3. Поместите 6 х 12-ячеек (20 см шириной х 40 см длиной) пенопластовых плоских, предварительно продезинфицированных 10% отбеливателем и хорошо промытых, для получения привитых растений.
      4. Предварительное размещение всех необходимых материалов (см. Таблицу материалов).
   2. Прививайте корни растений.
      1. Сильно поливайте растения за несколько часов до начала прививки. По крайней мере, через 2 ч после полива удалите растения из 8 x 16-клеточных пенопластовых плоскостей и промойте их корни, чтобы удалить любые прилипшие частицы посадочного материала.
      2. Временно храните промытые растения в чистых контейнерах с водопроводной водой до использования, сохраняя сорта отдельно друг от друга (рисунок 4А). Разделите растения на группы по шесть особей и держите группы саженцев завернутыми во влажные бумажные полотенца на лабораторном лотке, чтобы предотвратить высыхание.
      3. Поместите 25-30^см3 почвы на дно каждой ячейки лотка из пенополистирола размером 6 х 12 и используйте бутылку для брызг, чтобы намочить почву, пока она не станет заметно влажной.
      4. Прививайте растения и пересаживайте их в соответствии с сортом, так что слева направо высаживаются Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, а затем PI 296341 01 FR.
      5. Начиная со здорового контроля, поместите группу из шести неповрежденных саженцев того же сорта в трубки объемом 50 мл, содержащие инокулятив. В случае здорового контроля используйте водопроводную воду вместо споровой суспензии. Прививайте растения с положительным контролем (Fon race 3) последним.
      6. Оказавшись внутри трубки, убедитесь, что корни растения достигают и подвергаются воздействию инокулята (водопроводной воды).
      7. Вихрь трубок с корнями растений погружен в воду на 30 с (рисунок 4В). После вихря поместите одну сеялку на клетку в квартиры из пенополистирола размером 6 x 12. Поместите растения того же сорта в одну колонну в лотке.
      8. После помещения продезинфицируйте руки в перчатках, держа их в ведрах по 0,7% доступному раствору хлора в течение 30 с последующим промывкой водопроводной водой в течение 1 мин.
      9. После этого накройте уложенные растения посадочной средой и аккуратно засыпьте. Используя шприц или пипетку, тщательно поливайте растения 20 мл на растение, избегая брызг.
      10. Прежде чем приступить к следующему набору растений, снова продезинфицируйте руки в перчатках, используя раствор хлора и промывку водопроводной водой.
      11. После того, как все растения были пересажены, полейте их снова минимально, чтобы предотвратить сток инокулята.
      12. Держите растения на ночь в закрытой, темной среде со средней температурой 27 °C. На следующий день перенесите растения в теплицу, поддерживая среднюю температуру на уровне 27 °C.
4. Уход и уход за инокулированными растениями
   1. Чтобы предотвратить переполнение излишков воды, слегка поливайте квартиры три раза в день в течение 4-5 дней, пока растения не стабилизируются.
   2. Проверяйте лотки 2-3 раза в день в течение не менее трех дней, чтобы обеспечить адекватное и равномерное покрытие поливом.
   3. Избегайте высыхания из-за солнечного света или затенения, вращая квартиры и / или обеспечивая дополнительное затенение / полив по мере необходимости.
   4. При 3 дпп удобряют растения удобрением быстрого высвобождения 20-20-20 (10 г/3,78 л) из расчета 3-6 мл на литр воды.
   5. Удобрять еженедельно в течение 3-4 недель.
   6. Поддерживайте одинаковое освещение и условия окружающей среды на протяжении всего этого этапа.

2. Определение расы методом зараженного ядра (IKM)

