JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем простую в реализации, стандартизированную, микрофизиологическую систему, которая отражает сложность структуры in vivo костного мозга человека, обеспечивая подходящую модель для тонкого изучения широкого спектра нормальных и патологических событий.

Аннотация

Медуллярная ниша представляет собой сложную экосистему, которая необходима для поддержания гомеостаза для резидентных клеток. Действительно, костный мозг, который включает в себя сложный внеклеточный матрикс и различные типы клеток, такие как мезенхимальные стволовые клетки, остеобласты и эндотелиальные клетки, глубоко вовлечен в регуляцию гемопоэтических стволовых клеток посредством прямых клеточных взаимодействий, а также производства цитокинов. Чтобы точно имитировать эту структуру in vivo и проводить эксперименты, отражающие реакции костного мозга человека, было создано несколько 3D-моделей на основе биоматериалов, опирающихся в первую очередь на первичные стромальные клетки. Здесь описан протокол для получения минимальной и стандартизированной системы, которая легко настраивается и обеспечивает особенности костномозгоподобной структуры, которая объединяет различные клеточные популяции, включая эндотелиальные клетки, и отражает неоднородность ткани костного мозга in vivo . Эта 3D-структура, похожая на костный мозг, собранная с использованием частиц на основе фосфата кальция и клеточных линий человека, представляющих микросреду костного мозга, позволяет контролировать широкий спектр биологических процессов путем объединения или замены различных первичных клеточных популяций в системе. Конечные 3D-структуры затем могут быть либо собраны для анализа изображений после фиксации, встраивания парафина и гистологического / иммуногистохимического окрашивания для локализации клеток в системе, либо диссоциированы для сбора каждого клеточного компонента для молекулярной или функциональной характеристики.

Введение

Костный мозг (БМ) находится как в центральных полостях осевых и длинных костей, так и в трабекулярных плоских костях и содержит множество различных клеточных и неклеточных компонентов. На структурном уровне он состоит из островков кроветворной ткани (также называемых «гематонами»)1,2 и жировых клеток, окруженных сосудистыми синусами, перемежающимися внутри трабекулярной кости3. В длинных и плоских костях кровоснабжение кости и костного мозга связано между собой через эндостальную сеть сосудов4. Скрытый в этой прочной защитной сети, БМ содержит очень незрелые клетки, погруженные в губчатую строму, и представляет собой место для дифференцировки резидентных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)5. Действительно, помимо обновления костных тканей путем производства остеобластов, одна из основных известных функций БМ заключается в развитии кроветворения6.

Кроветворная ткань BM включает в себя различные типы клеток, а именно ГСК, предшественники и более дифференцированные клетки крови, такие как лимфоциты, нейтрофилы, эритроциты, гранулоциты, моноциты и тромбоциты7. Кроветворные клетки не расположены случайным образом в пространстве БМ, а демонстрируют определенную организацию в кроветворных нишах, которые включают в себя множество типов клеток различного происхождения (остеобласты, остеокласты, МСК, адипоциты, синусоидальные эндотелии и периваскулярные стромальные клетки, иммунные клетки, нервные клетки и отдельные зрелые кроветворные клетки), образуя сложную структуру для обеспечения нормального кроветворения8 . Биологические функции кроветворной ниши включают регуляцию выживаемости, адгезии, покоя, самонаведения и дифференцировки с помощью различных механизмов (взаимодействия клетка-клетка и клетка-матрица, производство растворимых факторов, гипоксия) в ответ на множественные физиологические или нефизиологические стрессы 3,6. Хотя эти гемопоэтические ниши первоначально воспринимались как однородные объекты, технологические достижения, такие как анализ одной клетки и визуализации, постепенно выявили их сложность, динамику и адаптивные свойства 9,10,11.

Острая необходимость замены и сокращения использования животных для расшифровки физиологических и патологических процессов человека приводит к новым возможностям и вызовам11,12. Среди недавно описанных инструментов in vitro были предложены трехмерные (3D) модели, которые имитируют in vivo человеческий BM лучше, чем классические двумерные (2D) культуры 13,14,15,16,17. Таким образом, 3D-моделирование представляется многообещающим подходом к наблюдению за взаимодействиями клетка-клетка и клетка-матрица, ближе к тем, которые происходят in vivo. Используя различные из этих моделей, некоторые команды продемонстрировали выживание и распространение ГСК 18,19. Доступно несколько 3D-моделей, наиболее распространенным подходом является использование 3D-биоматериалов на основе каркасов, таких как гидрогели, коллоиды или коллагены, связанные с МСК, использующими их возможности дифференциации остеобластной линии 20,21,22. Тем не менее, не было достигнуто глобального согласия на выполнение всех требований к исследованиям на клетках человека удобным для пользователя и стандартизированным способом23, тем более что эти современные 3D-системы в основном полагаются на первичные стромальные клетки и, таким образом, страдают от ограниченного доступа к первичным образцам, доступности тканей и гетерогенности.

