Использование эксплантов птичьей кожи для изучения структуры тканей и органогенеза

Резюме

Здесь мы описываем протоколы для трех типов культур эксплантации кожи эмбрионов птиц, которые могут быть использованы для изучения тканевых взаимодействий, 4D-визуализации таймлапс-пленки (3D плюс время), глобальных или локальных возмущений молекулярной функции и характеристик системной биологии.

Аннотация

Развивающаяся птичья кожа во время эмбриогенеза является уникальной моделью, которая может дать ценную информацию о структуре тканей. Здесь описаны три вариации культур эксплантов кожи для изучения различных аспектов развития кожи. Во-первых, культивирование органов ex vivo и манипуляции с ними дают исследователям возможность наблюдать и изучать развитие перьевых почек напрямую. Культура кожных эксплантов может расти в течение 7 дней, что позволяет проводить прямой анализ клеточного поведения и получать 4D-визуализацию с интервалами в течение этого периода роста. Это также позволяет проводить физические и молекулярные манипуляции с условиями культивирования для визуализации реакции тканей. Например, бусины, покрытые фактором роста, могут наноситься локально, чтобы вызвать изменения в рисунке перьев на ограниченной площади. В качестве альтернативы, вирусная трансдукция может быть доставлена глобально в питательных средах для повышения или понижения экспрессии генов. Во-вторых, протокол рекомбинации кожи позволяет исследователям исследовать тканевые взаимодействия между эпидермисом и мезенхимой, которые происходят из разных областей кожи, разных этапов жизни или разных видов. Это дает возможность проверить временное окно, в течение которого эпителий способен реагировать на сигналы, и его способность формировать различные придатки кожи в ответ на сигналы от различных мезенхимальных источников. В-третьих, восстановление кожи с использованием диссоциированных дермальных клеток, покрытых интактным эпителием, обнуляет развитие кожи и позволяет изучить начальные процессы периодического формирования паттернов. Этот подход также расширяет наши возможности по манипулированию экспрессией генов среди диссоциированных клеток перед созданием восстановленного кожного экспланта. В этой статье представлены три протокола культивирования и примеры экспериментов, демонстрирующие их полезность.

Введение

Развитие кожи птичьего эмбриона является отличной моделью для изучения механизмов морфогенеза из-за его особенностей и доступности к микрохирургии и манипуляциям ^1,2. Тем не менее, оценка клеточных и молекулярных событий в интактных тканях может быть затруднена, потому что присутствие посторонних тканей может усложнить микроскопические наблюдения. Кроме того, способность манипулировать экспрессией генов для проверки их роли в морфогенезе кожи не всегда является простой задачей. Мы обнаружили, что можем проверить функции генов с помощью ретровирусной трансдукции с более высоким уровнем успеха на моделях эксплантов кожи. В этой статье мы обсудим преимущества трех разработанных моделей эксплантов кожи.

Культура эмбриональной кожи птиц является мощной системой для оценки поведения клеток, регуляции генов и функций во время развития перьевых почек кожи 3,4,5,6. Это позволяет оценить молекулярные механизмы развития перьевых почек за счет глобального добавления факторов роста, помещенных в питательные среды, или их локального высвобождения из гранул, покрытых факторами роста. Регуляторные гены развития также могут быть манипулированы с помощью вирусной трансдукции интактных или доминантных негативных форм для функциональных исследований, оценивая их роль в конкретных морфогенетических событиях ^7,8.

Культура эпителиально-мезенхимальной рекомбинации птиц позволяет исследователям определить вклад каждого компонента кожи на ранних стадиях морфогенеза кожи. Использование Роулзом этого подхода показало, что взаимодействие между мезенхимой и эпителием имеет важное значение для формирования придатков кожи⁹. Мезенхима может образовывать конденсации, а эпителий необходим для индукции и поддержания образования мезенхимальной конденсации². Позже этот подход был использован для оценки того, почему бесчешуйчатые куры не могут формировать перья. Обнаружено, что дефект находится в мезенхиме¹⁰. Дуайи проводил исследования тканевой эпителиально-мезенхимальной рекомбинации у эмбрионов разных видов. Эти исследования позволили получить представление о развитии и эволюции эпителиально-мезенхимальных коммуникаций, которые способствуют морфогенезу кожи³.

