Отслеживание липидов de novo с помощью мечения стабильными изотопами LC-TIMS-TOF MS/MS

Резюме

Здесь представлен метод скрининга липидных структур с помощью мечения стабильными изотопами с использованием времени их удержания, подвижности и фрагментации.

Аннотация

Липиды очень разнообразны, и небольшие изменения в структуре и составе липидов могут оказывать глубокое влияние на важнейшие биологические функции. Мечение стабильными изотопами (SIL) дает ряд преимуществ для изучения распределения, мобилизации и метаболизма липидов, а также синтеза липидов de novo . Для успешной реализации методики SIL необходимо устранить интерференции от эндогенных молекул. В настоящей работе мы описываем высокопроизводительный аналитический протокол для скрининга липидов SIL из биологических образцов; Будут показаны примеры идентификации липидов de novo во время развития яичников комаров. Использование комплементарной жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и масс-спектрометрии позволяет отделить и распределить липиды из одного образца за одно сканирование (<1 ч). Описанный подход использует преимущества последних разработок в области сбора, зависящего от данных, и сбора, независимого от данных, с использованием параллельного накопления в ловушке мобильности с последующей последовательной фрагментацией и диссоциацией, вызванной столкновением. Измерение SIL на уровне цепи жирных кислот выявляет изменения в динамике липидов во время развития яичников комаров. Структуры липидов de novo надежно присваиваются на основе времени их удержания, подвижности и характера фрагментации.

Введение

При анализе липидных данных мечение стабильными изотопами (SIL) является эффективным методом оценки метаболических путей в живых организмах. В этом методе атомы внутри анализируемого вещества заменяются стабильными изотопами, содержащими ¹³C или ^2H. Эти изотопы в дальнейшем включаются в предшественники, которые позже встраиваются в жирные кислоты, обозначая области, в которых они находятся. С помощью этих изотопов можно идентифицировать распределение и метаболизм липидов, так как они будут контрастировать на немаркированном фоне¹. Обычные масс-спектрометрические платформы не способны различать сигнал, поступающий от эндоге....

протокол

1. Подготовка образцов

1. Вскрытие насекомых
   1. Препарируйте яичники комаров Aedes aegypti в возрасте 7 дней в буферизованном фосфатом солевом растворе с помощью микроигл.
   2. Соберите восемь яичников из фосфатно-солевого буферного раствора с помощью микроигл и храните в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл при температуре -80 °C.
   3. Собирают яичники в биологические реплицы.
2. Экстракция липидов
   1. Добавьте 10 мкл внутреннего стандарта (ISTD) в восемь собранных яичников в концентрации 1 ppm. ISTD представляет собой меченую липидную смесь с семью дейтериями 1-пентадеканоил-2-олеоил-sn-гли....

Результаты

Мечение стабильных изотопов облегчает визуализацию триглицеридов в исследованиях динамики липидов самок яичников комаров. В области 2D-подвижности триглицерид 48:1 отображается в области с определенным временем удержания по отношению к подвижности 1/K₀. Интенсивность триглицерид?.......

Обсуждение

При оценке использования этого протокола важно убедиться, что параметры DIA-PASEF и MS/MS применимы к рассматриваемым триглицеридам. В частности, окна мобильности и ширина окон должны соответствовать схеме триглицеридов. Это можно определить с помощью предыдущего прогона с помощью метода DDA.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accucore C30 colum	Thermo Fisher Scientific	27826-252130
Bruker Compass Data Analysis	Bruker Daltonics Inc	2363525870	Version 5.2
d-Glucose-13C6	Sigma-Aldrich	389374
eppendorf tubes	Fisher Scientific	14-282-300
EquiSplash Lipidomix	Avanti Polar Lipids	330731-1EA
glass vials	Thermo Fisher Scientific	11-417-236
heavy water (2H2O)	Sigma-Aldrich	1.13366
polypropylene pestles	Fisher Scientific	BAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu	L20234651907
silanized glass inserts	Thermo Fisher Scientific	03-251-826
Sucrose-13C12	Sigma-Aldrich	605417
timsTOF	Bruker Daltonics Inc	1.84443E+11
Tuning Mix Calibration Standard	Agilent Technologies	36