JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Сократительная способность актомиозина играет важную роль в морфогенезе клеток и тканей. Тем не менее, сложно оперативно манипулировать сократительной способностью актомиозина in vivo . Этот протокол описывает оптогенетическую систему, которая быстро ингибирует Rho1-опосредованную сократительную способность актомиозина у эмбрионов дрозофилы , выявляя немедленную потерю эпителиального напряжения после инактивации актомиозина in vivo.

Аннотация

Сократительные силы, генерируемые актином и немышечным миозином II («сократительная способность актомиозина»), имеют решающее значение для морфологических изменений клеток и тканей в различных масштабах длины, таких как деление клеток, миграция клеток, сворачивание эпителия и морфогенез ветвления. Глубокое понимание роли сократительной способности актомиозина в морфогенезе требует подходов, позволяющих осуществлять быструю инактивацию актомиозина, чего трудно достичь с помощью традиционных генетических или фармакологических подходов. Представленный протокол демонстрирует использование системы оптогенетической димеризации Opto-Rho1DN на основе CRY2-CIBN для ингибирования сократительной способности актомиозина у эмбрионов дрозофилы с точным временным и пространственным контролем. В этой системе CRY2 сливается с доминирующей отрицательной формой Rho1 (Rho1DN), тогда как CIBN закрепляется на плазматической мембране. Опосредованная синим светом димеризация CRY2 и CIBN приводит к быстрой транслокации Rho1DN из цитоплазмы в плазматическую мембрану, где он инактивирует актомиозин путем ингибирования эндогенного Rho1. Кроме того, в данной статье представлен подробный протокол сопряжения Opto-Rho1DN-опосредованной инактивации актомиозина с лазерной абляцией для изучения роли актомиозина в генерации эпителиального натяжения при формировании вентральной борозды дрозофилы . Этот протокол может быть применен ко многим другим морфологическим процессам, включающим сократительную способность актомиозина у эмбрионов дрозофилы с минимальными модификациями. В целом, этот оптогенетический инструмент является мощным подходом к анализу функции сократительной способности актомиозина в контроле механики тканей во время динамического ремоделирования тканей.

Введение

Сократительная способность актомиозина, сократительная сила, оказываемая немышечным миозином II (далее «миозин») на F-актиновую сеть, является одной из наиболее важных сил в изменении формы клеток и управлении морфогенезом на тканевом уровне 1,2. Например, активация сократительной способности актомиозина в апикальном домене эпителиальных клеток приводит к апикальному сужению, что способствует различным морфогенетическим процессам, включая сворачивание эпителия, экструзию клеток, расслоение и заживление ран 3,4,5,6,7 . Активация миозина требует фосфорилирования его регуляторной легкой цепи. Эта модификация ослабляет ингибирующую конформацию молекул миозина, позволяя им образовывать биполярные пучки миозиновых филаментов с несколькими головными доменами на обоих концах. Биполярные миозиновые филаменты управляют антипараллельным движением актиновых филаментов и приводят к генерации сократительной силы 1,8,9.

Эволюционно консервативная малая ГТФаза семейства Rho RhoA (Rho1 у дрозофилы) играет центральную роль в активации сократительной способности актомиозина в различных клеточных контекстах10,11. Rho1 функционирует как бимолекулярный переключатель, связывая либо GTP (активная форма), либо GDP (неактивная форма)12. Цикл между ГТФ- или ГДФ-связанным Rho1 регулируется его ГТФаза-активирующими белками (GAP) и гуаниновыми нуклеотидными факторами обмена (ГЭФ)13. ГЭФ функционируют для облегчения обмена ВВП на ГТП и, таким образом, активизируют деятельность Rho1. GAPs, с другой стороны, усиливают активность ГТФазы Rho1 и, таким образом, деактивируют Rho1. Активированный Rho1 способствует сократительной способности актомиозина, взаимодействуя и активируя его нижележащие эффекторы, Rho-ассоциированную киназу (Rok) и Diaphanous14. Rok индуцирует активацию миозина и сократительную способность актомиозина путем фосфорилирования регуляторной легкой цепи миозина15. Кроме того, Rok также ингибирует миозин-регуляторную фосфатазу легкой цепи и, следовательно, способствует дальнейшей сборке миозиновых филаментов16. Rok также может фосфорилировать киназы LIM, которые при активации предотвращают распад актина путем фосфорилирования и ингибирования фактора деполимеризации актинакофилина 17,18. Diaphanous - это актиновый нуклеатор семейства форминов, который способствует полимеризации актина, обеспечивая основу для взаимодействия миозина с 19,20,21.

В то время как клеточные механизмы, активирующие сократительную способность актомиозина, хорошо изучены, наше понимание его функции в регуляции динамического ремоделирования тканей остается неполным. Чтобы восполнить этот пробел в знаниях, требуются подходы, которые могут быстро инактивировать актомиозин в определенных участках тканей in vivo и регистрировать непосредственное влияние на поведение и свойства тканей. В данном протоколе описано использование оптогенетического подхода для резкого ингибирования сократительной способности актомиозина при инвагинации мезодермы дрозофилы с последующим измерением натяжения эпителия с помощью лазерной абляции. Во время гаструляции дрозофилы вентрально локализованные клетки-предшественники мезодермы подвергаются апикальному сужению и инвагинируются с поверхности эмбриона, образуя передне-заднюю ориентированную борозду22,23. Образование вентральных борозд издавна использовалось в качестве модели для изучения механизма складчатости эпителия. Формирование вентральной борозды осуществляется дорсально-вентральной системой паттерна у дрозофилы24,25,26,27. Экспрессия двух транскрипционных факторов, Twist и Snail, расположенных на вентральной стороне эмбриона, контролирует формирование вентральной борозды и определяет судьбу мезодермальных клеток28. Twist и Snail активируют рекрутирование Rho1 GEF RhoGEF2 к вершине клеток-предшественников мезодермы через рецепторный путь, связанный с G-белком, и адапторный белок RhoGEF2, T48 29,30,31,32,33. Затем RhoGEF2 активирует миозин по всей апикальной поверхности потенциальной мезодермы через путь Rho-Rho киназы 34,35,36,37,38,39. Активированный миозин образует надклеточную актомиозиновую сеть по всей апикальной поверхности зачатка мезодермы, сокращения которой приводят к сужению апикальной ткани и приводят к быстрому увеличению натяжения апикальной ткани 14,37,40.

Оптогенетический инструмент, описанный в этом протоколе, Opto-Rho1DN, ингибирует сократительную способность актомиозина через зависимую от синего света рекрутацию плазматической мембраной доминантной отрицательной формы Rho1 (Rho1DN)41. Мутация T19N в Rho1DN устраняет способность мутантного белка обменивать GDP на GTP и, таким образом, делает белоквечно неактивным. Последующая мутация в Rho1DN, C189Y, устраняет его наивный сигнал нацеливания на мембрану42,43. Когда Rho1DN вводится в плазматическую мембрану, он связывается с Rho1 GEF и захватывает их, тем самым блокируя активацию Rho1, а также Rho1-опосредованную активацию миозина и актина34,44. Рекрутирование Rho1DN плазматической мембраной достигается с помощью светозависимого модуля димеризации, полученного из Cryptochrome 2 и его связывающего партнера CIB1. Криптохром 2 представляет собой фоторецептор криптохрома, активируемый синим светом, у Arabidopsis thaliana45. Криптохром 2 связывается с CIB1, основным белком спирали-петля-спираль, только в его фотовозбужденном состоянии45. Позже было обнаружено, что консервативная N-концевая область гомологии фотолиазы (PHR) из криптохрома 2 (CRY2PHR, далее именуемая CRY2) и N-концевой домен (aa 1-170) CIB1 (далее CIBN) важны для светоиндуцированной димеризации46. Opto-Rho1DN содержит два компонента. Первым компонентом является белок CIBN, слитый с якорем CAAX, который локализует белок на плазматической мембране47. Второй компонент — CRY2 с мечением mCherry, сплавленный с Rho1DN41. При отсутствии синего света CRY2-Rho1DN остается в цитоплазме. При стимуляции синим светом CRY2-Rho1DN воздействует на плазматическую мембрану посредством взаимодействия между мембранозакрепленным CIBN и возбужденным CRY2. Opto-Rho1DN может быть активирован ультрафиолетовым светом A (UVA) и синим светом (400-500 нм, пик активации 450-488 нм) или импульсным лазером 830-980 нм при выполнении двухфотонной стимуляции41,46,47,48. Таким образом, Opto-Rho1DN стимулируется длинами волн, обычно используемыми для возбуждения GFP (488 нм для однофотонной визуализации и 920 нм для двухфотонной визуализации). В отличие от этого, длины волн, обычно используемые для возбуждения mCherry (561 нм для однофотонной визуализации и 1040 нм для двухфотонной визуализации), не стимулируют оптогенетический модуль и, следовательно, могут быть использованы для предстимуляционной визуализации. Протокол описывает подходы, используемые для минимизации риска нежелательной стимуляции во время манипуляций с образцом.

Лазерная абляция широко используется для обнаружения и измерения напряжения в клетках и тканях49. Предыдущие исследования показали, что при надлежащем контроле интенсивности лазера двухфотонная лазерная абляция с использованием фемтосекундного лазера ближнего инфракрасного диапазона может физически повредить некоторые субклеточные структуры (например, кортикальные актомиозиновые сети), не вызывая разрыва плазматической мембраны. Если ткань находится под напряжением, лазерная абляция интересующей области внутри ткани приводит к немедленной отдаче наружу клеток, прилегающих к абляционной области. Скорость отдачи является функцией величины натяжения и вязкости среды (цитоплазмы), окружающей структуры, подвергающиеся отдаче49. Из-за превосходной глубины проникновения лазеров ближнего инфракрасного диапазона и способности достигать хорошо ограниченной фокальной абляции, двухфотонная лазерная абляция особенно полезна для обнаружения натяжения тканей in vivo. Как показано в этом протоколе, этот метод может быть легко комбинирован с опто-Rho1DN-опосредованной инактивацией сократимости актомиозина для исследования прямого влияния Rho1-зависимой клеточной сократимости на механику тканей во время динамического ремоделирования тканей.

протокол

1. Установка генетического скрещивания и подготовка чашки для сбора яйцеклеток

  1. Селекция самок мух (девственных) из оптогенетической линии UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) на подушечке CO2 под стереомикроскопом и установили скрещивание с самцами мух из материнской линии драйвера GAL4 67 Sqh-mCherry; 15 Е-кадгерин-GFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 67 и 15 означают материнский тубулин-GAL4, вставленный во вторую (II) и третью (III) хромосомы, соответственно52. Линия GAL4, используемая в этом протоколе, также экспрессирует регуляторную легкую цепь миозина Sqh (Spaghetti squash)37 и меченую GFP E-кадгерин53. Мухи из оптогенетической линии все еще могут содержать хромосомы FM7 и TM6. Мухи из материнской линии драйверов GAL4 все еще могут содержать хромосомы балансира CyO и TM3.
  2. Через ~10 дней отобрать самок F1 со следующим генотипом: UASp-CIBNpm/+; 67 кв.мВишня/+; 15 Е-кадгерин-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-мВишня. Установите чашку для сбора яиц с самцами мух.
    1. Убедитесь, что самки мух с правильным генотипом не содержат хромосом-балансиров (т.е. они не должны иметь курчавых крыльев [Cy], коротких щетинок [Sb], глаз в форме перемычки или почки [B] или дополнительных щетинок плечевой кости [Hu]), которые являются маркерами балансиров CyO, TM3, FM7 и TM6, используемых при создании запасов, соответственно. Накройте чашку тарелкой с яблочным соком с оттенком свежей дрожжевой пасты на поверхности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: У самок F1 оптогенетические компоненты выражены по материнской линии. Таким образом, самки F1, используемые для установки чашки, не обязательно должны быть девственницами. Для удобства рекомендуется использовать самцов мух из той же популяции F1.
  3. Храните чашку в картонной коробке, покрытой алюминиевой фольгой, чтобы избежать возможной утечки света из окружающей среды. Меняйте тарелку с яблочным соком каждый день для чашек, хранящихся при комнатной температуре (~21-23 °C), или каждые два дня для чашек, хранящихся при температуре 18 °C.
    1. Непосредственно перед сменой тарелки стукните чашкой по плоской поверхности (например, сверху стола), чтобы мухи оставались на дне чашки и не позволяли им вырваться наружу. Замените тарелку с яблочным соком в темной комнате и используйте для освещения налобный фонарь с красным светом (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для увеличения экспрессии конструктов, находящихся под контролем материнского тубулина-GAL4 и UASp, рекомендуется держать чашку при температуре 18 °C в течение как минимум 3 дней до забора эмбрионов. Этот инкубационный период также позволяет мухам адаптироваться к чашке и хорошо питаться дрожжевой пастой для достижения оптимальной яйценоскости.

2. Забор эмбрионов на нужном этапе и подготовка их к оптогенетической стимуляции

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы сбора и подготовки образцов должны выполняться в темном помещении с использованием «безопасного света» (например, красного света) для освещения. Оптогенетические компоненты чрезвычайно чувствительны к окружающему свету. Даже малейшее воздействие окружающего света приводит к преждевременной стимуляции образца. Как правило, свет в зелено-красном диапазоне (>532 нм) не вызывает нежелательной стимуляции.

  1. Для сбора эмбрионов на ранних стадиях эмбриогенеза поместите новую тарелку с яблочным соком в чашку за 8-16 ч до забора эмбрионов (при температуре 18 °C).
  2. Во время забора эмбрионов смените тарелку с яблочным соком. Наклейте этикетку на пластину, снятую с чашки, и покройте поверхность пластины тонким слоем галогеноуглеродного масла 27 (см. таблицу материалов). Подождите 30-60 с, чтобы яичная скорлупа стала прозрачной.
  3. Поместите оранжево-красный пластиковый щиток (см. Таблицу материалов) на столик вертикального стереоскопа. Расположение оранжево-красного экрана предотвращает нежелательную стимуляцию во время освещения образца, блокируя сине-зеленые длины волн от проходящего света.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе для забора эмбрионов используется вертикальный стереоскоп (см. Таблицу материалов).
  4. Поместите тарелку с яблочным соком поверх оранжево-красного щитка. Включите проходящий свет стереомикроскопа, чтобы осветить образец. Соберите 5-15 эмбрионов на соответствующем этапе из пластины с яблочным соком с помощью пинцета. Не сдавливайте эмбрионы пинцетом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе соответствующий эмбрион должен находиться на ранней-средней стадии клеточной структуры. Эмбрион на этой стадии должен иметь темно-непрозрачный желток, окруженный прозрачным, однородным слоем периплазмы, содержащим формирующиеся клетки бластодермы. Передний край борозд расщепления («фронт целлюляризации»), выступающий в виде непрерывной линии, параллельной поверхности зародыша, не должен проходить и половины глубины периплазмы.
  5. Аккуратно промокните эмбрионы бумажным полотенцем (~1,5 см × 1,5 см), чтобы удалить излишки жира с эмбрионов с помощью пинцета.
  6. Добавьте несколько капель свежеприготовленного 40%-ного отбеливателя (~3% гипохлорита натрия; см. Таблицу материалов) в новый небольшой квадратный кусочек бумажного полотенца (~1,5 см × 1,5 см) с помощью пластиковой пипетки для переноса так, чтобы бумажное полотенце покрылось тонким слоем отбеливателя. Перенесите эмбрион с сухого бумажного полотенца на пропитанное отбеливателем бумажное полотенце с помощью пинцета и убедитесь, что эмбрионы пропитаны отбеливателем. Подождите 2-4 минуты, пока эмбрион не станет дехорионированным.
  7. После дехорионации используйте пинцет, чтобы промокнуть квадратное бумажное полотенце о большой лист папиросной бумаги, чтобы удалить излишки отбеливателя. Следите за тем, чтобы сторона с эмбрионами была обращена вверх.
  8. Чтобы промыть эмбрионы, с помощью пинцета аккуратно смочите квадратное бумажное полотенце в капле деионизированной воды и быстро промокните им большой кусок папиросной бумаги. Повторите этот процесс восемь раз, чтобы убедиться, что остатки отбеливателя удалены.
  9. С помощью инструмента для наращивания ресниц перенесите эмбрион из бумажного полотенца в чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм (см. Таблицу материалов). Добавьте деионизированную воду в чашку, чтобы полностью покрыть эмбрионы. Точно отрегулируйте положение и ориентацию эмбрионов с помощью инструмента для наращивания ресниц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После дехорионирования эмбрион имеет тенденцию прилипать к поверхности стекла и неподвижен без возмущений, поэтому нет необходимости применять дополнительную обработку (например, клей), чтобы обездвижить эмбрион на чашке со стеклянным дном.
  10. Поместите чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм с эмбрионами внутрь светонепроницаемого черного ящика (см. Таблицу материалов), чтобы защитить образец от воздействия света во время процесса переноса. Принесите коробку в комнату с многофотонным микроскопом.

3. Оптогенетическая стимуляция, лазерная абляция и визуализация эмбриона

ПРИМЕЧАНИЕ: Многофотонная система, используемая в этом эксперименте (см. таблицу материалов), способна к одновременной двухволновой визуализации. Он также содержит блок фотостимуляции с лазером 458 нм и отдельный гальванометрический сканер, позволяющий осуществлять фотоактивацию/стимуляцию в определенной области интереса (ROI). Следует отметить, что лазер с длиной волны 920 нм, который используется для возбуждения зелено-желтых флуоресцентных белков, будет стимулировать Opto-Rho1DN, хотя и медленнее по сравнению с синей лазерно-опосредованной стимуляцией.

  1. Накройте многофотонный микроскоп светонепроницаемой черной тканью (см. Таблицу материалов), чтобы избежать нежелательной стимуляции эмбрионов во время подготовки образца и визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тот же подход используется при обычной многофотонной визуализации для защиты светочувствительных детекторов, установленных на микроскопе.
  2. Выключите свет в комнате и экраны компьютеров. Выключите контроллер сенсорной панели, нажав OFF в разделе «Подсветка контроллера сенсорной панели» в программном обеспечении. Убедитесь, что в комнате нет другого окружающего света.
    1. Откройте лицевую сторону черной матерчатой крышки микроскопа. Возьмите 35-миллиметровую чашку со стеклянным дном из черного ящика и поместите ее на столик микроскопа.
  3. Осветите эмбрионы зеленым светом, который обычно используется в качестве возбуждающего света для эпифлуоресценции. Для этого включите блок флуоресцентного освещения, выберите Ocular под панелью «Ocular» в программном обеспечении и измените «Cube turret» на 4:TRITC. Используйте окуляр, чтобы определить интересующий эмбрион и сфокусировать его.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация зеленого света достигается за счет пропускания белого света, генерируемого блоком флуоресцентного освещения, через встроенный стандартный куб фильтра TRITC, который содержит фильтр возбуждения 528-553 нм, светоделитель 565 нм и фильтр излучения 590-650 нм. Другие несиние индикаторы также должны отлично работать для освещения образца. На этом этапе нет необходимости надевать защитные очки, так как возбуждающий свет имеет низкую интенсивность и не будет направлен на окуляр. Эмбрион будет выглядеть равномерно красным из-за аутофлуоресценции.
  4. Закройте черную тканевую крышку так, чтобы образец был полностью защищен от света. Включите экран компьютера, чтобы получить доступ к программному обеспечению, управляющему микроскопом. Измените 'Ocular' на LSM в программном обеспечении для получения изображения.
  5. Выполняйте лазерную абляцию в контрольных нестимулированных эмбрионах с помощью объектива для погружения в воду с 25-кратным увеличением.
    1. Нажмите Bright Z, Sequence Manager и LSM Stimulation в «Окне инструментов» в программном обеспечении. Установите тип сканера Galvano, а размер сканирования — 512 × 512. Включите CH1 и CH3 на панели «Настройка ФЭУ», чтобы разрешить использование лазера с длиной волны 1040 нм, и нажмите Live × 4, чтобы визуализировать эмбрион.
    2. Поверните эмбрион с помощью функции вращения в программном обеспечении так, чтобы передняя задняя ось эмбриона была вертикально ориентирована. Установите масштаб на 3. Нарисуйте область интереса (ROI) с помощью инструмента «Фигура» в разделе «Настройки сканирования» и установите размер ROI на панели «Ссылка». Установите ROI равным 512 пикселям в ширину и 100 пикселям в высоту (171 × 33мкм 2).
    3. Задайте параметры сбора данных для Z-стека предварительной абляции.
      1. Зарегистрируйте поверхность эмбриона как 0 в разделе «Z». Установите начало на 0 и конец на 100 мкм. Установите размер шага 2 мкм. Активируйте режим съемки Z, установив флажок Z на вкладке «Серия».
      2. Установите интенсивность лазера 1 040 нм, чтобы линейно увеличиваться от 3% до 7% с помощью функции Bright Z .
      3. Сохраните текущую настройку образа в качестве первой задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Z-стек перед абляцией получен для подтверждения стадии эмбриона. В этом эксперименте CRY2-Rho1DN-mCherry и Sqh-mCherry будут возбуждаться лазером с длиной волны 1040 нм. Во время апикальной констрикции сигнал Sqh-mCherry усиливается в медиоапикальной области вентральных мезодермальных клеток, тогда как CRY2-Rho1DN-mCherry является цитозольным до стимуляции. Интенсивность лазера, используемая для визуализации до и после стимуляции, определяется эмпирически на основе баланса между оптимальным соотношением сигнал/шум и предотвращением фотообесцвечивания.
    4. Задайте параметры съемки для видеоролика перед абляцией.
      1. Удалите все существующие ROI, чтобы получить изображение всей области 512 × 512 пикселей (171 × 171мкм2, 3-кратный зум) вблизи вентральной поверхности эмбриона, как описано в шаге 3.5.2. Установите интенсивность лазера 1,040 нм на 3%.
      2. Установите флажок « Время » и снимите галочку с Z на панели «Серия». Оставьте «Интервал» в качестве FreeRun под панелью «Таймлапс». Установите цикл равным 10.
      3. Сохраните текущие настройки в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этой задачи является получение 10-кадрового фильма предварительной абляции в одной Z-плоскости с помощью лазера с длиной волны 1040 нм для получения изображения. Скорость получения изображения составляет примерно 1 с на кадр.
    5. Задайте параметры для лазерной абляции.
      1. Определите 3D-область непосредственно под вителлиновой мембраной на глубину ~20 мкм для лазерной абляции (рис. 1A). Установите начало Z-стека в плоскость, которая находится непосредственно под вителлиновой мембраной, а конец — на 20 мкм глубже начальной плоскости. Установите размер шага 1,5 мкм.
        ПРИМЕЧАНИЕ: ROI абляционной области составляет ~30 пикселей в ширину и ~10 пикселей в высоту (~10 мкм по медиально-латеральной оси и ~3,3 мкм по оси A-P). Целью абляции образца в нескольких Z-плоскостях является обеспечение абляции апикальной поверхности вентральных клеток. Это особенно важно для стимулированных эмбрионов, так как вентральные клетки испытывают быстрое апикальное расслабление после ингибирования Rho1.
      2. Включите CH2 и CH4 на панели «Настройка ФЭУ», чтобы разрешить использование лазера с длиной волны 920 нм. Установите интенсивность лазера с длиной волны 920 нм на 30%. Настройте получение изображения с помощью лазера с длиной волны 920 нм для одного Z-стека в пределах 3D-области, определенной в шаге 3.5.5.1 для лазерной абляции.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность лазера, выбранная на этом этапе, достаточна для абляции ткани (на что указывает отдача тканей сразу после лазерной обработки), но в то же время не повреждает плазматическую мембрану (на что указывает отсутствие следов ожога на клеточной мембране) (Рисунок 1B, C).
      3. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
    6. Задайте параметры захвата для видеоролика после абляции.
      1. Настройте получение изображения для 100-кадрового видеоролика после абляции в одной Z-плоскости с использованием лазеров с длиной волны 1 040 нм и 920 нм. Установите интенсивность лазера с длиной волны 1040 нм и лазера с длиной волны 920 нм на 3% и 0,3% соответственно. Область, указанная в шаге 3.5.4, будет получена с одинаковой скоростью получения изображения.
      2. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
        ПРИМЕЧАНИЕ: Цель сохранения параметров, описанных в шагах 3.5.3-3.5.6, в виде последовательных задач в «Диспетчере последовательностей» перед любым фактическим получением, состоит в том, чтобы обеспечить захват немедленной реакции тканей после лазерной абляции.
    7. Выберите «Последовательность» в разделе «Получить». При необходимости измените путь сохранения данных и имя файла. Нажмите кнопку Готово и подождите, пока программное обеспечение инициализирует конвейер. Затем нажмите кнопку Пуск, чтобы запустить конвейер.
  6. Проводят лазерную абляцию у стимулированных эмбрионов.
    1. Задайте параметры сбора данных для Z-стека предварительной абляции, как описано в шагах 3.5.1-3.5.3. Сохраните текущую настройку в качестве первой задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
    2. Задайте параметры оптогенетической стимуляции в пределах заданной окупаемости инвестиций.
      1. Измените масштаб на 1 и выберите ROI, который охватывает вентральную поверхность эмбриона (~512 × 300мкм2). Выключите датчики CH1-CH4 .
      2. Нажмите LSM Стимуляция. Снимите флажок Непрерывный в пределах длительности и введите 12 с. Проверьте 458 нм с интенсивностью лазера 0,3%.
      3. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, нажав кнопку Стимуляция в «Диспетчере последовательностей».
        ПРИМЕЧАНИЕ: Более быстрая стимуляция может быть достигнута за счет увеличения интенсивности лазера 458 нм. Однако при использовании более высокой интенсивности лазера рассеянный лазерный свет может стимулировать область, прилегающую к ROI, что не идеально, если требуется пространственно ограниченная стимуляция.
    3. Установите 3-минутное время ожидания после стимуляции, чтобы обеспечить полную инактивацию миозина и демонтаж апикального F-актина, а также достичь статической морфологии тканей перед лазерной абляцией. Это достигается нажатием кнопки «Ожидание/пауза » в разделе «Диспетчер последовательностей» и установкой желаемого времени для «Ожидания».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекрутирование CRY2-Rho1DN-mCherry к мембране, вызванное одним раундом стимуляции (лазер 0,3% 458 нм в течение 12 с), четко обнаруживается через 10-15 минут после стимуляции. Это согласуется с опубликованным периодом диссоциации ~9 мин47.
    4. Задайте параметры съемки для одного видеоролика предварительной абляции в Z-плоскости, как описано в шаге 3.5.4, за исключением того, что для получения изображения используются лазеры с длиной волны 1040 нм и 920 нм. Включите датчики CH1-CH4 . Установите интенсивность лазера с длиной волны 1040 нм и лазера с длиной волны 920 нм на 3% и 0,3% соответственно. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
    5. Задайте параметры лазерной абляции, как описано в шаге 3.5.5. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
    6. Задайте параметры съемки для одного видеоролика после абляции в Z-плоскости, как описано в шаге 3.5.6. Сохраните текущую настройку в качестве следующей задачи конвейера, щелкнув LSM в "Диспетчере последовательностей".
    7. Выберите «Последовательность» в разделе «Получить». При необходимости измените путь сохранения данных и имя файла. Нажмите кнопку Готово и подождите, пока программное обеспечение инициализирует конвейер. Затем нажмите кнопку Пуск, чтобы запустить конвейер.