Это исследование было использовано для лучшего понимания факторов, контролирующих рост перьев. Метод также улучшает визуализацию клеточных и молекулярных событий, участвующих в формировании кожного рисунка, которые происходят во время зарождения, развития и удлинения перьев вдоль передне-задней оси. Когда эпителий отделяется от мезенхимы и два компонента затем рекомбинируются, новые взаимодействия восстанавливают структуру кожи. Этот подход позволяет оценить мезенхимальные индуцирующие сигналы и молекулы эпителиальной компетентности, которые позволяют эпидермису реагировать на мезенхимальные сигналы¹¹. Последующая молекулярная экспрессия, необходимая для развития перьевых почек и формирования узоров, также может быть изучена. Эти исследования установили, что расположение бутонов контролируется мезенхимой. Вращение эпителия на 90^° до рекомбинации с мезенхимой показывает, что направление удлинения перьевого зачатка контролируется эпителием. Этот метод был необходим для изучения молекулярного механизма, регулирующего ориентацию перьевых почек¹².

Культура восстановления птичьей кожи, в которой мезенхима кожи перед нанесением диссоциирована на отдельные клетки при высокой плотности клеток и покрыта неповрежденным эпителием, сбрасывает клетки дермы в исходное состояние. Затем эксплант самоорганизуется, образуя новый периодический паттерн, независимый от предыдущих сигналов¹³. Эта модель восстановления кожи может быть использована для изучения начальных процессов периодического формирования перьев. Мы использовали этот подход для изучения того, как модуляция соотношения мезенхимальных клеток к одному кусочку эпителия может влиять на размер или количество перьевых почек. Было обнаружено, что количество почек увеличивается, но не размер почек, поскольку соотношение мезенхимальных клеток увеличивается. Еще одним преимуществом этого подхода является то, что вирусная трансдукция мезенхимальных клеток показывает более высокую эффективность, чем в двух других условиях культивирования, и может продуцировать более очевидные фенотипы.

протокол

1. Культура экспланта куриной кожи (рисунок 1)

1. Оплодотворенные куриные яйца инкубируют во влажном инкубаторе при температуре 38 °C и устанавливают их в соответствии с Hamburger и Hamilton¹⁴.
   1. На стадии 28 (~E5.5) второй палец и третий палец конечности длиннее остальных; Три пальца и четыре пальца на ногах различимы.
   2. На стадии 29 (~E6) крыло согнуто в локте; Вторая цифра заметно длиннее остальных.
   3. На стадии 30 (~E6.5) два ряда зачатков спинного пера по обе стороны от спинного мозга видны на уровне плечевой кости, а три ряда видны на уровне ног.
   4. На стадии 31 (~E7) имеется ~7 рядов перьев на юмбо-крестцовых уровнях.
   5. На стадии 32 на уровне ног присутствует одиннадцать и более рядов перьевых почек.
2. Поместите куриный эмбрион стадии 28-32 в чашку Петри диаметром 60 мм, содержащую буферизованный солевой раствор Хэнкса (HBSS) или фосфатно-солевой буфер (PBS).
   1. Рассеките спинную кожу эмбриона между нижней частью шеи и областью хвоста. С помощью ножниц снимите голову с шеи. Осторожно потяните за бутоны конечностей, расположив брюшную сторону тела вниз, а придатки распространить наружу.
   2. Сделайте передний и задний разрез на коже вдоль двух боковых сторон тела эмбриона с помощью часовых щипцов или острых пружинных ножниц. Обязательно нужно стабилизировать тело с помощью пары щипцов, прищипывая зачатки конечностей в продольном направлении. Аккуратно отшелушите кожу от шеи к области хвоста или от хвоста к шее с помощью часовых щипцов.
3. Аккуратно удалите подкожные ткани, которые остаются прикрепленными к отслоившейся коже, и разгладьте края кожи острыми пружинными ножницами.
4. Добавьте 2 мл/лунку модифицированной среды Eagle's Medium (DMEM) от Dulbecco, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и раствором пенициллина/стрептомицина (разбавленным 1:100) в лунку в 6-луночной чашке. После добавления среды и антибиотиков поместите внутрь лунки стерильный вкладыш для культуры тканей таким образом, чтобы среда находилась на внешней стороне вкладыша для культуры.
5. Перенесите кожу шпателем во вставку для культуры эпидермисом вверх и мезенхимой вниз на мембране вставки. Чтобы кожа лежала ровно без складок, натяните кожу на шпатель в HBSS. Снимите кожу со шпателя с жидкостью, чтобы облегчить перенос кожи без сворачивания.
6. Удалите избыток HBSS из вкладыша для культивирования с помощью пипетки объемом 200 мкл. Оставьте тонкий слой HBSS внутри питательной вставки, чтобы эксплант оставался полувлажным и обеспечивал воздушно-жидкостную границу соприкосновения.
7. Инкубируйте культуры эксплантации кожицы при 37 °C с использованием 5%_CO2 и 95% воздуха. Меняйте среду каждые 2 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данная процедура была опубликована⁴. Эту систему культивирования можно использовать и с кожей других птиц, таких как перепелиные или зябликовые культуры.

2. Эпителиально-мезенхимальная рекомбинация кожи курицы (Рисунок 2)

1. Оплодотворенные куриные яйца инкубируют во влажном инкубаторе при температуре 38 °C и помещают эмбрионы в соответствии с Hamburger и Hamilton¹⁴ (раздел 1.1).
2. Приготовьте 2x солевой раствор без кальция и магния (CMF) с 0,25% этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).
   1. Приготовьте 10x CMF буфер (NaCl (1,37 M) 80 г, KCl (0,04 M) 3 г,₂PO4 (0,004 M) 0,5 г, KH₂PO4 (2 M) 0,25 г, NaHCO₃ (0,12 M) 10 г, глюкозу (0,1 M) 20 г в 1 000 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте pH до 7,3. Чтобы получить 100 мл 2x CMF с 0,25% буфером EDTA, EDTA сначала следует растворить в 80 мл дистиллированной воды, затем добавить 20 мл 10x CMF буфера, чтобы получить 2x CMF с 0,25% рабочим раствором EDTA.
3. Препарируйте спинную кожу куриных эмбрионов стадии 30-32 в HBSS, как описано выше (раздел 1.2), и инкубируйте их в 2x CMF физиологическом растворе с 0,25% ЭДТА на льду в течение 15-20 минут.
4. Аккуратно отделите эпителий и мезенхиму с помощью часовых щипцов. Переложите отделенный эпителий и мезенхиму в чистую посуду, содержащую HBSS.
5. Повторно комбинируйте эпителий с мезенхимой, сначала поместив мезенхиму на чашку Петри, содержащую HBSS, затем поместите эпителий поверх мезенхимы. Поместите эпителий вдоль той же передне-задней оси, что и мезенхима, или поверните эпителий на 90^° от передне-задней оси мезенхимы, чтобы определить, какой компонент регулирует различные аспекты морфогенеза кожи.
6. Переложите рекомбинированную кожуру во вкладыши для культуры в 6-луночные чашки для выращивания и удалите избыток HBSS вокруг рекомбинированной кожи.
7. Поместите 2 мл питательной среды DMEM с 10% FBS в лунку снаружи вкладыша. Поместите тонкий слой DMEM внутрь камеры вставки, чтобы эксплант оставался полувлажным и обеспечивал воздушно-жидкостную границу.
8. Кожные рекомбинанты инкубируют при 37 °C в смеси 5%_CO2 и 95% воздуха. Меняйте среду каждые 2 дня. Документирование фенотипических изменений в начальных фазах развития кожи с помощью покадровой фотосъемки с помощью камеры, установленной на препарирующем микроскопе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данная процедура была опубликована¹¹.

3. Восстановление куриной кожи (Рисунок 3)

1. Оплодотворенные куриные яйца инкубируют во влажном инкубаторе при температуре 38 °C и помещают эмбрионы в соответствии с Hamburger и Hamilton¹⁴ (раздел 1.1).
2. Препарирование спинной кожи куриного эмбриона стадии 30-33 в HBSS. Инкубируйте шкуру в 2x CMF физиологическом растворе с 0,25% ЭДТА на льду в течение 15-20 минут, как описано выше (раздел 2.3).
3. Аккуратно отделите эпителий и мезенхиму с помощью часовых щипцов. Перенесите отделенный эпителий и мезенхиму в HBSS на лед.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить базальный слой эпителия при отделении эпителия от мезенхимы.
4. Отделенную мезенхиму соберите в центрифужную пробирку объемом 15 мл и инкубируйте с 0,1% раствором коллагеназы/трипсина, приготовленным в PBS, на водяной бане при температуре 37 °C в течение 10-15 минут.
5. Диссоциируйте мезенхиму кожи с помощью пипетки Пастера, чтобы получилась одноклеточная суспензия. Добавьте DMEM с 10% FBS, чтобы остановить пищеварение.
6. Гранулируйте и центрифугируйте ячейки при 233 × г в течение 5 минут. Ресуспендировали клетки питательной средой в концентрации от 2 ×^{10 до 7} клеток/мл.
   Примечание: На этом этапе мезенхимальные клетки также могут быть ресуспендированы в вируссодержащей среде на 2-3 ч на льду для трансдукции генов.
7. Поместите вкладыш для клеточной культуры в одну лунку 6-луночной чашки. Капните 10 мкл 2 × 10⁷ клеток/мл мезенхимальных клеток на вкладыш для культуры тканей. Поместите 2 мл питательной среды DMEM с 10% FBS в лунку снаружи вкладыша. Инкубируйте пластинчатые мезенхимальные клетки при 37 °C с использованием 5%_CO2 и 95% воздуха в течение 1 ч, чтобы клетки осядли на мембране вставки.
8. Перенесите интактный эпителий поверх покрытой мезенхимальной капли слоем базальных клеток эпителия, обращенным к мезенхимальным клеткам, с помощью пипетки объемом 1 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При переносе эпителия в мезенхимальную каплю мезенхимальные клетки не должны быть нарушены.
9. Расплющите неповрежденный эпителий над мезенхимой, чтобы восстановленная кожа эксплантировалась. Оставьте тонкий слой среды на вкладыше, чтобы восстановленный эксплант кожи оставался полувлажным и обеспечивал воздушно-жидкостную границу. Инкубируйте восстановленный эксплант кожи при 37 °C в воздушном инкубаторе с 5%_CO2 и 95% концентрацией. Меняйте среду каждые 2 дня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данная процедура была опубликована¹³.

Результаты

Культуры кожных эксплантов
Развитие перьевых почек из культур кожных органов ex vivo можно непосредственно наблюдать под микроскопом. Используя модель культуры экспланта кожи цыплят стадии 30 дорсальной кожи, плакоды видны вдоль средней линии. Затем морфогенетический фро...

Обсуждение

Рекомбинация тканей обеспечивает анализ для изучения уникального вклада эпителия и мезенхимы. У цыплят перья начинают развиваться на эмбриональный день 7 (Е7), в то время как чешуя начинается на Е9. Когда чешуйчатая мезенхима Е9 рекомбинируется с перьевым эпителием Е7, рекомбинированная ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well culture dish	Falcon	REF 353502	Air-Liquid Interface (ALI) Cultures
Cell culture inset	Falcon	REF 353090.	0.4 µm Transparent PET Membrane
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical	LS004196
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	Corning	10-013-CV	4.5 g/L glucose
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Fetal bovine serum	ThermoFisher	16140-071
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Hanks’s buffered saline solution	Gibco	14170-112	No calcium, no magnesium
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122
Pogassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5379
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014
Sodium chloride (Nacl)	EMD	CAS 7647-14-5
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S0751
Trypsin	Gibco	27250-042