Кроме того, следует ввести эндотелиальный клеточный компартмент, поскольку эти клетки представляют собой основной компонент клеточных взаимодействий и участвуют в судьбе стволовых клеток и развитии заболевания БМ, как при лейкемии24 , так и при метастазировании25. Ранее мы сообщали, что добавление патологических элементов в стандартизированную 3D-модель костного мозга человека повторяет особенности, наблюдаемые в образцах пациентов, такие как изменения внеклеточного матрикса (ECM)26. Чтобы лучше понять динамику и взаимодействие между микроокружением БМ человека и резидентными клетками, мы предоставляем подробный протокол для удобной и стандартизированной системы для создания минимальной, хорошо организованной, BM-подобной структуры. Эта система состоит из трех типов клеток костного мозга человека - эндотелиальных клеток и стромальных клеток, которые представляют собой микроокружение, и ГСК. Используя специфические бусины в качестве каркаса и остеобластической дифференцировочной среды, полученная 3D-структура будет имитировать медуллярную нишу человека, что позволит удобно изучить костный мозг человека.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Для подготовки структуры костного мозга, подобной основной структуре, этот протокол основан на объединении шариков с эндотелиальными клетками HMEC-1 и стромальными клетками HS27A на двухфазных шариках фосфата кальция (BCP). Бусины BCP будут служить каркасом, позволяющим, с определенной средой, формировать 3D-структуру.

1. Подготовка и стерилизация бисера

  1. Взвесьте 35-40 мг шариков BCP (HA/β-TCP 60/40; 45-75 мкм) для каждой вставки (маленькая, цилиндрическая, пластиковая тарелка с поликарбонатной мембраной внизу) в трубке объемом 1,5 мл (см. Таблицу материалов). После взвешивания бусин просверлите небольшое отверстие с чистой иглой через верхнюю часть трубки объемом 1,5 мл, чтобы крышка не распахнулась во время цикла автоклава (121 ° C в течение 60 минут), и поместите трубки в вертикальное положение в закрытую стерильную коробку.

2.3D вставить препарат под стерильный капюшон

  1. Поместите стерильные поликарбонатные вставки для посевных клеток в колодцы 6-луночной пластины. Вылейте в вкладыш стерильные бусины BCP из трубки объемом 1,5 мл. Тщательно вымойте шарики, капнув внутрь вкладыша 350 мкл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), а затем добавьте в скважину 4,5 мл 1x PBS. Извлеките и выбросьте PBS либо с помощью вакуума, либо с помощью пипетки объемом 5 мл, поместив наконечник в угол колодца. Повторите этап стирки дважды.
  2. После того, как шарики вымыты, используйте 1x PBS, дополненный 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), чтобы заблокировать систему. Осторожно добавьте 350 мкл блокирующего раствора во вставку и 4,5 мл в лунку и поместите всю пластину в инкубатор при 37 °C, 5% CO2 на ночь.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.1 и 2.2 помогают свести к минимуму высвобождение ионов из шариков BCP перед посевом клеток.

3. Заготовка клеточных линий и 3D-обслуживание

ПРИМЕЧАНИЕ: После этого этапа инкубации добавляются микроокружательные клетки, чтобы сформировать основу 3D-структуры. Эта система основана на использовании HMEC-1, микрососудистых эндотелиальных клеток человека, увековеченных крупным Т-антигеном из SV40, и HS27A, стромальных клеток костного мозга человека, увековеченных вирусом папилломы человека, благодаря их способности образовывать твердую BM-подобную структуру и их совместимости с включением эндотелиальных клеток.

  1. Перед добавлением клеток в систему подготовьте следующие инкубационные среды:
    1. Для получения 50 мл полной среды дифференцировки остео (ODM) смешайте 45 мл модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM) + 5 мл FBS + 0,5 мл пенициллина-стрептомицина + 8 × 10-4 мг/л дексаметазона + 2,16 г/л бета-глицерофосфата + 44 мг/л аскорбиновой кислоты.
    2. Для 50 мл полной среды HMEC-1 смешайте 45 мл MCDB 131 + 5 мл FBS + 0,5 мл пенициллина-стрептомицина + 1% заменителя глутамина + 1 мг/л гидрокортизона + 10 мкг/л EGF.
  2. Удалите блокирующее решение из системы. Смешайте 1 × 106 клетками HMEC-1 (представляющими сосудистый компартмент) и 2 × 106 клетками HS27A (представляющими мезенхимальный стромальный клеточный компартмент) в трубке 15 мл и центрифуге в течение 5 мин при 1,575 × г при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта и добавьте 175 мкл среды HMEC-1 (специфическая среда для роста клеток HMEC-1) со 175 мкл ODM (специфическая среда для остеодифференциации HS27A).
  3. Налейте 350 мкл этой суспензии, содержащей 3 × 106 общих клеток внутри каждой вставки. Затем насыпают 4,5 мл комбинированной среды (2,25 мл среды HMEC-1 + 2,25 мл ODM) без ячеек в колодцы пластины. Осторожно аспирируйте и дозируйте смесь несколько раз микропипеткой 1 мл, чтобы гомогенизировать клетки и шарики BCP внутри вставки. Выделите всю смесь, чтобы она осела в нижней части вкладыша.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление смеси с одним мертвым объемом рекомендуется, если культивировано несколько вставок. Например, если четыре вставки культивированы, всегда подготавливайте объем, необходимый для пяти вставок.
  4. Как только эндотелиальные и мезенхимальные клетки гомогенизируются внутри вставки, держите 6-луночную пластину внутри инкубатора при 37 °C, 5% CO2 в течение 3 недель. Меняйте среду внутри вставки и лунку 2 раза в неделю, осторожно удаляя среду со вставки с помощью микропипетки 1 мл и помещая наконечник на внутреннюю стенку вставки, чтобы не повредить угол вставки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеченный супернатант может храниться при -80 °C на любом этапе для последующей количественной оценки белка.

4. Добавление интересующих клеток в систему

ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 недель культивирования HMEC-1 и HS27A остеодифференциация клеток HS27A позволила жесткость системы. На этом этапе добавляют гематологические клетки, представляющие интерес (количество добавленных клеток может варьироваться от 1 × 104 до 1 × 106) внутри вставки. Добавленными клетками были клетки TF1, трансфектированные онкогеном BCR-ABL и первичные мононуклеированные CD34+ клетки, поступающие либо от пациентов с острым миелоидным лейкозом, либо от здоровых доноров.

  1. Измените состав среды на этом этапе, так как соединение ODM токсично для гематологических клеток, и нет необходимости продолжать добавлять его после того, как система будет выполнена жесткость. Например, для поддержки поддержания кроветворения замените среду ODM полной RPMI для кроветворных клеточных линий (RPMI дополнена 10% FBS и 1% пенициллина-стрептомицина) или IMDM для первичных кроветворных клеток. Подготовьте партию из 50% полной среды HMEC-1 и 50% полной среды RPMI/IMDM для 3D-среды (дважды) еженедельных изменений.
  2. Повторно суспендируйте интересующие гематологические клетки в этой комбинированной среде и добавьте ее в вставку. Если требуется протокол медикаментозного лечения, подождите 24 ч после добавления интересующих клеток перед лечением, давая им время прилипнуть к костно-подобной структуре.
  3. Адаптируйте период 3D клеточной культуры в соответствии с требованиями. Обновляйте среду (50% HMEC-1 полная среда + 50% RPMI полная среда) два раза в неделю.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение 3D-культуры клеток некоторые адгезивные клетки могут просачиваться за пределы вставки в дно лунок, увеличивая потребление среды. Проверьте под микроскопом дисперсию клеток за пределами вставки и замените вставку в новой 6-луночной пластине под стерильным капотом, если это необходимо.

5.3D результаты экспериментов, подобных костному мозгу

ПРИМЕЧАНИЕ: После 3D-культивирования может быть достигнуто несколько результатов в соответствии с целями эксперимента.

  1. Анализ белка
    ПРИМЕЧАНИЕ: В ходе 3D-эксперимента белки, секретируемые клетками, присутствующими в структуре, подобной костному мозгу, могут быть собраны для дальнейшего анализа.
    1. Когда культуральная среда изменяется 2 раза в неделю, храните извлеченный супернатант из внутренней части вкладыша при -80 °C для оценки производства белков, представляющих интерес в системе.
  2. Диссоциация клеток от 3D-структуры (под стерильным капюшоном, если клетки необходимо отсортировать)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, культивируемые в 3D-системе, подобной костному мозгу, могут быть извлечены, отсортированы и дополнительно проанализированы.
    1. В конце эксперимента в пробирке объемом 15 мл смешайте 4,5 мл RPMI с 0,5 мл FBS, дополненной 0,4 мг/мл коллагеназы, и нагревайте раствор при 37 °C в течение 10 мин.
    2. Поместите вставку вверх ногами (белая сторона мембраны сверху) на стерильную 6-луночную крышку пластины, чтобы правильно вырезать мембрану. Используйте стерильный скальпель, чтобы разрезать мембрану с боков, таким образом извлекая белый твердый диск. Поместите диск внутрь теплой пробирки объемом 15 мл, подготовленной на этапе 5.2.1.
    3. Поместите трубку в активное колесо в инкубаторе с температурой 37 °C и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы обеспечить пищеварение (в контакте с коллагеназой). Применяйте одинаковое время инкубации для всех мембран, чтобы избежать искаженного анализа.
    4. Через 10 мин центрифугируют пробирку 15 мл в течение 5 мин при 1,575 × г при комнатной температуре, выбрасывают супернатант и повторно суспендируют гранулу в 5 мл теплого 1x PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, поскольку поликарбонатная мембрана обычно плавает в фракции супернатанта, ее можно отбросить с помощью стерильного наконечника пипетки. Если мембрана все еще включена в гранулу, оставьте ее и удалите в конце следующего этапа.
    5. Повторно суспендируйте гранулу в 300 мкл теплого трипсина, вращайте трубку в течение 10 с и поместите ее на водяную баню 37 °C в течение 1 мин.
    6. Остановите ферментативное пищеварение, добавив 1 мл теплого чистого FBS. С помощью микропипетки 1 мл механически аспирировать и дозировать среду, чтобы полностью диссоциировать диск.
      ВНИМАНИЕ: Этап аспирации/дозирования должен быть очень быстрым, иначе шарики будут оседать внутри наконечника.
    7. Центрифугируйте пробирку в течение 5 мин при 1,575 × г. Повторно суспендировать гранулу в 3 мл 1x PBS с добавлением 10% FBS.
    8. Оставьте шарики в осадок на 5 с, прежде чем собирать супернатант и фильтровать его через клеточный сетчатый фильтр 35 мкм, помещенный на коллекторную трубку. Центрифугировать извлеченный фильтрат в течение 5 мин при 1,575 × г. Подсчитайте клетки с трипановым синим цветом, чтобы оценить жизнеспособность и приступить к анализу проточной цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество жизнеспособных клеток, извлеченных после инкубации трипана, составляет ~ 1-2 × 105 клеток на переваренную вставку.
  3. Проточная цитометрическая маркировка извлеченных клеток
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, извлеченные из 3D-структуры, подобной костному мозгу, могут быть помечены и дополнительно проанализированы с помощью проточной цитометрии. Используйте смесь антител для обнаружения различных компартментов после 3D-диссоциации. Здесь CD45 (окрашивает интересующие гематологические клетки), CD31 (окрашивает сосудистый компартмент) и CD73 (окрашивает остеобластный компартмент) использовали при 1 мкл в 50 мкл PBS + 2% FBS. Храните все подготовленные клетки и антитела на льду (4 ° C) вдали от света в течение всего процесса.
    1. Повторно суспендировать гранулы в смеси антител и инкубировать в течение 30-40 мин на льду вдали от света.
    2. Добавьте 1 мл PBS + 2% FBS для промывки клеток и центрифуги в течение 5 мин при 1,575 × г.
    3. Повторно суспендировать извлеченную гранулу в 200 мкл 1x PBS + 10% FBS с добавлением 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, разбавленный 1:2000).
    4. Анализ пробирок в цитометре с использованием следующих параметров: FSC 297 PnV; SSC 220 PnV; DAPI 400 PnV; CD45 APC 505 PnV. Используйте график FSC-H и FSC-W для определения популяции синглетов. В синглетической фракции используйте график DAPI-A против FSC-A для определения жизнеспособной популяции клеток (DAPI-отрицательный). С ранее закрытой DAPI-отрицательной популяцией используйте график APC-A против FSC-A для определения CD45-положительной популяции.
  4. Фиксация 3D костно-подобной структуры
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация 3D BM-подобной структуры обычно выполняется для иммуногистохимии или иммунофлуоресценции для визуализации клеток in situ и для дальнейшего специфического окрашивания.
    1. Чтобы закрепить BM-подобную структуру, перенесите вставку (шаг 4.3) со старой пластины на новую 6-луночную пластину, заполненную 1x PBS. Затем аккуратно замените носитель внутри вставки на 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не промывайте сформированную структуру PBS; давление жидкости может нарушить 3D-структуру.
    2. После того, как вставка будет промыта, поместите ее в новую 6-луночную пластину и заполните как колодец, так и вставку свежеоткрытым параформальдегидом (PFA) 4% (разбавленным 16% в 1x PBS).
    3. Дайте процессу фиксации продолжаться в течение 4 ч при комнатной температуре вдали от света.
    4. В конце процесса фиксации вымойте вставку один раз с 1x PBS и храните ее при 4 °C вдали от света.
    5. Отрежьте мембрану в нижней части вкладыша, как описано на этапе 5.2.2, чтобы извлечь твердый диск.
    6. Инкубируйте диск 4x в течение 48 ч в ЭДТА (0,5 М, рН 8) с целью декальцинации структуры.
    7. Встройте структуру в парафин и нарежьте срезы толщиной 4 мкм.
    8. Используя автоматизированный иммуностинер, инкубируйте участки с антителами против CD45, CD73 и Ki67. Визуализируйте окрашивание пероксидазой редьки (HRP) против кролика или мышиного хрена (HRP) и 3,3'-диаминобензидином в качестве хромогенного субстрата и контрокрашиванием с гематоксилином Гилла.

Результаты

Используя этот протокол, можно рекапитулировать минимальное, in vitro, 3D, человеческое BM-подобное микроокружение, из которого могут быть извлечены жизнеспособные клетки из трех различных клеточных компартментов (рисунок 1). Действительно, после желаемого воздействия 3D-BM-подобные структуры могут быть диссоциированы, а МСК, эндотелиальные клетки и кроветворные клетки могут быть оценены / охарактеризованы с помощью проточной цитометрии (рисунок 2A). До сих пор результаты показывают, что можно поддерживать гематологические клетки в течение не менее 6 недель в рамках 3D-модели, прежде чем извлекать жизнеспособные клетки (рисунок 2B). Однако для оценки предела этой 3D-модели требуются будущие исследования. Кроме того, при необходимости можно заменить клеточную линию HS27A первичным нормальным костным мозгом (NBM) MSC или острым миелоидным лейкозом (AML) MSC в этой 3D BM-подобной модели (рисунок 2C) или заменить кроветворную клеточную линию первичными HSC (рисунок 2D). Более того, при анализе взаимодействий между клеточными компартментами или локализации специфических маркеров, представляющих интерес, 3D BM-подобные структуры могут фиксироваться и дополнительно обрабатываться с помощью парафинового встраивания и иммунохимии. Например, анализ содержимого CD45 (гематологический) или CD73 (MSC) проводился с использованием этих 3D-моделей (рисунок 3).

figure-results-1652
Рисунок 1: Принципиальная схема первоначальной настройки человеческой 3D BM-подобной системы. После 3 недель совместной культивирования твердая БМ-подобная ткань может быть собрана или засеяна кроветворными клетками (как в примере) или другими типами клеток. При необходимости, как только клетки прилипают, может быть добавлено лечение и средние изменения проводятся два раза в неделю. В конце эксперимента BM-подобные структуры могут быть либо зафиксированы и дополнительно обработаны для исследований локализации, либо диссоциированы для оценки содержимого клеток. Сокращения: BCP = двухфазный фосфат кальция; БМ = костный мозг. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2659
Рисунок 2: Восстановление жизнеспособных клеток из разных компартментов после культивирования в BM-подобной 3D-модели. (A) Типичная картина восстановления клеток из одной диссоциированной BM-подобной структуры с 9,84% жизнеспособных клеток (DAPI-). Репрезентативные участки кроветворных (66,6% CD45+), MSC/остеобластных клеток (88,6% CD73+ клеток в CD45-популяции) и эндотелиальных клеток (22,1% CD31+ клеток в CD45-популяции), восстановленных после 3D-диссоциации. (B) 3D-система позволяет поддерживать жизнеспособные кроветворные клетки (CD45+) до 6 недель после культивирования. (C) 3D-системы, изготовленные из первичных МСК из NBM или AML вместе с HMEC-1 (окрашенным Kusabira-Orange в этом примере), могут поддерживать HSC (3,88% CD45 + DAPI-клеток) in situ (D). Сокращения: БМ = костный мозг; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; MSC = мезенхимальная стволовая клетка; НБМ = нормальный костный мозг; ОМЛ = острый миелоидный лейкоз; ГСК = гемопоэтические стволовые клетки; FSC = прямой разброс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4209
Рисунок 3: Визуализация клеточных взаимодействий и пролиферации в BM-подобной 3D-модели. Системы собирали после 3 недель совместной 3D-культуры с HS27A и HMEC-1 и добавления кроветворных клеток через 1 неделю. Типичное иммуногистохимическое окрашивание (визуализированное в коричневом цвете) С помощью IHC было визуализировано с использованием пероксидазы редьки против кролика или мыши и визуализировано с помощью 3,3'-диаминобензидина в качестве хромогенного субстрата и контрокрашено гематоксилином Гилла и показывает наличие либо кроветворных клеток с CD45 (левая панель), либо стромальных клеток с CD73 (средняя панель), либо пролиферации всех клеток с KI67 (правая панель). Шкала стержней = 50 мкм. Сокращения: БМ = костный мозг; IHC = иммуногистохимия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Одной из текущих проблем, с которыми сталкиваются исследования физиологических и связанных с ними патологических проблем человека, является отсутствие моделей, точно имитирующих сложные функции органов человека. В случае 3D-моделей BM человека многие модели используют гидрогели и частично воспроизводят BM, иллюстрируя силу условий 3D-культуры по сравнению с классическими 2D-культурами в обеспечении, например, лучшей остеобластной дифференциации27,28. Тем не менее, несмотря на хорошую воспроизводимость и простоту использования, эти системы не имитируют 3D-структуру и архитектуру BM человека, что может значительно повлиять на дальнейший анализ. Технологические достижения позволили ученым лучше воспроизводить естественную человеческую остеобластную нишевую среду, используя систему биореакторов на основе перфузии для поддержания некоторых свойств HSC29. Разработка микрофлюидных устройств привела к новым подходам к воспроизведению соответствующей костно-подобной структуры, но до сих пор достигла только ограниченных характеристик костного мозга и, следовательно, ограничила применение 30,31,32,33.

Достижения в области материаловедения способствовали разработке широкого спектра природных или синтетических биоматериалов, которые могут быть использованы для разработки соответствующих систем 3D-культур кости. Однако такие системы иногда трудно разработать в стандартных биологических лабораториях, не имеющих собственных навыков в области биофизики. Более того, в большинстве случаев эти системы достигают ограниченной способности имитировать 3D-структуру человеческой кости, включая микросреду BM, и используют большое количество цитокинов и факторов роста, создавая искусственно богатую культуральную среду34.

Выбор индуцировать остеобластную дифференцировку, а не адипоцитарную дифференцировку, был основан на том факте, что преостеобласты и остеобласты были описаны как часть эндостеальной ниши35. Это идентифицировало остеобластные клетки как запрошенные компоненты как кости, так и костного мозга. Среди клеточных компонентов костного мозга эндотелиальные и стромальные клетки занимают большую долю микросреды. Кроме того, эти два типа клеток продуцируют структурные неклеточные компоненты внеклеточного матрикса и цитокины, участвующие в регуляции гомеостаза и дифференцировки, запрошенные здесь для создания кальцинированной структуры. Таким образом, это оправдывает использование эндотелиальных и стромальных клеток, а также наш выбор клеточных линий, чтобы обеспечить легкий доступ и повысить воспроизводимость между лабораториями. Поскольку культура линии HMEC-1 была более стабильной с течением времени, эта клеточная линия была сохранена для разработки 3D-системы. Для стромальных клеток мы сравнили в 2D-культуре способность дифференцировки остеобластов стромальных клеточных линий, полученных из нормального костного мозга: HS5 и HS27A. Мы обнаружили, что линия HS5 не дифференцируется так сильно, как линия HS27A в 3D-системе, сгенерированной с любой из клеточных линий. В связи с этим попытки заменить ячейки HS27A линией HS5 привели к образованию менее жесткой структуры, что позволяет предположить, что HS27A более подходят.

Клеточные линии HS27A и HMEC-1 культивировались в различных комбинациях сред, в которых одна из них вызывает лучшую жесткую структуру и выравнивания HMEC-1 вдоль остеобластных структур, так что производство внеклеточного матрикса приносит относительную жесткость основной структуре. Анализ прогресса дифференцировки при D14 показал, что дифференциация была более продвинутой при D21 (измерение BSP, позднего остеобластного маркера), с соотношением 1:2 для HMEC-1:HS27A и с лучшими результатами, когда были введены 2 × 106 HS27A. Эндотелиальные клетки также играют важную роль в регуляции гомеостаза и дифференцировки (среди прочего, за счет поставок цитокинов). Тот факт, что клетки HMEC-1 поддерживаются в этой системе, указывает на то, что они могут, по крайней мере, выполнять эту роль, и это способствует легитимности нашей модели. Для эндотелиальной линии HMEC-1 было важно ввести ее достаточно рано, чтобы ее можно было правильно интегрировать в структуру и с надеждой, что эти клетки смогут образовывать выравнивания или даже трубки внутри структуры. Кокультурные испытания HS27A и HMEC-1 проводились путем введения последнего на разных стадиях: D0, D7, D14; не наблюдалось заметных различий ни в дифференцировке стромальных клеток, ни в поддержании или позиционировании эндотелиальных клеток. Таким образом, эти клетки были введены в начале процесса. Кроветворные клетки были введены в то время, когда остеобластная дифференцировка была бы достаточно продвинутой, чтобы способствовать клеточным взаимодействиям. Этот выбор был обусловлен также тем, что эта остеобластная дифференцировка обусловлена использованием среды, которая, согласно нашим тестам, не полностью поддерживает поддержание кроветворных клеток. Гематологические клетки могут быть либо клеточными линиями, либо первичными кроветворными клетками BM CD45.

Из этой 3D-модели мы могли бы предусмотреть замену каждого типа клеток первичными клетками, нормальными или патологическими, или даже добавить другие типы клеток для повышения биомиметических свойств, таких как иммунные клетки, адипоциты или фибробласты26. Фактически, клеточная линия HS27A была заменена первичными МСК BM с низкой проходимостью. Аналогичным образом, гематологические клеточные линии были заменены первичными кроветворными клетками БМ. Однако замена клеток HMEC-1 первичными эндотелиальными клетками еще не была проверена. В настоящее время эта модель все еще может быть улучшена с точки зрения представления сосудов, поскольку, хотя эндотелиальные клетки присутствуют и правильно взаимодействуют с другими клетками из микросреды (например, кроветворными клетками), они не образуют структурированных сосудов, что исключает перфузию потока для имитации функциональных кровеносных сосудов. В целом, это может постепенно увеличить сложность и репрезентативность текущей минимальной 3D-модели. Добавление других типов клеток может облегчить исследования, изучающие другие вопросы, такие как важность местного воспаления БМ или резистентность к иммунотерапии.

Тем не менее, эта 3D-система нуждается в 3 неделях, прежде чем можно будет добавить клетки, представляющие интерес, гематологические клетки или эпителиальные раковые клетки, если процесс метастазирования оценивается. Необходимо поддерживать стерильные условия, так как изменения среды два раза в неделю иногда могут привести к загрязнению среды. Кроме того, поскольку некоторые клетки могут мигрировать через поры вставки и начинают рассеиваться в лунке, что приводит к увеличению потребления среды, рекомендуется регулярный мониторинг.

Мы описали здесь 3D-каркас, позволяющий остеобластную дифференциацию, и разработали соответствующую, in vitro, 3D, человеческую БМ-подобную микросреду. Эта система позволяет проводить анализ in situ и извлекать живые клетки. Эта система предоставляет новый и очень гибкий инструмент, воспроизводимый и удобный для пользователя, с широким спектром приложений для изучения взаимодействий и механизмов в микросреде БМ человека.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Мы благодарим. Баттистона-Монтань и А. Жамбона из цитометрической платформы CRCL и Н. Гадота и К. Ленева из Исследовательской платформы патологии, Департамент трансляционных исследований и инноваций, Центр Леон Берар. Авторы благодарны Б. Мэншипу за английское издание. Эта работа финансировалась Inserm и FI-LMC для V.M.S., а S.L.K.A. и L.B. были поддержаны грантом société Française d'Hématologie.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate SystemMERCK SIGMAD7304IHC staining
5 mL PipetteSARSTEDT861253001Medium change
Anti Mouse HRPThermofisher62-6520IHC secondary staining
Anti Rabbit HRPThermofisher31460IHC secondary staining
Ascorbic Acid 250 μMMERCK SIGMAA92902ODM medium
BCPCaP Biomaterials
LLC-US		3D Beads
Beta Glycerophosphate 10 mMMERCK SIGMAG9422ODM medium
CD31-BV711BD7440783D endothelial Cell population labelling
CD34-APCBD5558243D immature hematological Cell population labelling
CD38-PE-Cy5BD5554613D progenitor hematological Cell population labelling
CD45Miltenyibiotec130-110-637IHC staining of hematological cells
CD45-APCBD5554853D hematological Cell population labelling
CD45-BV500BD5607773D hematological Cell population labelling
CD73Miltenyibiotec130-120-066IHC staining of stromal compartment
CD73-BV605BD5631993D osteoblastic Cell population labelling
Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tubeFALCON352235Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads
CollagenaseMERCK SIGMAC2674-1G3D enzymatic dissociation
Cytometry filtration tubeThermofisher105858013D retrieved cells filtration
Cytometry tubeThermofisher101001513D retrieved cells labelling 
DAPI (Solution 12)Chemometec910-30123D retrieved viable cells labelling
DexamethasoneThermofisherA13449ODM medium
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mLThermofisher31966021ODM medium
EGFMERCK SIGMAE9644-0.2MG HMED-1 medium
Eppendorf 1.5 mL tubeSARSTEDT72696For beads autoclave and supernatant retieve
Falcon 15 mLFALCON352096For 3D Dissociation
FBSDUTSCHERS1900-500To supplement culturing medium and stop trypsin action
GlutamaxThermofisherA1286001glutamine substitute for HMED-1 medium
Hematoxylin Solution, Gill No. 1MERCK SIGMAGHS132-1LIHC staining
HMEC-1ATCCCRL-32433D endothelial Cell population 
HS27AATCCCRL-24963D osteoblastic Cell population 
HydrocortisoneMERCK SIGMAH0135-1MGHMED-1 medium
Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well PlatesTHERMO SCIENTIFIC NUNC140627To harvest cells and form a 3D Bone like structure
KI-67 IHCThermofisherMA5-14520IHC staining of proliferative cells
MCDB 131 Medium, no glutamineThermofisher10372019HMED-1 medium
Micropipette (1,000 µL)Eppendorf 4924000088Medium change
PBS D 1xThermofisher14190169Cells/ Insert wash
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermofisher15140122To supplement culturing medium 
PFA (Formaldehyde 16%)EUROMEDEXEM-157103D Fixation (dilution with PBS 1X)
RMPI 1640 medium, glutamax supplementThermofisher61870044Cuture medium
Scalpel  FISHER SCIENTIFIC117683533D membrane cutting
Six well plateFALCON3530463D culture
TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x)Thermofisher253000963D enzymatic dissociation

Ссылки

  1. Janel, A., et al. Bone marrow hematons: An access point to the human hematopoietic niche. American Journal of Hematology. 92 (10), 1020-1031 (2017).
  2. Blazsek, I., et al. The hematon, a morphogenetic functional complex in mammalian bone marrow, involves erythroblastic islands and granulocytic cobblestones. Experimental Hematology. 23 (4), 309-319 (1995).
  3. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  4. Kopp, H. -G., Avecilla, S. T., Hooper, A. T., Rafii, S. The bone marrow vascular niche: home of HSC differentiation and mobilization. Physiology. 20 (5), 349-356 (2005).
  5. Hawley, R. G., Ramezani, A., Hawley, T. S. Hematopoietic stem cells. Methods in Enzymology. 419, 149-179 (2006).
  6. Gulati, G. L., Ashton, J. K., Hyun, B. H. Structure and function of the bone marrow and hematopoiesis. Hematology/Oncology Clinics of North America. 2 (4), 495-511 (1988).
  7. Dean, L. Blood and the Cells it Contains. Blood Groups and Red Cell Antigens. National Center for Biotechnology Information. , https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK2263/ (2005).
  8. Kandarakov, O., Belyavsky, A., Semenova, E. Bone marrow niches of hematopoietic stem and progenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (8), 4462(2022).
  9. Batsivari, A., et al. Dynamic responses of the haematopoietic stem cell niche to diverse stresses. Nature Cell Biology. 22 (1), 7-17 (2020).
  10. Tikhonova, A. N., et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature. 569 (7755), 222-228 (2019).
  11. Tjin, G., et al. Imaging methods used to study mouse and human HSC niches: Current and emerging technologies. Bone. 119, 19-35 (2019).
  12. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (5), 345-361 (2021).
  13. Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030(2020).
  14. Walasek, M. A., van Os, R., de Haan, G. Hematopoietic stem cell expansion: challenges and opportunities. Annals of the New York Academy of Sciences. 1266 (1), 138-150 (2012).
  15. Discher, D., et al. Biomechanics: cell research and applications for the next decade. Annals of Biomedical Engineering. 37 (5), 847-859 (2009).
  16. Raic, A., Rödling, L., Kalbacher, H., Lee-Thedieck, C. Biomimetic macroporous PEG hydrogels as 3D scaffolds for the multiplication of human hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 35 (3), 929-940 (2014).
  17. Gamblin, A. L., et al. Osteoblastic and osteoclastic differentiation of human mesenchymal stem cells and monocytes in a miniaturized three-dimensional culture with mineral granules. Acta Biomaterialia. 10 (12), 5139-5147 (2014).
  18. Leisten, I., et al. 3D co-culture of hematopoietic stem and progenitor cells and mesenchymal stem cells in collagen scaffolds as a model of the hematopoietic niche. Biomaterials. 33 (6), 1736-1747 (2012).
  19. Taqvi, S., Roy, K. Influence of scaffold physical properties and stromal cell coculture on hematopoietic differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6024-6031 (2006).
  20. Chou, D. B., et al. On-chip recapitulation of clinical bone marrow toxicities and patient-specific pathophysiology. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 394-406 (2020).
  21. Kotha, S. S., et al. Engineering a multicellular vascular niche to model hematopoietic cell trafficking. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 77(2018).
  22. Marturano-Kruik, A., et al. Human bone perivascular niche-on-a-chip for studying metastatic colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (6), 1256-1261 (2018).
  23. Panoskaltsis, N., Mantalaris, A., Wu, J. H. D. Engineering a mimicry of bone marrow tissue ex vivo. Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 28-35 (2005).
  24. Behrmann, L., Wellbrock, J., Fiedler, W. Acute myeloid leukemia and the bone marrow niche-take a closer look. Frontiers in Oncology. 8, 444(2018).
  25. Kusumbe, A. P. Vascular niches for disseminated tumour cells in bone. Journal of Bone Oncology. 5 (3), 112-116 (2016).
  26. Voeltzel, T., et al. A minimal standardized human bone marrow microphysiological system to assess resident cell behavior during normal and pathological processes. Biomaterials Science. 10 (2), 485-498 (2022).
  27. Costantini, M., et al. 3D bioprinting of BM-MSCs-loaded ECM biomimetic hydrogels for in vitro neocartilage formation. Biofabrication. 8 (3), 035002(2016).
  28. Chatterjee, K., et al. The effect of 3d hydrogel scaffold modulus on osteoblast differentiation and mineralization revealed by combinatorial screening. Biomaterials. 31 (19), 5051-5062 (2010).
  29. Bourgine, P. E., et al. In vitro biomimetic engineering of a human hematopoietic niche with functional properties. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (25), 5688-5695 (2018).
  30. Carvalho, M. R., Reis, R. L., Oliveira, J. M. Mimicking the 3D biology of osteochondral tissue with microfluidic-based solutions: breakthroughs towards boosting drug testing and discovery. Drug Discovery Today. 23 (3), 711-718 (2018).
  31. de al Puente, P., et al. 3D tissue-engineered bone marrow as a novel model to study pathophysiology and drug resistance in multiple myeloma. Biomaterials. 73, 70-84 (2015).
  32. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  33. Mansoorifar, A., Gordon, R., Bergan, R., Bertassoni, L. E. Bone-on-a-chip: microfluidic technologies and microphysiologic models of bone tissue. Advanced Functional Materials. 31 (6), 2006796(2021).
  34. Nelson, M. R., et al. A multi-niche microvascularized human bone marrow (hBM) on-a-chip elucidates key roles of the endosteal niche in hBM physiology. Biomaterials. 270, 120683(2021).
  35. Galán-Díez, M., Kousteni, S. The osteoblastic niche in hematopoiesis and hematological myeloid malignancies. Current Molecular Biology Reports. 3 (2), 53-62 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены