Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для достижения крупномасштабного производства адгезивных клеток с помощью полностью закрытой системы на основе растворимых микроносителей GMP-класса. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток человека, клеток HEK293T и клеток Vero было валидировано и соответствовало как количественным требованиям, так и критериям качества для индустрии клеточной и генной терапии.

Аннотация

Исследователи в области клеточной и генной терапии (ВКТ) уже давно сталкиваются с серьезной проблемой эффективного и крупномасштабного размножения клеток. Чтобы устранить основные недостатки двумерной (2D) планарной системы культивирования, мы разработали инновационную платформу автоматизированного закрытого промышленного производства клеток (ACISCP) на основе растворимого и пористого микроносителя GMP-класса для 3D-культивирования адгезивных клеток, включая мезенхимальные стволовые/стромальные клетки человека (hMSCs), HEK293T клетки и клетки Vero. Для достижения крупномасштабного расширения было проведено двухступенчатое расширение с помощью биореакторов с перемешиванием объемом 5 л и 15 л с получением 1,1 x10 10 гМСК с общим расширением в 128 раз в течение 9 дней. Клетки собирали путем полного растворения микроносителей, концентрировали, промывали и формулировали с помощью системы обработки клеток на основе центрифуги непрерывного действия, а затем аликвотировали с помощью системы заполнения клеток. По сравнению с 2D планарной культурой нет существенных различий в качестве МСК, собранных из 3D-культуры. Мы также применили эти растворимые пористые микроносители к другим популярным типам клеток в секторе CGT; В частности, HEK293T клетки и клетки Vero культивировались до пиковой плотности клеток 1,68 x 10 7 клеток/мл и 1,08 x 107 клеток/мл соответственно. В этом исследовании представлен протокол использования платформы биотехнологической инженерии, использующей характеристики растворимых микроносителей класса GMP и передового закрытого оборудования для производства адгезивных клеток в промышленных масштабах.

Введение

За последние два десятилетия индустрия CGT стала свидетелем экспоненциального роста. Ожидается, что эволюция лекарственных средств нового поколения позволит лечить и излечивать многочисленные рефрактерные заболевания1. С момента первого одобрения Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) продукта CGT Kymriah в 2017 году исследования и разработки, связанные с CGT, в мире продолжали расти быстрыми темпами, при этом FDA отмечает, что количество активных заявок на новые экспериментальные препараты для CGT увеличилось до 500 в 2018году. Прогнозировалось, что к 2030 году количество ....

протокол

Человеческая пуповина была получена из пекинской больницы Цинхуа Чангэн. Все процедуры и протоколы, касающиеся получения, выделения и культивирования мезенхимальных стволовых клеток пуповины человека (ВЦМСК), проводились с информированного согласия и с одобрения Комитета по этике Пекинской больницы Цинхуа Чангэн (регистрационный номер 22035-4-02), а процедуры и протоколы соответствовали Хельсинкской декларации 1964 года и ее более поздним поправкам или сопоставимым этическим стандартам.

1. Монослойная культура мМСК, HEK293T-клеток и клеток Vero

  1. Выделяют первичные УКМСК человека из желе Уортона в соответствии с опи....

Результаты

Платформа ACISCP представляет собой полностью закрытую систему, в которой используется ряд биореакторов с перемешиванием для расширения масштабирования, система обработки клеток для автоматизированного сбора и составления клеточных формулировок, а также система наполнения клеток (

Обсуждение

Как иммунотерапия, так и терапия стволовыми клетками используют живые клетки в качестве лекарств; Однако их конечные продукты не должны очищаться или стерилизоваться так же, как малые молекулы или вирусы. Таким образом, принцип качества по проектированию (QbD) всегда должен иметь в виду ?.......

Раскрытие информации

Y.D. является научным консультантом, а H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. и X.Y. являются сотрудниками Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. Другие авторы не имеют коммерческого, имущественного или финансового интереса к продуктам или компаниям, описанным в этой статье. Все остальные авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Национального научного фонда выдающихся молодых ученых (82125018).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin EDTABasalMediaS310JVUsed for 2D cell harvest.
3D FloTrix DigestCytoNiche BiotechR001-500This is a reagent that specifically dissolves 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix MSC Serum Free MediumCytoNiche BiotechRMZ112This is a serum-free,animal-free medium for mesenchymal stem cell expansion and maintenance in 2D planar culture as well as 3D culture on 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration ModuleCytoNiche BiotechR020-00-10This module contains 0.22 μm capsule filters used for filtration of culture medium and digest solution.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)CytoNiche BiotechR020-00-03Used as feed bag for 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)CytoNiche BiotechR020-00-01Used as cell seeding or transfer bags.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)CytoNiche BiotechR020-00-04Used as feed bag for 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable KitCytoNiche BiotechPACK-01-01This is a standard kit adapted to 3D vivaPACK fill and finish system.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cellsCytoNiche BiotechvivaPACKThis system is a closed liquid handling device, with automated mixing and gas exhausting functions. Cells resuspended in cryopreservation buffer can be rapidly and evenly aliquoted into 20 bags per batch.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing systemCytoNiche BiotechvivaPREP PLUSThis system is a continuous flow centrifuge-based device.Cells can be concentrated, washed, and resuspended under completely closed procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing KitCytoNiche BiotechPREP-PLUS-00This is a standard kit adapted to 3D vivaPREP PLUS cell processing.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 LCytoNiche BiotechFTVS15This bioreactor product employs a controller, a 15 L glass stirred-tank vessel, and assessories. A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 LCytoNiche BiotechFTVS05This bioreactor product employs a controller, a 5 L glass stirred-tank vessel, and assessories.A special perfusion tube is available.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)CytoNiche BiotechR020-10-10This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, containing sampling bags.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)CytoNiche BiotechR020-05-10This is a standard tubing kit adapted to 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, containing sampling bags.
3D TableTrix microcarriers G02CytoNiche BiotechG02-10-10gThese porous and degradable microcarriers are suitable for HEK293T cell culture. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01CytoNiche BiotechV01-100-10gThese porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, they come as non-sterilized microcarriers that need to be autoclaved in PBS before use. They are especially suitable for vaccine production.
3D TableTrix microcarriers W01CytoNiche BiotechW01-10-10g (single-use packaging);
W01-200 (tablets)
These porous and degradable microcarriers are suitable for adherent cell culture, especially for cells that need to be harvested as end products. They come pre-sterilized in 10g/bottle with C-Flex tubings for welding to tubes on bioreactors.The product has obtained 2 qualifications for pharmaceutical excipients from CDE, with the registration numbers of [F20200000496; F20210000003]. It has also received DMF qualification for pharmaceutical excipients from FDA, with the registration number of [DMF:35481]
APC anti-human CD45 AntibodyBioLegend368512Used in flow cytometry for MSC identity assessment
Calcein-AM/PI Double Staining KitDojindoC542Calcein-AM/PI Double Staining Kit is utilized for simultaneous fluorescence staining of viable and dead cells. This kit contains Calcein-AM and Propidium Iodide (PI) solutions, which stain viable and dead cells, respectively.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)Saint-GobainCAP-38Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)Saint-Gobain374-250-3Used for tube welding and disconnection.
CryoMACS Freezing Bag 50Miltenyi Biotec 200-074-400Used for expanding the 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO) SigmaD2650-100mLUsed for preparation of cryopreservation solution.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)BasalMediaL120KJUsed for cultivation of HEK293T and Vero cells.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L)DWK life sciences218016357Used for waste collection from the 5 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (5 L)DWK life sciences218017353Used for waste collection from the 15 L bioreactor.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (500 mL)DWK life sciences218014459Used for supplementary bottle of 0.1 M NaOH.
EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)Saint-GobainEZ500 ML-38-2Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Fetal bovine serum (FBS) superior qualityWisent086-150Used for cultivation of HEK293T cells.
FITC anti-human CD14 AntibodyBioLegend301804Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD34 AntibodyBioLegend343504Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
FITC anti-human CD90 (Thy1) AntibodyBioLegend328108Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Flow cytometryBeckman CoulterCytoFLEXUsed for cell identity assessment.
Fluorescence Cell AnalyzerAlit life scienceCountstar Rigel S2Used for cell counting. Cell viability can be calculated by staining with AO/PI dyes.
GL 45 Multiport Connector Screw Cap with 2 ports DWK life sciences292632806Brands and catalogue numbers are only for example, similar products are available from various suppliers and as long as they have the same functionality, items could be substituted with other brands.
Glucose MeterSinocare6243578Used for detecting glucose concentration in cell culture medium and supernatant.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), with calcium and magnesiumGibco14025092Used for preparation of digest solution.
Human Albumin 20% Behring (HSA)CSL BehringN/AUsed for preparation of wash buffer.
Inverted fluorescent microscopeOLYMBUSCKX53SFUsed for brifgt field and fluorescent observation and imaging.
Nalgene Measuring Cylinder (500 mL)Thermo Scientific3662-0500PKUsed for calibrating the liquid handling volume speed of peristaltic pumps.
Newborn calf serum (NBS) superfineMINHAI BIOSC101.02Used for cultivation of Vero cells.
OriCell human mesenchymal stem cell adipogenic differentiation and characterization kitCyagenHUXUC-90031Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and characterization kitCyagenHUXUC-90041Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
OriCell human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation and characterization kitCyagenHUXUC-90021Used for tri-lineage differentiation of hUCMSCs.
PE anti-human CD105 AntibodyBioLegend800504Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD19 AntibodyBioLegend302208Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) AntibodyBioLegend344004Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
PE anti-human HLA-DR AntibodyBioLegend307605Used in flow cytometry for MSC identity assessment.
Phosphate Buffered Saline (PBS)Wisent311-010-CLUsed in autoclaving of glass vessel and V01 microcarriers, and replacement of culture medium.
Sani-Tech Platinum Cured Sanitary Silicone Tubing (0.13 in x 0.25 in)Saint-GobainULTRA-C-125-2FUsed for solution transfering driven by peristaltic pumps.
Sterile SalineHopebiolHBPP008-500Used for preparation of wash buffer.
Trypzyme Recombinant TrypsinBasalMediaS342JVThis reagent is used for bead-to-bead transfer of HEK293T and Vero cells.
Tube SealerYingqi BiotechTube Sealer IThis sealer is compatible with both C-Flex tubing and PVC tubing.
Tube Welder for PVC tubingChu BiotechTube Welder Micro IUsed for welding of PVC tubing.
Tube Welder for TPE tubingYingqi BiotechTube Welder I-V2Used for welding of TPE tubing.
ViaStain AO / PI Viability StainsNexcelomCS2-0106-25mLDual-Fluorescence Viability, using acridine orange (AO) and propidium iodide (PI), is the recommended method for accurate viability analysis of primary cells, such as PBMCs, and stem cells in samples containing debris.

Ссылки

  1. Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
  2. Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

GMP3DHMSCHEK293TVeroACISCP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены