Клиническая микрофлюидная чип-платформа для выделения универсальных циркулирующих опухолевых клеток

Резюме

Клинический микрофлюидный чип является важным методом биомедицинского анализа, который упрощает предварительную обработку образцов крови клинического пациента и иммунофлуоресцентно окрашивает циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) in situ на чипе, что позволяет быстро обнаруживать и идентифицировать один ЦОК.

Аннотация

Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) играют важную роль в прогнозе рака, диагностике и противораковой терапии. Перепись ЦОК имеет жизненно важное значение для определения заболевания пациента, поскольку ЦОК редки и неоднородны. ЦОК отделяются от первичной опухоли, попадают в систему кровообращения и потенциально растут в отдаленных местах, тем самым метастазируя опухоль. Поскольку ЦОК несут информацию, аналогичную первичной опухоли, выделение ЦОК и последующая характеристика могут иметь решающее значение для мониторинга и диагностики рака. Перечисление, аффинная модификация и клиническое иммунофлуоресцентное окрашивание редких ЦОК являются мощными методами выделения ЦОК, поскольку они обеспечивают необходимые элементы с высокой чувствительностью. Микрофлюидные чипы предлагают метод жидкой биопсии, который не вызывает боли у пациентов. В этой работе мы представляем список протоколов для клинических микрофлюидных чипов, универсальной платформы для выделения ЦОК, которые включают в себя набор функций и сервисов, необходимых для разделения, анализа и ранней диагностики ЦОК, тем самым облегчая биомолекулярный анализ и лечение рака. Программа включает в себя подсчет редких опухолевых клеток, предварительную обработку крови клинического пациента, которая включает лизис эритроцитов, а также выделение и распознавание ЦОК in situ на микрофлюидных чипах. Программа позволяет точно подсчитывать опухолевые клетки или CTCs. Кроме того, программа включает в себя инструмент, который включает в себя выделение CTC с помощью универсальных микрофлюидных чипов и иммунофлуоресцентную идентификацию in situ на чипах с последующим биомолекулярным анализом.

Введение

Циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК) играют важную роль в прогнозе рака, диагностике и противораковой терапии. Перечисление CTC имеет жизненно важное значение, поскольку CTC редки и неоднородны. Перечисление, аффинная модификация и клиническое иммунофлуоресцентное окрашивание редких ЦОК являются мощными методами выделения ЦОК, поскольку они содержат необходимые элементы с высокой^{чувствительностью1}. Редкое количество опухолевых клеток, смешанных с нормальной кровью, очень близко имитирует настоящую кровь пациента, так как 2-3 мл настоящей крови пациента содержат только 1-10 ЦОК. Для решения критической экспериментальной задачи вместо использования большого количества опухолевых клеток, введенных в PBS или смешанных с нормальной кровью, использование редкого количества опухолевых клеток обеспечивает нам низкое количество клеток крови, что ближе к реальности при проведении эксперимента.

Рак является основной причиной смерти в мире². ЦОК представляют собой опухолевые клетки, выделяющиеся из исходной опухоли, которые циркулируют в системах кровообращения и лимфатического кровообращения³. Когда ЦОК перемещаются в новую среду обитания, они растут как вторая опухоль. Это называется метастазированием и является причиной 90% смертей у онкологических больных⁴. ЦОК жизненно важны для прогнозирования, ранней диагностики и понимания механизмов развития рака. Однако ЦОК крайне редки и неоднородны в крови пациента ^5,6.

Микрофлюидные чипы обеспечивают жидкостную биопсию, которая не проникает в опухоль. Их преимущество заключается в том, что они портативны, недороги и имеют масштабы, соответствующие ячейкам. Выделение ЦОК с микрофлюидными чипами классифицируется в основном на два типа: аффинные, основанные на связывании антиген-антитела ^7,8,9 и являющиеся оригинальным и наиболее широко используемым методом выделения ЦОК; и физические чипы, которые используют различия в размерах и деформируемости между опухолевыми клетками и клетками крови 10, ¹¹, 12, 13, ¹⁴, ^15, не имеют меток и просты в эксплуатации. Преимущество микрофлюидных чипов перед альтернативными методами заключается в том, что физический подход к многоэллипсным микрофильтрам надежно улавливает CTC с высокой эффективностью улавливания. Причина этого заключается в том, что эллипсовые микростолбы организованы в узкие туннели разрывов между линиями. Межлинейные зазоры отличаются от традиционных точечных зазоров, образованных микростолбами, такими как ромбовые микростолбы. Захват CTC на основе волнового чипа сочетает в себе изоляцию на основе физических свойств и изоляцию на основе сходства. Захват на основе волнового чипа включает в себя 30 волнообразных матриц с антителом анти-EpCAM, покрытым круглыми микроштифтами. CTC улавливаются маленькими зазорами, а большие зазоры используются для ускорения скорости потока. Пропущенные CTC должны пройти через небольшие зазоры в следующем массиве и захватываются изоляцией на основе сходства, интегрированной в микросхему¹⁶.