4. Количественная оценка скорости отдачи тканей после лазерной абляции

  1. Откройте видеоролик после абляции в ImageJ.
  2. Нарисуйте небольшой ROI вдоль вентральной срединной линии, которая покрывает абляционную область, с помощью инструмента «Прямоугольное выделение ». Ширина ROI составляет девять пикселей. Высота ROI устанавливается таким образом, чтобы ROI была достаточно большой, чтобы покрыть весь диапазон отдачи тканей после лазерной абляции.
    1. Нажмите «Дублировать» на вкладке «Изображение». Во всплывающем окне установите флажок Дублировать стек и нажмите кнопку ОК, чтобы продублировать стек в пределах выбранной рентабельности инвестиций.
  3. Создайте монтаж из дублированного стека с помощью Image > Stacks > Make Montage. Во всплывающем окне задайте номер строки равным 1 , а номер столбца — общему количеству кадров в стеке (в данном случае 100 ).
  4. Измерьте ширину A-P удаленной области с течением времени по сгенерированному монтажу.
    1. Используйте инструмент « Несколько точек » в ImageJ, чтобы обозначить границы A-P удаленной области для каждой временной точки на монтаже.
    2. Сохраните координаты отмеченных точек с помощью команды Файл > Сохранить как > координаты XY.
    3. Импортируйте измеренные координаты XY в MATLAB. Вычислите ширину A-P абляционной области для каждого момента времени, вычитая координату Y верхней границы из координаты Y нижней границы.
  5. Определите скорость отдачи тканей, подогнав первые 20 секунд кривой «ширина во времени» в линию с помощью функции «полифит» в MATLAB. Укажите наклон подогнанной линии как скорость отдачи ткани.
  6. Выполнение статистических тестов для сравнения скорости тканевой отдачи между стимулированными и нестимулированными образцами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется получить данные не менее чем от пяти эмбрионов для каждого заболевания. Для статистического сравнения можно использовать как двусторонний критерий ранговой суммы Вилкоксона, так и двусторонний t-критерий Стьюдента.