1. Заражение ядрами
   1. Подготовьте инокулятор.
      1. Либо из сохраненного, либо из недавно собранного образца выделяют и культивируют интересующий штамм F. oxysporum f. sp. niveum на пластине qPDA до такой степени, что его рост покрывает половину пластины.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Это демонстрирует, что он активен и жизнеспособен, что необходимо для существенного заражения зерна на более поздних этапах.
   2. Подготовьте ядра.
      1. По шкале отмерьте 200 г ягод ржи (Secale spp.) (или ядер пшеницы Maxie var. (Triticum spp.) в любой достаточно большой емкости и вылейте их в одну или несколько стеклянных колб Эрленмейера объемом 1 л. Добавьте стерильную водопроводную воду в колбы, чтобы полностью покрыть зерна до не менее 5 см (рисунок 5А).
      2. Замочите ядра при комнатной температуре (~24 °C) в течение 2 ч. Слейте воду из колб; заткнуть отверстие куском ватного рулета, завернутым в марлю; и закройте отверстие алюминиевой фольгой (рисунок 5В).
   3. Обеззараживайте ядра. После того, как зерно впитало воду, автоклавируйте его дважды двумя различными способами, чтобы убить другие нежелательные микробы перед посевом.
      1. В первый раз автоклавируют зерно в подготовленные колбы по гравитационному циклу (121,2 °C, 1,06 кг/^см2) в течение 1 ч с 5 мин времени высыхания. Дайте колбам остыть до комнатной температуры.
      2. Перед автоклавированием во второй раз переложите зерна в небольшой грибной мешок с фильтром 0,5 мкм. Извлеките воздух из пакета, а затем сложите лишний пластик вокруг пакета.
      3. Поместите пакет в пластиковую автоклавно-безопасную корзину. Накройте бункер алюминиевой фольгой (рисунок 5C).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте металлический бункер при автоклавировании зерен в мешках, так как это может привести к расплавлению пакетов.
      4. Автоклав бункера на гравитационном цикле в течение 1 ч с 5 мин времени высыхания, тот же цикл, что и раньше.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Только автоклав сумки во второй раз, а не в первый, так как фильтр и порт могут быть скомпрометированы, если мешки автоклавированы дважды. Предотвратите конденсацию на фильтре, позволив мешкам медленно и полностью остыть, прежде чем удалять их из автоклава, потому что фильтр для растущих мешков будет скомпрометирован, если он намокнет.
   4. Привить ядра.
      1. Работая с культуральной пластиной и мешком в шкафу биобезопасности, вырезайте диски агара диаметром 6 мм из зоны активного роста на культуральной пластине со стерильным пробковым отверстием размером No4. Разверните сумку. Используя строгую стерильную технику, поместите в мешок 5 агаровых дисков. Используйте стерильный градуированный цилиндр объемом 50 мл, чтобы измерить 35 мл стерильной водопроводной воды и добавить его в пакет.
      2. Несколько сверните отверстие пакета, а затем опрыскивайте снаружи 70% этанолом для поверхностной стерилизации.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не распыляйте фильтр, так как эта влага также поставит его под угрозу.
      3. Закройте мешок, сложив углы к центру, а затем дважды над фильтром. Закрепите сумку с помощью зажимов для мешков и прозрачной виниловой трубки, предоставленной производителем.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Зажимы являются многоразовыми.
      4. Извлеките пакет из шкафа биобезопасности.
   5. Храните возбудителя для роста.
      1. Храните сумку в вертикальном положении. Убедитесь, что фильтр оттянут от противоположной стороны мешка, чтобы обеспечить максимальный газообмен (рисунок 5D).
      2. Инкубируйте материалы при комнатной температуре в течение примерно трех недель. Регулярно перераспределяйте зерна, чтобы обеспечить равномерный рост возбудителя.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Сумки не подлежат многоразовому использованию.
2. Заражение рассады арбуза зараженным зерном
   1. Источник семян арбуза, как описано ранее.
   2. Определите экспериментальные группы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Единственным штаммом (штаммами) патогена являются изоляты, которые тестируются для расовой идентификации. Тем не менее, отрицательный и позитивный контроль поможет провести сравнение с растениями без инфекции или определенного уровня инфекции.
      1. Для получения отрицательного контроля используют зерна пшеницы, стерилизованные по ранее упомянутому способу, но без прививки.
      2. Для получения положительного контроля используйте зерна пшеницы, привитые уже классифицированным штаммом, для сравнения с неизвестным изолятом.
   3. Соедините почву и зерно.
      1. Измерьте 14 зерен зараженных ядер в большой полиэтиленовый пакет (рисунок 5Е). Наполните пластиковые горшки (диаметром 15 см х 10 см в высоту) горшечной смесью, чтобы измерить необходимое количество смеси. Высыпьте смесь в пакет. Создайте воздушную подушку в пакете и закрутите или запечатайте его закрытым.
      2. Смешайте ядра и почву, перевернув мешок несколько раз. Для отрицательного контроля выполните тот же процесс в другом пакете с чистыми ядрами. Для положительного контроля выполните тот же процесс в другом пакете с ядрами, зараженными сравнительным штаммом.
      3. Заполните четыре поверхностно-стерилизованных горшка зараженной почвенной смесью. Для отрицательного контроля, поместите эту смесь перед обработкой любой загрязненной фоном почвы.
   4. Посейте семена арбуза.
      1. Посейте по шесть семян в каждом горшке. Убедитесь, что каждый горшок содержит только семена одного сорта. Расположите семена верхушечным концом семени лицом вверх, чтобы обеспечить правильный рост во время всходов (рисунок 6А).
      2. С помощью баллона-распылителя смочите верхние 0,3-0,6 см почвы водой. Поместите прозрачную пластиковую посуду (диаметром 15 см) под и над каждым горшком, чтобы создать влажную среду для прорастания семян (рисунок 6B).
   5. Создание условий выращивания.
      1. Поливайте горшки три раза в день баллончиком-распылителем, чтобы сохранить тургидность без стока до тех пор, пока семена не прорастут (примерно 5 дней).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Количество используемой воды будет увеличиваться с размером растения и размером горшка.
      2. Как только семена прорастут, переместите верхнюю посуду на нижнюю сторону горшка.
      3. Поливайте растения ежедневно по мере необходимости для оптимального роста растений. Подвергайте растения 16-часовому фотопериоду при условиях освещения, аналогичных описанным ранее, и при температуре 27 °C (± 1 °C).

3. Определение расы модифицированным методом погружения в лоток (MTDM)

1. Подготовка материалов для прививок
   1. Установите условия посадки.
      1. Заполните 48-ячеечные (ширина 3,68 см x длина 5,98 см x глубина 4,69 см) вставки паровостастеризованным песком: торф: вермикулит (4:1:1) и постукивайте вниз, чтобы слегка сжать почву. Поместите вставки в пластиковые лотки (ширина 27,9 см x длина 53,3 см x глубина 5,1 см).
      2. Посейте семена с их верхушкой (проксимальным концом), направленной вверх на глубину, равную их длине.
      3. Источник семян, как описано ранее.
      4. После этого держите носитель влажным, запотевая в течение 20 с каждые 180 минут или поливая вручную один раз в день.
      5. После прорастания (примерно 5 дней) поливайте один раз в день и по мере необходимости для поддержки роста рассады.
   2. Подготовьте носитель.
      1. Готовят среду qPDA, добавляя 5,625 г гранулированного агара в 500 мл дистиллированной воды; добавить 4,875 г агара декстрозы картофеля. Хорошо перемешайте ингредиенты, автоклав и охладите до 50 °C перед заливкой в стерильные чашки Петри. Запечатайте чашки Петри парапленкой и храните пластины в холодильнике (4 °C) до использования.
      2. Для приготовления бульона взвесьте и добавьте 24 г картофельной декстрозы во флакон объемом 1 л. Доведите смесь до 1000 мл, добавив дистиллированную воду в бутылку, поместите бутылку на горячую плиту и перемешайте до растворения. Разрежьте 100 мл бульона в колбы Эрленмейера по 250 мл. Используйте марлю для запечатывания колб и автоклава.
   3. Подготовьте инокулятор.
      1. За семь дней до посадки привите пять пластин qPDA инфильтрированной бумагой²⁸ и храните их в инкубированной зоне в течение восьми дней в темном цикле²² 14 ч/10 ч.
      2. На седьмой день переложите две вилки агара^{по 1 см2} в каждую колбу Эрленмейера объемом 250 мл, содержащую 100 мл декстрозы картофеля. Поместите колбы Erlenmeyer на настольный шейкер со скоростью 200 об/мин в течение 7 дней по циклу 14 ч/10 ч света/темноты.
      3. В день посева (через 14 дней после посева) собирают споры, фильтруя инокулятив через четыре слоя стерильной марли.
      4. Определите микроконидиальную концентрацию в колбах с помощью гемоцитометра, как описано ранее. Подготовьте 7-литровую суспензию инокулята в пластиковой ванне (ширина 40,6 см x длина 67,3 см x глубина 16,8 см), переместив правильный объем споровой суспензии в стерильную воду для конечной концентрации спор 1 × 10⁶ мл⁻¹ (рисунок 7A).
2. Прививка
   1. Через четырнадцать дней после посева (по крайней мере, первая стадия истинного листа) переложите клеточные вставки с рассадой в перепончатые лотки (ширина 26,9 см x длина 53,7 см x глубина 6,28 см). Аккуратно поместите перепончатые лотки с рассадой в пластиковую ванну, содержащую 7-литровую суспензию инокулята. Прививайте каждый лоток по одному (рисунок 7B).
   2. Дайте саженцам оставаться в инокуляте нетронутым в течение 15 минут. Через 15 минут аккуратно переложите клеточные вставки, содержащие привитые саженцы, в лотки без отверстий (ширина 27,9 см x длина 53,3 см x глубина 5,1 см). Повторите эту процедуру для каждого лотка.
   3. Поместите лотки без отверстий на скамейку теплицы и поливайте по мере необходимости. Поддерживайте те же условия освещения и окружающей среды, которые описаны для биоанализа корневого погружения.

4. Рейтинг заболеваний

1. Выберите временные интервалы для оценки.
   1. Для методов корневого погружения и модифицированного погружения в лоток начните оценку через неделю после прививки растений и продолжайте еженедельно в течение еще четырех недель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объединенный набор данных будет включать пять наборов наблюдений за этот период.
   2. Используя метод ядра, начинайте рейтинги только после появления саженцев и продолжайте еженедельно в общей сложности шесть оценок.
2. Наблюдайте и рассчитывайте заболеваемость.
   1. Во время каждого рейтинга делайте цифровые снимки, чтобы задокументировать прогресс заболевания.
   2. Сообщайте о частоте увядания и гибели растений. Рассчитайте заболеваемость, взяв сумму симптоматических растений по сравнению со здоровым контролем и количество мертвых растений как долю от общего числа растений в этом сорте.
3. Проанализируйте результаты. Сравните модели заражения между сортами и между экспериментальными группами, если использовались контрольные группы.

Результаты

Эти эксперименты помогают определить относительную устойчивость обычно выращиваемых сортов (таблица 1). Эта информация затем может быть использована для руководства рекомендациями по управлению, основанными на местных популяциях Фон. Другими словами, если известно, что раса ...

Обсуждение

Были представлены три метода набора гонки. Каждый из этих методов лучше всего подходит для конкретных вопросов и экспериментальных условий. Метод инвазии ядра (заражение почвой), возможно, является более простым и прямолинейным, что делает его особенно полезным для оценки патогенности...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100% Fuller’s Earth	Sigma-Aldrich	F200-5KG
1 L glass Erlenmeyer Flask	PYREX	4980-1L
15 mL falcon tubes	Fisher Scientific	14-959-49B
50 mL graduated cylinder	Lab Safety Supply	41121805
50 mL Eppendorf Conical Tubes	Fisher Scientific	05-413-921
Aluminum foil wrap	Reynolds Wrap	720
Bleach	Walmart	587192290
Bunsen burner	Fisher Scientific	03-391-301
CaCO3	sigma-Aldrich	239216
cell spreaders	Fisher Scientific	08-100-11
Cheesecloth	Lions Services, Inc	8305-01-125-0725
Clear plastic dishes	Visions Wave	999RP6CLSS	~15 cm diameter
Clear vinyl tubing for mushroom bag clamps	Shroom Supply		6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Cotton Balls	Fisherbrand	22-456-885	Sterile
Ethanol	Fisher Chemical	A4094	100%, then combine with water to make 70% for use
Flourescent Tube Lights	MaxLume	Model T5	2800 K Color Temperature, 24'' or 48'' long
granulated agar	VWR International	90000-786
Hand-held Spray Bottle	Ability One	24122002	~0.95 L
hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-55A	Two chamber hemacytometer
Lab trays	Fisher Scientific	15-236-2A
Large, sealable plastic bags	Ziploc	430805	38 cm x 38 cm
Mister / watering can	Bar5F	B10H22
Mushroom Bag Clamp	Shroom Supply		6" for small bag, 8" for medium bag, 10" for large bag
Nitrile Gloves	Fisher Scientific	19-130-1597D
Organic Rye Berries	Shroom Supply		0.5 gallon or 25 lb bags
P1000 pipette and tips	Fisher Scientific	14-388-100
Petri dishes	Fisherbrand	FB0875713	Round, 100 mm diameter, 15 mm height
Planting media	Jolly Gardener	Pro-Line C/B
Plastic Pitcher	BrandTech	UX0600850	1 L or larger
Plastic planting pots	Neo/SCI	01-1177	~15 cm diameter and ~10 cm height
Plastic, autoclave-safe bin	Thermo Scientific	UX0601022	3 L
Quarter-strength potato dextrose agar media	Cole-Parmer	UX1420028	Use powder in combination with recipe for QPDA
Scientific Balance Scale, measuring in g	Ohaus	30208458	Any precise scale that can hold and measure 200g will work
Size #4 cork bore	Cole-Parmer	NC9585352
Small Mushroom grow bag	Shroom Supply		0.5 micron filter, also comes in medium and large sizes
Soil trowel	Walmart	563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cells)	Speedling	Model TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cells)	Speedling	Model TR128A
Syringe (5 or 10 mL)	fisher Scientific	14-829-19C
Timer	Walmart	TM-01
V8 Original 100% Vegetable Juice	Walmart	564638212
vortex	Fisher Scientific	02-215-418
Watermelon Seed - Black Diamond	Willhite Seed Inc	17
Watermelon Seed - Calhoun Gray	Holmes Seed Company	4440
Watermelon Seed - Charleston Gray	Bonnie Plants	7.15339E+11
Watermelon Seed - PI 296341-FR	Contact authors	Contact authors
Wheat Kernels (Maxie var.) (optional)	Alachua County Feed & Seed