Целью протокола является демонстрация подсчета редкого количества опухолевых клеток и клинического анализа ЦОК с помощью микрофлюидных чипов. Протокол описывает этапы выделения ЦОК, способы получения низкого количества опухолевых клеток, клиническое физическое разделение фильтров с малым эллипсом, фильтров с большим эллипсом и трапециевидных фильтров, модификацию сродства и обогащение¹⁷.

протокол

Образцы крови пациентов были предоставлены больницей Лунхуа, аффилированной с Шанхайским медицинским университетом.Протокол соответствует рекомендациям комитета по этике исследований на людях Третьей больницы Пекинского университета. От пациентов было получено информированное согласие на использование образцов в исследовательских целях.

1. Предварительный эксперимент по проверке эффективности захвата культивируемыми опухолевыми клетками

1. Культивирование опухолевых клеток MCF-7, MDA-MB-231 и HeLa для определения эффективности захвата. Разбавляют суспензию опухолевых клеток, подсчитывают количество опухолевых клеток и повторяют до тех пор, пока не будет получено желаемое количество клеток в 1 мл PBS.
   1. Культивирование клеток в колбе для клеточных культур с начальным количеством клеток ~ 1 x 10⁵ клеток в 1 мл модифицированной среды Игла (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина. Инкубируют во влажной атмосфере при температуре 37 °C с содержанием_СО2 5%.
   2. Когда клеточные линии вырастут в виде адгезивных монослоев до слияния 95%, отделите их от культуральных чашечек 0,25% раствором трипсина в течение 2 мин, как описано в Chen et ^al.16.
   3. Окрасьте опухолевые клетки кальцеином АМ. Поместите 3 мкл кальцеина AM в чашку для закваски и держите чашку в инкубаторе в течение 30 минут. Затем переварите все клетки трипсином.
   4. Подсчитывают культивируемые опухолевые клетки в PBS с помощью камеры подсчета клеток и разводят до получения 100 опухолевых клеток на 1 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы точно перечислить количество клеток, возьмите 50 мкл полученной клеточной суспензии, чтобы с помощью микроскопа увидеть, сколько в ней опухолевых клеток или нет. Определите объем клеточной суспензии, который необходимо взять для получения 100 опухолевых клеток, в соответствии с фактическим количеством опухолевых клеток в 50 мкл клеточной суспензии.
2. Вводят клеточную суспензию, содержащую 100 опухолевых клеток на 1 мл PBS, в микрофлюидный чип с помощью шприца со шприцевым насосом с переменной скоростью потока 0,5 мл/ч, 1 мл/ч, 2 мл/ч, 3 мл/ч, 4 мл/ч и 5 мл/ч. Получите эффективность улавливания для различных скоростей потока и определите оптимальный расход.
   1. Подсчитайте количество опухолевых клеток, захваченных на чипе и вытекающих из выходного отверстия. Рассчитайте эффективность захвата, как показано ниже:
      Эффективность захвата = Количество захваченных ячеек/(Количество захваченных ячеек + количество вытекающих ячеек) × 100%
   2. Повторите процедуру, чтобы получить эффективность захвата для разного количества опухолевых клеток от 10 до 100 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100).
3. Протестируйте и подтвердите микрофлюидный чип на наличие редкого количества опухолевых клеток. Введите эти 10 образцов суспензии в микрофлюидные чипы с помощью полой иглы, изготовленной с помощью съемника микропипетки, для аспирации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 опухолевых клеток, разведенных в 1 мл PBS. Обнаружение и подсчет количества опухолевых клеток для каждого образца после их захвата на чипе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полая игла имеет длину около 3 см и внешний диаметр 1 мм.
4. Проведите клиническое предэкспериментальное тестирование опухолевых клеток, попавших в нормальные образцы крови.
   1. Окрасьте опухолевые клетки кальцеином AM, а затем переборите 100 опухолевых клеток в 5 мкл PBS. Поместите эти клетки в 1 мл образца цельной нормальной крови. Введите эти клетки в чип и переборщите количество опухолевых клеток, захваченных на чипе с помощью зеленой иммунофлуоресценции. Выполните перебор in vivo на чипе, как описано выше, и рассчитайте эффективность захвата после захвата.
   2. Повторите шаг 1.4.1 для девяти дополнительных концентраций номеров опухолевых клеток от 10 до 90 (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90).
   3. Перечислите 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 опухолевых клеток, как описано в шаге 1.3, без окрашивания, добавьте 1 мл цельной нормальной крови, введите эти образцы в микрофлюидный чип и захватите опухолевые клетки на чипе.
   4. Пятно на чипе с помощью Hoechst, CK-FITC и CD45-PE. В 20-30 мкл PBS вносят 3-5 мкл флуоресцентного красителя, а затем шприцем вводят этот раствор на микрофлюидный чип. Перечислите количество опухолевых клеток, захваченных на чипе с помощью синей и зеленой иммунофлуоресценции, чтобы определить эффективность захвата.
5. Выполнить модификацию микрофлюидного чипа для захвата анти-EpCAM на основе сродства.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку волновой чип сочетает в себе изоляцию, основанную как на сродстве, так и на физических свойствах, модифицируйте чип с помощью агентов.
   1. Модифицируют поверхность чипа 100 мкл 4% (v/v) 3-меркаптопропилтриметоксисилана в этаноле при комнатной температуре в течение 45 мин. Вводите этот раствор в стружку осторожно и медленно, чтобы он не разрушил внутреннюю структуру чипа, особенно склеивание верхней поверхности и стекла подложки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность стружки модифицирована с помощью меркаптосилана. Взаимодействия, происходящие на чипе, определяются химическими связями. Химические связи устанавливаются для реализации связывания антитела, модифицированного антигеном. Внутри чипа модифицируются различные реагенты для создания химических связей, которые соединяются друг с другом. Последним реагентом, подлежащим модификации, является молекула антиэпителиальной адгезии (anti-EpCAM). Поверхностный антиген опухолевых клеток EpCAM соединяется с анти-EpCAM внутри чипа, чтобы реализовать захват CTCs.
   2. Промыть этанолом 3 раза. Добавьте 100 мкл связующего агента N-y-малеимидобутирилоксисукцинимида эфира (GMBS, 1 мкМ) на чип и дайте ему взаимодействовать в течение 30 минут.
   3. Стирайте с помощью PBS 3x. С помощью шприца введите 1 мл PBS на чип для промывки.
   4. Обработайте чип 30-40 мкл 10 мкг/мл нейтравидина при комнатной температуре в течение 30 мин, что приведет к иммобилизации клеток на GMBS, а затем промойте PBS для удаления избытка авидина.
   5. Модифицируйте чип 3 мкл антибиотинилированного антитела EpCAM в концентрации 10 мкг/мл в 100 мкл PBS с 1% (w/v) BSA. Оставьте это на ночь.

2. Клинический эксперимент на чипе для подсчета циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК)

1. Предварительную обработку образцов крови пациентов с клиническим раком с помощью раствора лизиса эритроцитов (RBCL) или введение 2-3 мл образца крови непосредственно на микрофлюидный чип с помощью шприца.
   1. Выполните предварительную обработку, которая занимает около 30 минут. Соберите образцы цельной крови в пробирки с антикоагулянтами. Добавьте 6-9 мл раствора лизиса RBS в 2-3 мл крови. Центрифугу при 111 х г в течение 5-8 мин при комнатной температуре и слейте верхний слой красной прозрачной жидкости.
2. Захватите, окрасьте, распознайте и перечислите ячейки на чипе, как описано ниже.
   1. Захватите клетки на чипе, как описано в шаге 1.Окрасьте чип для CTC, захваченных с помощью Hoechst, CK-FITC и CD45-PE. CK-FITC является специфическим красителем для опухолевых клеток, а CD45-PE — для белых кровяных телец.
   2. Добавьте 3 мкл CK-FITC к 20 мкл PBS. Введите его в шприц и закачайте разбавленный CK-FITC на чип. Оставьте на 30 минут. Введите 300 мкл PBS на чип, чтобы промыть чип.
   3. Добавьте 3 мкл CD45-PE к 20 мкл PBS. Введите его в шприц и закачайте разбавленный CD45-PE на чип. Дать постоять 30 минут. Введите 300 мкл PBS на чип, чтобы промыть чип.
   4. Идентификация ЦОК с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа при 20-кратном или 40-кратном увеличении. ЦОК излучают как синюю, так и зеленую флуоресценцию, а лейкоциты (лейкоциты) излучают как синюю, так и красную флуоресценцию. Определите ЦОК с синей и зеленой флуоресценцией, а лейкоциты с синей и красной флуоресценцией.
   5. По иммунофлуоресцентным изображениям перечислите количество ЦОК, захваченных на чипе. Перечислите CTC как Hoechst+/CK-FITC+/CD45−, а лейкоциты как Hoechst+/CK-FITC−/CD45+.
3. Обогатите захваченные CTC путем промывки PBS через шприц в обратном направлении на микрофлюидный чип для сбора CTC, захваченных на чипе из входного отверстия. Используйте шприц с 1 мл PBS, вводите его из выходного отверстия для обогащения CTCs, захваченных на чипе, в течение 2-3 мин, и собирайте их из входного отверстия. Используйте 1 мл PBS для каждого этапа стирки и повторите 3 раза.
4. Окрасьте опухолевые клетки или CTCs, захваченные на микрофлюидном чипе, как описано ниже.
   1. Окрашивание с помощью кальцеина АМ. Добавьте 5 мкл кальцеина AM к 20 мкл PBS, окрасьте клетки в течение 30 мин, затем центрифугируйте при 111 x g в течение 2 минут при комнатной температуре для получения опухолевых клеток и суспендируйте в 1 мл PBS.
   2. Для идентификации клеточных ядер необходимо добавить в чип 20 мкл раствора DAPI (10 мкл реагента DAPI в 20 мкл PBS) при оптимальном расходе 1 мл/ч для крупноэллипсовых микрофильтров и 1,5 мл/ч для трапециевидных. Пропустить через 20 мкл исходного раствора антицитокератина (3 мкл антицитокератиновых антител в 20 мкл PBS) для реакции с чипом в течение 30 мин.
   3. Окрасьте лейкоциты, захваченные на чипе. После того, как CTCs будут захвачены на чипе, добавьте 25 мкл раствора антител к CD45 (5 мкл раствора анти-CD45 в 20 мкл PBS) к чипу и оставьте на 30 минут. Промывают PBS и идентифицируют эпителиальные клетки с синей и зеленой флуоресценцией.
5. Выполните иммунофлуоресцентную идентификацию с помощью флуоресцентной микроскопии, как описано ниже.
   1. Используйте флуоресцентный микроскоп и возбуждайте образец синим лазером. Найдите клетки, излучающие синюю флуоресценцию, которые являются ядрообразными клетками. Используйте одно из следующих увеличений: 10x, 20x или 40x. Найдите чистое поле для опухолевой клетки. Для синего лазерного источника используйте длину волны пластины возбуждения 420-485 нм и длину волны эмиссионной пластины 515 нм.
   2. Не перемещая образцы, используйте другой лазерный источник. Вращайте флуоресцентный микроскоп и возбуждайте образец зеленым лазером. Найдите клетки, излучающие зеленую флуоресценцию, что свидетельствует об опухолевых клетках. Делайте снимки одного и того же поля с тем же увеличением с помощью этого зеленого лазерного источника. Клетки, излучающие как синюю, так и зеленую флуоресценцию, распознаются как опухолевые клетки. Для зеленого лазерного источника используйте длину волны пластины возбуждения 460-550 нм и длину волны эмиссионной пластины 590 нм
   3. Не перемещая образцы, используйте другой лазерный источник. Вращайте флуоресцентный микроскоп и возбуждайте образец красным лазером. Найдите клетки, излучающие красную флуоресценцию. Сделайте снимки одного и того же поля с тем же увеличением с помощью этого красного лазерного источника. Клетки, которые излучают как синюю, так и красную флуоресценцию, распознаются как белые кровяные тельца.
   4. Сохраните изображение, полученное с помощью каждого из указанных выше источников лазерного излучения. Сделайте несколько снимков одного и того же поля с разными цветными огнями.
   5. Используйте ультрафиолетовый свет с длиной волны пластины возбуждения 330-400 нм и длиной волны эмиссионной пластины 425 нм. Используйте фиолетовый свет с длиной волны пластины возбуждения 395-415 нм и длиной волны эмиссионной пластины 455 нм.
6. Рассчитайте эффективность захвата, как показано на шаге 1.2.1.

Результаты

Вся установка включает в себя шприцевой насос, шприц и микрофлюидный чип. Клеточная суспензия в шприце соединяется со шприцевым насосом, и клеточная суспензия вводится в микрофлюидный чип для захвата клеток. Эффективность захвата для всех используемых микрофлюидных чипов составила о?...

Обсуждение

Прогноз и ранняя диагностика рака оказывают существенное влияние на лечение рака¹. Изоляция ЦОК с помощью микрофлюидных чипов обеспечивает жидкостную биопсию без инвазии. Однако ЦОК крайне редки и неоднородны^{в крови1}, что затрудняет выделение ЦОК. ЦОК обладаю...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Calcein AM	BIOTIUM	80011
calibrated microcapillary pipettes	Sigma- Aldrich	P0799
CD45-PE	BD Biosciences	560975
CK-FITC	BD Biosciences	347653	cytokeratin monoclonal antibody
DMEM	HyClone	SH30081.05
fetal bovine serum (FBS)	GIBCO,USA	26140
Hoechst 33342	Molecular Probes, Solarbio Corp., China	C0031
penicillin-streptomycin	Ying Reliable biotechnology, China
Red blood cells lysis (RBCL)	Solarbio, Beijing	R1010