Результаты

У нестимулированных эмбрионов, подвергшихся апикальной констрикции, Sqh-mCherry обогащался в медиоапикальной области вентральных мезодермальных клеток, тогда как CRY2-Rho1DN-mCherry был цитозольным (рис. 1A). Лазерная абляция в пределах констрикционного домена приводила к быстрому ?...

Обсуждение

Этот протокол описывал комбинированное использование оптогенетики и лазерной абляции для зондирования изменений натяжения тканей сразу после инактивации сократимости актомиозина. Оптогенетический инструмент, описанный здесь, использует преимущества доминантной негативной формы R...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Энн Лавануэй (Ann Lavanway) за помощь в создании изображений. Авторы благодарят лабораторию Вишауса и лабораторию Де Ренциса за обмен реагентами, а также Блумингтонский центр разведения дрозофил за запасы мух. Это исследование поддержано NIGMS ESI-MIRA R35GM128745 и грантом Американского онкологического общества на институциональные исследования #IRG-82-003-33 для BH.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm glass-bottom dishMatTekP35G-1.5-10-CUsed for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lidFalcon351007Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscopeOnlineNAUsed to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)VWR10028-048Used for embryo dechorination
CO2 padGenesee Scientific59-114Used for cross set-up
ddH2ONANAUsed for sample preparation
Dumont Style 5 tweezersVWR102091-654Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)VWR22940-834Used for sample preparation
FluoView (Software)OlympusNAUsed for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27Sigma AldrichH8773-100MLUsed for embryo stage visualization
ImageJ/FIJINIHNAUsed for image analysis
MATLABMathWorksNAUsed for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscopeNikonNAUsed for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.OlympusNAUsed for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)VWR30621-392Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)BoliopticsFM14036151Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED LightsAmazonNAUsed to avoid unwanted light stimulation

Ссылки

  1. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  2. Munjal, A., Lecuit, T. Actomyosin networks and tissue morphogenesis. Development. 141 (9), 1789-1793 (2014).
  3. Sawyer, J. M., et al. Apical constriction: a cell shape change that can drive morphogenesis. Developmental Biology. 341 (1), 5-19 (2010).
  4. Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
  5. Marinari, E., et al. Live-cell delamination counterbalances epithelial growth to limit tissue overcrowding. Nature. 484 (7395), 542-545 (2012).
  6. Slattum, G. M., Rosenblatt, J. Tumour cell invasion: an emerging role for basal epithelial cell extrusion. Nature Reviews. Cancer. 14 (7), 495-501 (2014).
  7. Antunes, M., Pereira, T., Cordeiro, J. V., Almeida, L., Jacinto, A. Coordinated waves of actomyosin flow and apical cell constriction immediately after wounding. The Journal of Cell Biology. 202 (2), 365-379 (2013).
  8. Yang, S., et al. The central role of the tail in switching off 10S myosin II activity. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1081-1093 (2019).
  9. Yang, S., et al. Cryo-EM structure of the inhibited (10S) form of myosin II. Nature. 588 (7838), 521-525 (2020).
  10. Narumiya, S., Thumkeo, D. Rho signaling research: history, current status and future directions. FEBS Letters. 592 (11), 1763-1776 (2018).
  11. Johndrow, J. E., Magie, C. R., Parkhurst, S. M. Rho GTPase function in flies: insights from a developmental and organismal perspective. Biochemistry and Cell Biology. 82 (6), 643-657 (2004).
  12. Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420 (6916), 629-635 (2002).
  13. Hodge, R. G., Ridley, A. J. Regulating Rho GTPases and their regulators. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (8), 496-510 (2016).
  14. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  15. Amano, M., Nakayama, M., Kaibuchi, K. Rho-kinase/ROCK: A key regulator of the cytoskeleton and cell polarity. Cytoskeleton. 67 (9), 545-554 (2010).
  16. Kimura, K., et al. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science. 273 (5272), 245-248 (1996).
  17. Maekawa, M., et al. Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase. Science. 285 (5429), 895-898 (1999).
  18. Ohashi, K., et al. Rho-associated kinase ROCK activates LIM-kinase 1 by phosphorylation at threonine 508 within the activation loop. The Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3577-3582 (2000).
  19. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical sarcomere-like actomyosin contracts nonmuscle drosophila epithelial cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  20. Homem, C. C. F., Peifer, M. Diaphanous regulates myosin and adherens junctions to control cell contractility and protrusive behavior during morphogenesis. Development. 135 (6), 1005-1018 (2008).
  21. Goode, B. L., Eck, M. J. Mechanism and function of formins in the control of actin assembly. Annual Review of Biochemistry. 76, 593-627 (2007).
  22. Sweeton, D., Parks, S., Costa, M., Wieschaus, E. Gastrulation in Drosophila: the formation of the ventral furrow and posterior midgut invaginations. Development. 112 (3), 775-789 (1991).
  23. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  24. Leptin, M. Gastrulation in Drosophila: the logic and the cellular mechanisms. The EMBO Journal. 18 (12), 3187-3192 (1999).
  25. Martin, A. C. The physical mechanisms of Drosophila gastrulation: mesoderm and endoderm invagination. Genetics. 214 (3), 543-560 (2020).
  26. Gilmour, D., Rembold, M., Leptin, M. From morphogen to morphogenesis and back. Nature. 541 (7637), 311-320 (2017).
  27. Gheisari, E., Aakhte, M., Müller, H. -. A. J. Gastrulation in Drosophila melanogaster: Genetic control, cellular basis and biomechanics. Mechanisms of Development. 163, 103629 (2020).
  28. Leptin, M. Twist and snail as positive and negative regulators during Drosophila mesoderm development. Genes & Development. 5 (9), 1568-1576 (1991).
  29. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  30. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  31. Kölsch, V., Seher, T., Fernandez-Ballester, G. J., Serrano, L., Leptin, M. Control of Drosophila gastrulation by apical localization of adherens junctions and RhoGEF2. Science. 315 (5810), 384-386 (2007).
  32. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), (2013).
  33. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  34. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  35. Dawes-Hoang, R. E., et al. Folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  36. Häcker, U., Perrimon, N. DRhoGEF2 encodes a member of the Dbl family of oncogenes and controls cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Genes & Development. 12 (2), 274-284 (1998).
  37. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
  38. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  39. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  40. Martin, A. C., Gelbart, M., Fernandez-Gonzalez, R., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Integration of contractile forces during tissue invagination. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 735-749 (2010).
  41. Guo, H., Swan, M., He, B. Optogenetic inhibition of actomyosin reveals mechanical bistability of the mesoderm epithelium during Drosophila mesoderm invagination. eLife. 11, e69082 (2022).
  42. Sebti, S. M., Der, C. J. Searching for the elusive targets of farnesyltransferase inhibitors. Nature Reviews. Cancer. 3 (12), 945-951 (2003).
  43. Roberts, P. J., et al. Rho family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification. The Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25150-25163 (2008).
  44. Feig, L. A., Cooper, G. M. Inhibition of NIH 3T3 cell proliferation by a mutant ras protein with preferential affinity for GDP. Molecular and Cellular Biology. 8 (8), 3235-3243 (1988).
  45. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 interacts with CIB1 to regulate transcription and floral initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  46. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nature Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  47. Guglielmi, G., Barry, J. D., Huber, W., De Renzis, S. An optogenetic method to modulate cell contractility during tissue morphogenesis. Developmental Cell. 35 (5), 646-660 (2015).
  48. Izquierdo, E., Quinkler, T., De Renzis, S. Guided morphogenesis through optogenetic activation of Rho signalling during early Drosophila embryogenesis. Nature Communications. 9 (1), 2366 (2018).
  49. Hutson, M. S., et al. Forces for morphogenesis investigated with laser microsurgery and quantitative modeling. Science. 300 (5616), 145-149 (2003).
  50. Rauzi, M., Lenne, P. -. F. Probing cell mechanics with subcellular laser dissection of actomyosin networks in the early developing Drosophila embryo. Methods in Molecular Biology. 1189, 209-218 (2015).
  51. Rauzi, M., Verant, P., Lecuit, T., Lenne, P. -. F. Nature and anisotropy of cortical forces orienting Drosophila tissue morphogenesis. Nature Cell Biology. 10 (12), 1401-1410 (2008).
  52. Hunter, C., Wieschaus, E. Regulated expression of nullo is required for the formation of distinct apical and basal adherens junctions in the Drosophila blastoderm. The Journal of Cell Biology. 150 (2), 391-401 (2000).
  53. Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. Journal of Cell Science. 114, 493-501 (2001).
  54. Munjal, A., Philippe, J. -. M., Munro, E., Lecuit, T. A self-organized biomechanical network drives shape changes during tissue morphogenesis. Nature. 524 (7565), 351-355 (2015).
  55. Rørth, P. Gal4 in the Drosophila female germline. Mechanisms of Development. 78 (1-2), 113-118 (1998).
  56. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  57. Magie, C. R., Meyer, M. R., Gorsuch, M. S., Parkhurst, S. M. Mutations in the Rho1 small GTPase disrupt morphogenesis and segmentation during early Drosophila development. Development. 126 (23), 5353-5364 (1999).
  58. Rich, A., Fehon, R. G., Glotzer, M. Rho1 activation recapitulates early gastrulation events in the ventral, but not dorsal, epithelium of Drosophila embryos. eLife. 9, e56893 (2020).
  59. Herrera-Perez, R. M., Cupo, C., Allan, C., Lin, A., Kasza, K. E. Using optogenetics to link myosin patterns to contractile cell behaviors during convergent extension. Biophysical Journal. 120 (19), 4214-4229 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

194Rho1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены