Генерация индуцированных плюрипотентных iTenoцитов, полученных из стволовых клеток, с помощью комбинированной гиперэкспрессии Склеракса и 2D одноосного натяжения

Резюме

В данной статье описана процедура получения iTenoцитов путем генерации мезенхимальных стромальных клеток, полученных из iPSC, с комбинированной гиперэкспрессией Scleraxis с использованием лентивирусного вектора и одноосным растяжением через 2D-биореактор.

Аннотация

Сегодняшние проблемы в восстановлении сухожилий и связок требуют определения подходящего и эффективного кандидата для клеточной терапии для стимуляции регенерации сухожилий. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) были изучены как потенциальная стратегия тканевой инженерии для восстановления сухожилий. Несмотря на то, что они мультипотентны и обладают регенеративным потенциалом in vivo, они ограничены в своей способности к самообновлению и демонстрируют фенотипическую гетерогенность. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут обойти эти ограничения благодаря своей высокой способности к самообновлению и беспрецедентной пластичности развития. В развитии теноцитов склераксис (Scx) является важнейшим прямым молекулярным регулятором дифференцировки сухожилий. Кроме того, было показано, что механорегуляция является центральным элементом, управляющим развитием и заживлением эмбриональных сухожилий. Таким образом, мы разработали протокол для инкапсуляции синергетического эффекта биологической и механической стимуляции, который может быть важен для генерации теноцитов. ИПСК индуцировали превращение в мезенхимальные стромальные клетки (МСК) и характеризовали классическими мезенхимальными стромальными клеточными маркерами с помощью проточной цитометрии. Затем с помощью лентивирусного вектора iMSK трансдуцировали для стабильной сверхэкспрессии SCX (iMSC^SCX+). Эти клетки^{iMSC SCX+} могут быть дополнительно преобразованы в iTenoциты путем одноосного растягивающего нагружения с помощью 2D-биореактора. Полученные клетки характеризовались наблюдением за повышением регуляции ранних и поздних маркеров сухожилий, а также отложением коллагена. Этот метод генерации iTenoцитов может быть использован для помощи исследователям в разработке потенциально неограниченного готового аллогенного источника клеток для применения в терапии сухожильными клетками.

Введение

Чтобы решить современные проблемы восстановления сухожилий и связок, существует потребность в соответствующем клеточном кандидате, подходящем для клеточной терапии. Одним из направлений исследований в тканевой инженерии для восстановления сухожилий является изучение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (BM-MSCs) и стромальных клеток жировой ткани (ASC) в качестве потенциальных стратегий. Эти клетки обладают мультипотентной способностью, большой численностью и регенеративным потенциалом in vivo. Кроме того, они показали повышенную способность к заживлению и улучшенные функциональные результаты на животных моделях¹. Тем не ме....

протокол

Этот протокол производства iTenoцитов может быть выполнен в три основных этапа: от ИПСК до iМСК (10 дней), от iMSC до iMSC^SCX+ (2 недели), от iMSC^SCX+ до iTenocytes (минимум 4 дня). Каждый важный шаг в протоколе может быть приостановлен и перезапущен позже, в зависимости от сроков эксперимента. Для методов, связанных с культивированием клеток, следует использовать стерильные методы. Все клетки в этом протоколе должны выращиваться при температуре 37 °C, 5%_CO2 и влажности 95%.

1. Индукция ИПСК человека в индуцированные мезенхимальные стромальные клетки (МСК)

1. Подготовка к эксперименту....

Результаты

Дифференциация ИПСК человека в ИМСК
Как было описано ранее, современный протокол дифференцировки ИПСК в МСК предполагает формирование эмбриоидных тел². Этот процесс занимает около десяти дней, чтобы индуцировать МСК из ИПСК (рис. 1А). Тем не менее,.......

Обсуждение

В этом протоколе iTenoциты генерируются через три основных этапа: (1) индукция ИПСК в МСК, (2) гиперэкспрессия SCX с использованием лентивирусного вектора и (3) созревание клеток посредством 2D одноосного натяжения.

Представленный протокол дифференциации ИПСК в МСК был ранее оп?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Accutase	StemCell Technologies	7920	cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution	Thermofisher	15240096
Anti-CD105	Ancell	326-050
APC mouse anti-human CD44	BD Biosciences	559942
APC mouse IgG2 K isotype control	BD Biosciences	555745
BenchMark fetal bovine serum	GeminiBio	100-106
Biglycan	Thermofisher	Hs00959143_m1
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermofisher	11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)	ATCC	30-2003
Fibronectin bovine plasma	Sigma Aldrich	F1141
FITC mouse anti-human CD90	BD Biosciences	555595
Gelatin from porcine skin	Sigma Aldrich	G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE	Bio-Rad	STAR117
HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
IMDM, no phenol red	Thermofisher	21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1	Cedars-Sinai iPSC Core Facility	N/A	https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC	Miltenyi Biotec	130-113-271
KnockOut serum replacement	Thermofisher	10828010
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4544
L-Glutamine	Thermofisher	2503081
Matrigel	Corning	354230	basement membrane matrix
MechanoCulture FX	CellScale	N/A	stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution	Thermofisher	11140050
Mohawk human Taqman primer	Thermofisher	Hs00543190_m1
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
PBS	Thermofisher	10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer	Thermofisher	Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma Aldrich	192066
Polybrene infection/transfection reagents	Millipore Sigma	TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer	RnD Systems	240-B
Scleraxis human Taqman primer	Thermofisher	Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone	OriGene	RC224305L4
Silicone plates	CellScale	N/A
Sodium azide	Millipore Sigma	S2002
Tenascin C human Taqman primer	Thermofisher	Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer	Thermofisher	Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer	Thermofisher	Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT	Bioland Scientific LLC	B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermofisher	25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3	Thermofisher	Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride	Biogems	1293823