Количественная оценка иммуноокрашенной каспазы-9 в ткани сетчатки

Резюме

Здесь представлен подробный протокол иммуногистохимии для идентификации, проверки и нацеливания функционально значимых каспаз в сложных тканях.

Аннотация

Семейство каспаз, как известно, опосредует многие клеточные пути за пределами гибели клеток, включая дифференцировку клеток, аксональное поиск путей и пролиферацию. С момента идентификации семейства протеаз гибели клеток ведется поиск инструментов для выявления и расширения функции конкретных членов семьи в развитии, здоровье и болезненных состояниях. Тем не менее, многие из коммерчески доступных в настоящее время инструментов каспазы, которые широко используются, не являются специфическими для целевой каспазы. В этом отчете мы описываем подход, который мы использовали для идентификации, проверки и нацеливания каспазы-9 в нервной системе с использованием нового ингибитора и генетических подходов с иммуногистохимическими показаниями. В частности, мы использовали нейронную ткань сетчатки в качестве модели для идентификации и проверки наличия и функции каспаз. Этот подход позволяет исследовать специфические апоптотические и неапоптотические функции каспазы-9 клеточного типа и может быть применен к другим сложным тканям и каспазам, представляющим интерес. Понимание функций каспаз может помочь расширить современные знания в клеточной биологии, а также может быть полезным для выявления потенциальных терапевтических целей из-за их участия в заболевании.

Введение

Каспазы представляют собой семейство протеаз, которые регулируют гибель клеток развития, иммунные реакции и аберрантную гибель клеток при заболевании ^1,2. Хотя хорошо известно, что члены семейства каспазы индуцируются при различных нейродегенеративных заболеваниях, понимание того, какая каспаза приводит к патологии заболевания, является более сложным³. Такие исследования требуют инструментов для выявления, характеристики и подтверждения функции отдельных членов семейства каспазы. Анализ соответствующих отдельных каспаз важен как с механистической, так и с терапевтической точки зрения, поскольку в литературе есть многочисленные исследования, свидетельствующие о различных ролях каспаз ^4,5. Таким образом, если цель состоит в том, чтобы нацелиться на каспазу при заболевании для терапевтической пользы, крайне важно иметь конкретное нацеливание на соответствующего члена (членов) семьи. Традиционные методы определения уровней каспазы в тканях включают вестерн-блоттинг и ферментативный и флуорометрический подходы ^3,6. Однако ни одна из этих мер не позволяет определить специфические для клеток уровни каспазы, и в некоторых сценариях расщепленные каспазы часто не могут быть обнаружены традиционными мерами анализа белка. Известно, что каспазы могут играть различные апоптотические и неапоптотические роли в одной и той же ткани⁷, поэтому для точного понимания путей развития и заболевания необходима тщательная характеристика клеточных специфических уровней каспазы.

Данное исследование показывает активацию и функцию каспазы в модели нейрососудистой гипоксии-ишемии - окклюзии вен сетчатки (RVO)^7,8. В сложной ткани, такой как сетчатка, существует несколько типов клеток, которые могут быть затронуты гипоксией-ишемией, индуцированной в RVO, включая глиальные клетки, нейроны и сосудистую систему⁷. У взрослой мышиной сетчатки очень мало выраженности каспаз, проявляющихся в здоровой ткани, что измерено иммуногистохимией (IHC)⁷, но это не так во время развития⁹ или в моделях заболевания сетчатки^10,11. IHC - это метод, который хорошо зарекомендовал себя в биомедицинских исследованиях и позволил валидировать заболевания и патологические цели, идентифицировать новые роли посредством пространственной локализации и количественной оценки белков. В тех случаях, когда расщепленные продукты каспазы не могут быть обнаружены с помощью вестерн-блоттинга или флуорометрического анализа, а также конкретного расположения клеток отдельных каспаз или опроса сигнальных путей каспазы через локализацию, следует использовать IHC.

Чтобы определить каспазу (каспазу), функционально значимую в RVO, IHC использовали с валидированными антителами к каспазам и клеточным маркерам. Предыдущие исследования, проведенные в лаборатории, показали, что каспаза-9 быстро активировалась в модели ишемического инсульта и ингибирования каспазы-9 высокоспецифичным ингибитором, защищенным от нейрональной дисфункции и смерти¹². Поскольку сетчатка является частью центральной нервной системы (ЦНС), она служит модельной системой для запроса и дальнейшего изучения роли каспазы-9 в нейрососудистых повреждениях¹³. С этой целью мышиная модель RVO была использована для изучения клеточного специфического местоположения и распределения каспазы-9 и ее влияния на нейрососудистое повреждение. RVO является распространенной причиной слепоты у людей трудоспособного возраста, которая является результатом повреждения сосудов¹⁴. Было установлено, что каспаза-9 экспрессировалась неапоптотическим способом в эндотелиальных клетках, но не в нейронах.

Как ткань, сетчатка имеет преимущество в том, что она визуализируется либо как плоская гора, что позволяет оценить сосудистые сети, либо как поперечные сечения, которые выделяют нейронные слои сетчатки. Количественная оценка экспрессии белка каспазы в поперечных сечениях обеспечивает контекст, в отношении которого каспаза потенциально имеет решающее значение для нейронной связности сетчатки и функции зрения путем идентификации локализации каспазы (каспазы) в сетчатке. После идентификации и валидации нацеливание на интересующую каспазу достигается с использованием индуцируемой клеточной специфической делеции идентифицированной каспазы. Для потенциальных терапевтических исследований актуальность интересующих каспаз была проверена с использованием специальных инструментов для ингибирования активированной каспазы. Для каспазы-9 использовался клеточный проникающий высокоселективный ингибитор ^7,15, Pen1-XBIR3. Для этого отчета были использованы 2-месячный мужской штамм C57BL/6J и тамоксифен-индуцируемый эндотелиальная каспаза-9 нокаут (iEC Casp9KO) с фоном C57BL/6J. Эти животные подвергались воздействию мышиной модели RVO, а C57BL/6J обрабатывали селективным ингибитором каспазы-9 Pen1-XBir3. Описанная методика может быть применена к другим моделям заболевания в центральной и периферической системах ^7,15.

протокол

Этот протокол следует заявлению Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и зрительных исследованиях. Эксперименты на грызунах были одобрены и контролировались Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Колумбийского университета.

1. Подготовка ткани сетчатки и криосечение

1. Усыпляют животных введением внутрибрюшинной анестезии (кетамин (80-100 мг/кг) и ксилазин (5-10 мг/кг)) и перфируют мышей, подвергшихся воздействию RVO (см.⁸ для деталей), 4% параформальдегидом (PFA) с помощью перистальтического насоса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ущипните животное, чтобы подтвердить глубину анестезии, прежде чем приступать к эвтаназии и перфузии. Подробности о перфузии можно найти в¹⁶.
2. Соберите глаза путем тщательной энуклеации с помощью щипцов и поместите глобус в 1 мл 4% PFA. Оставьте глаза на ночь при температуре 4 °C. Промыть глаза три раза в течение 10 мин, добавив 1 мл 1x PBS и поместив их в шейкер.
3. Погружайте глаза в 1 мл 30% сахарозы на 3 дня, пока они не осядут на дно трубки, что указывает на всасывание сахарозы.
4. Наполните глаза смесью оптимальной температуры резания с помощью шприца 30 Г до тех пор, пока глаз не станет округлым (примерно 50 мкл).
5. Вставьте глаза в криомольд с оптимальной температурой резания до тех пор, пока глаза не будут закрыты, и замерзните при -80 °C до готовности к криосекции.
6. Секция накладывала глаза на 20 мкм на стеклянные слайды с помощью криостата.
   1. Снимите блок оптимальной температуры резки с криомольда.
   2. Поместите его на криостатный патрон, добавив оптимальный компаунд температуры резки и поместив блок на патрон. Оставьте его внутри криостата, пока он не замерзнет.
   3. Продолжайте разрезать блок на 20 мкм до тех пор, пока не будет видна ткань сетчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это может быть подтверждено с помощью светового микроскопа с 30-кратным увеличением (3x объектив, 10x окуляры). Ткани можно отличить от СРЕДЫ OCT по цвету и форме.
   4. Соберите ткань сетчатки в слайды микроскопа серией из четырех секций на слайд.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемое размещение сечений сетчатки см. на рисунке 1А .
7. Пометьте слайды идентификатором, который деидентифицирует лечение и генотип.
8. Храните слайды при температуре -20 °C до окрашивания.

2. Иммуногистохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте фиксированную криоконсервированную ткань для иммуногистохимии для поддержания морфологии клеток. Выбирайте участки, которые находятся на уровне изображений оптической когерентной томографии (ОКТ), полученных in vivo⁷. Используйте первые две серии слайдов, собранных из криостата или участков от 150 мкм в ткань сетчатки.

1. Поместите горки в темную и влажную скользящую камеру.
2. Пермеабилизация и блокировка: Промыть поперечные сечения сетчатки 300 мкл 1x PBS в течение 5 минут, чтобы удалить OCT и выбросить после.
3. Пермеабилизируют ткань путем добавления 300 мкл 1x PBS с 0,1% Triton X-100 в течение 2 ч при комнатной температуре (RT) и выбрасывают после.
4. Блокируйте ткань, добавляя 300 мкл блокирующего буфера (10% нормальной козьей сыворотки (NGS), 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в 1x PBS, отфильтрованный) и оставьте на ночь при 4 °C.
5. Первичные антитела: Разбавляют первичные антитела в блокирующем буфере. Первичные используемые антитела включают анти-cl-каспазу-9 в 1:800, анти-CD31 в 1:50 и антикаспазу-7-488 (прямо меченое антитело) в 1:150.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте рекомендациям производителя для соответствующего разведения первичных антител.
   1. Вылейте блокирующий буфер с участков и нанесите 100 мкл коктейля первичных антител на слайды сетчатки.
   2. Инкубировать поперечные сечения в течение ночи при 4 °C.
6. Промыть секции четыре раза в течение 5 мин с 300 мкл 1x PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если участки тканей очень хрупкие, промывки следует удалять с помощью капиллярного действия, прикладывая ткань к углу слайда, чтобы избежать смещения участков сетчатки.
7. Чтобы избежать перекрестной маркировки первичных антител, выращенных у одного и того же вида-хозяина, завершите окрашивание вторичными антителами перед применением непосредственно меченых антител.
8. Вторичные антитела: Разбавляют вторичные антитела в блокирующем буфере в концентрации 0,1%. Например, для обнаружения анти-cl-каспазы-9, антитела, выращенного у кролика, используют козу-анти-кролик-568 вторичную.
   1. Нанесите 200 мкл коктейля вторичных антител на сетчатку.
   2. Инкубируют ткань в течение 2 ч при РТ.
   3. Промыть секции четыре раза в течение 5 мин с 300 мкл 1x PBS.
   4. Окрашивают ядра в течение 5 мин 300 мкл DAPI в разведении 0,02%.
9. Мойте один раз в течение 5 мин с 300 мкл 1x PBS.
10. Поместите крышку на участки сетчатки, используя 500 мкл среды fluoromount-G, которая сохраняет флуоресцентный сигнал, и осторожно поместите крышку на верхнюю часть слайда, избегая пузырьков.

3. Конфокальная визуализация

1. Получение изображений окрашенных участков с помощью конфокальной микроскопии.
   1. Включите конфокальный микроскоп.
   2. Поместите слайд в рабочую область.
   3. Отрегулируйте фокус, чтобы четко видеть участок сетчатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите не менее четырех изображений на секцию и четыре секции на сетчатку. См. схему визуализации сетчатки для предлагаемых областей визуализации (рисунок 1B, C).
2. Изображение каспазы, сосудистого и ядерного окрашивания с помощью конфокального микроскопа, который имеет Z-стек захвата, с использованием объектива 20x или 40x.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры визуализации и настройка программного обеспечения должны быть постоянными для всех изображений в эксперименте. Цель 20x обеспечивает обзор слоев сетчатки, которые четко определены ядерным окрашиванием. Объектив 40x обеспечивает больше деталей сотовой связи.
   1. Установите соответствующее время экспозиции и интенсивности лазера для каждого канала, щелкнув настройки получения.
   2. Установите Z-стек для визуализации всего раздела, щелкнув Z-серию , и установите параметры вверх и вниз, чтобы покрыть глубину ткани.
3. Сохраните изображения в соответствии с маскированным идентификатором, назначенным во время криосекции.

4. Количественная оценка уровней каспазы

1. Перетащите файлы изображений 405, 470, 555 и 640 каналов на консоль FIJI.
2. Щелкните Изображение > Цвет > Объединить каналы.
3. Назначьте цвета файлам следующим образом: красный — 555, зеленый — 470, серый — 405, голубой — 640.
4. Сожмите Z-стек, щелкнув Image > Stack > Z Project.
5. Щелкните Тип проекции: Максимальная интенсивность.
6. Откройте интерфейс каналов, щелкнув Инструмент «Изображение > цветовые каналы».
7. Откройте интерфейс яркости и контрастности .
8. Выберите параметры для каждого канала.
   1. Перейдите в раздел Каналы и выберите один канал.
   2. Поместите курсор поверх ячейки, выраженной в каспазе, и аннотируйте значение пикселя.
   3. Поместите курсор поверх фона и аннотируйте значение пикселя.
9. Параметры теста
   1. Перейдите к интерфейсу Яркость и контрастность.
   2. Нажмите кнопку Выбрать.
   3. Подключите минимальное отображаемое значение (аннотированное значение пикселя экспрессированной ячейки каспазы).
   4. Подключите максимальное отображаемое значение (аннотированное значение пикселя фона).
   5. Нажмите кнопку ОК.
10. Повторите шаги 4.8–4.9 для всех каналов.
11. Проверьте параметры, выбрав случайные изображения из слепой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Редактируйте параметры яркости и контрастности только в том случае, если значение фона недостаточно для других изображений.
12. После установки параметров откройте файлы изображений и сожмите Z-стек.
13. Добавьте параметры яркости и контрастности для канала каспазы и изолектина, сосудистого маркерного канала.
14. Используйте точечный инструмент для количественной оценки количества сосудистых положительных областей с использованием колокализации сосудистого маркера с экспрессией каспазы в качестве считывания положительных областей.
15. Повторите шаг 4.14, но используя Hoechst в качестве маркера нейрональных положительных областей.
16. Аннотирование значений в электронной таблице для каждого изображения.
17. Усредните значения по разделам.
18. Усредните значения разделов - это будет считывание на глаз.

5. Генетическое подтверждение актуальности эндотелиальной клеточной каспазы-9

1. Используйте сетчатку, полученную от мышей Casp9FL/FL-VECad-CreERT2, которые подвергались воздействию RVO⁷.
2. Иммуноувлажнение сетчатки для каспазы-9 (удаленная каспаза), каспазы-7 (нисходящая эффекторная каспаза), сосудистых маркеров и DAPI, как описано выше в разделе 2.
3. Изображение и количественная оценка, как описано выше в разделах 3 и 4.

6. Нацеливание на каспазу-9 в РВО

1. Получают глаза от мышей, подвергшихся воздействию RVO, с последующим применением ингибитора каспазы-9 Pen1-XBir3 местно к глазам, как в⁷.
2. Иммуноувлажнение сетчатки для каспазы-7 (нисходящей эффекторной каспазы), сосудистых маркеров и DAPI, как описано выше в разделе 2.
3. Изображение и количественная оценка, как описано выше в разделах 3 и 4.

Результаты

Описанный протокол позволяет пользователю анализировать и количественно оценивать уровни каспазы-9 в ткани сетчатки. Кроме того, в нем представлены инструменты для дальнейшей идентификации, проверки и, в частности, нацеливания на каспазу-9 и последующие субстраты. Обобщенные этапы поз...

Обсуждение

Каспазы представляют собой многочленное семейство протеаз, наиболее изученных из-за их роли в гибели клеток и воспалении; однако в последнее время для некоторых членов семьи были выявлены различные функции, не связанные со смертью ^4,5. Большая часть нашег...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Caspase-7 488	Novus Biologicals	NB-56529AF488	use at 1:150
anti-cl-Caspase-9	Cell Signaling	9505-S	use at 1:800
anti-CD31	BD Pharmingen	553370	use at 1:50
Confocal Spinning Disc Microscope	Biovision
FIJI 2.3.0	open source
Fluormount G	Fisher	50-187-88
Forcep	Roboz	RS-5015
iCasp9FL/FL X VECad-CreERT2 mice	lab generated		see Avrutsky 2020
Isolectin (594, 649)	Vector	DL-1207	use at 1:200
Ketamine Hydrochloride	Henry Schein	NDC: 11695-0702-1
Perfusion pump	Masterflex
Pen1-XBir3	lab generated		see Avrutsky 2020
Prism 9.1	GraphPad
Tissue-Tek O.C.T.	Fisher	14-373-65
Vis-a-View 4.0	Visitron Systems
Xylazine	Akorn	NDCL 59399-110-20