Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье описана процедура получения iTenoцитов путем генерации мезенхимальных стромальных клеток, полученных из iPSC, с комбинированной гиперэкспрессией Scleraxis с использованием лентивирусного вектора и одноосным растяжением через 2D-биореактор.

Аннотация

Сегодняшние проблемы в восстановлении сухожилий и связок требуют определения подходящего и эффективного кандидата для клеточной терапии для стимуляции регенерации сухожилий. Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) были изучены как потенциальная стратегия тканевой инженерии для восстановления сухожилий. Несмотря на то, что они мультипотентны и обладают регенеративным потенциалом in vivo, они ограничены в своей способности к самообновлению и демонстрируют фенотипическую гетерогенность. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут обойти эти ограничения благодаря своей высокой способности к самообновлению и беспрецедентной пластичности развития. В развитии теноцитов склераксис (Scx) является важнейшим прямым молекулярным регулятором дифференцировки сухожилий. Кроме того, было показано, что механорегуляция является центральным элементом, управляющим развитием и заживлением эмбриональных сухожилий. Таким образом, мы разработали протокол для инкапсуляции синергетического эффекта биологической и механической стимуляции, который может быть важен для генерации теноцитов. ИПСК индуцировали превращение в мезенхимальные стромальные клетки (МСК) и характеризовали классическими мезенхимальными стромальными клеточными маркерами с помощью проточной цитометрии. Затем с помощью лентивирусного вектора iMSK трансдуцировали для стабильной сверхэкспрессии SCX (iMSCSCX+). Эти клеткиiMSC SCX+ могут быть дополнительно преобразованы в iTenoциты путем одноосного растягивающего нагружения с помощью 2D-биореактора. Полученные клетки характеризовались наблюдением за повышением регуляции ранних и поздних маркеров сухожилий, а также отложением коллагена. Этот метод генерации iTenoцитов может быть использован для помощи исследователям в разработке потенциально неограниченного готового аллогенного источника клеток для применения в терапии сухожильными клетками.

Введение

Чтобы решить современные проблемы восстановления сухожилий и связок, существует потребность в соответствующем клеточном кандидате, подходящем для клеточной терапии. Одним из направлений исследований в тканевой инженерии для восстановления сухожилий является изучение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (BM-MSCs) и стромальных клеток жировой ткани (ASC) в качестве потенциальных стратегий. Эти клетки обладают мультипотентной способностью, большой численностью и регенеративным потенциалом in vivo. Кроме того, они показали повышенную способность к заживлению и улучшенные функциональные результаты на животных моделях1. Тем не ме....

протокол

Этот протокол производства iTenoцитов может быть выполнен в три основных этапа: от ИПСК до iМСК (10 дней), от iMSC до iMSCSCX+ (2 недели), от iMSCSCX+ до iTenocytes (минимум 4 дня). Каждый важный шаг в протоколе может быть приостановлен и перезапущен позже, в зависимости от сроков эксперимента. Для методов, связанных с культивированием клеток, следует использовать стерильные методы. Все клетки в этом протоколе должны выращиваться при температуре 37 °C, 5%CO2 и влажности 95%.

1. Индукция ИПСК человека в индуцированные мезенхимальные стромальные клетки (МСК)

  1. Подготовка к эксперименту....

Результаты

Дифференциация ИПСК человека в ИМСК
Как было описано ранее, современный протокол дифференцировки ИПСК в МСК предполагает формирование эмбриоидных тел2. Этот процесс занимает около десяти дней, чтобы индуцировать МСК из ИПСК (рис. 1А). Тем не менее,.......

Обсуждение

В этом протоколе iTenoциты генерируются через три основных этапа: (1) индукция ИПСК в МСК, (2) гиперэкспрессия SCX с использованием лентивирусного вектора и (3) созревание клеток посредством 2D одноосного натяжения.

Представленный протокол дифференциации ИПСК в МСК был ранее оп?.......

Раскрытие информации

У всех авторов нет конфликта интересов, подлежащего раскрытию.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано NIH/NIAMS K01AR071512 и CIRM DISC0-14350 Дмитрию Шейну. Две лентивирусные упаковочные плазмиды были подарком лаборатории Саймона Нотта (Департамент биомедицинских наук, Медицинский центр Седарс-Синай).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanol Sigma AldrichM3148
AccutaseStemCell Technologies7920cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solutionThermofisher15240096
Anti-CD105Ancell326-050
APC mouse anti-human CD44BD Biosciences559942
APC mouse IgG2 K isotype controlBD Biosciences555745
BenchMark fetal bovine serumGeminiBio100-106
BiglycanThermofisherHs00959143_m1
Bovine serum albuminMillipore SigmaA3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primerThermofisherHs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primerThermofisherHs00943809_m1
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol redThermofisher11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)ATCC30-2003
Fibronectin bovine plasmaSigma AldrichF1141
FITC mouse anti-human CD90BD Biosciences555595
Gelatin from porcine skinSigma AldrichG1890
Goat anti Mouse IgG1-PEBio-RadSTAR117
HEK 293T/17ATCCCRL-11268
IMDM, no phenol redThermofisher21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1Cedars-Sinai iPSC Core FacilityN/Ahttps://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITCMiltenyi Biotec130-113-271
KnockOut serum replacementThermofisher10828010
L-ascorbic acidSigma AldrichA4544
L-GlutamineThermofisher2503081
MatrigelCorning354230basement membrane matrix
MechanoCulture FXCellScaleN/Astretching apparatus
MEM non-essential amino acids solutionThermofisher11140050
Mohawk human Taqman primerThermofisherHs00543190_m1
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276
PBSThermofisher10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primerThermofisherHs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)Sigma Aldrich192066
Polybrene infection/transfection reagentsMillipore SigmaTR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primerRnD Systems240-B
Scleraxis human Taqman primerThermofisherHs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF cloneOriGeneRC224305L4
Silicone platesCellScaleN/A
Sodium azideMillipore SigmaS2002
Tenascin C human Taqman primerThermofisherHs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primerThermofisherHs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primerThermofisherHs00170261_m1
Transfection reagent, BioTBioland Scientific LLCB01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermofisher25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3ThermofisherHs03043892_m1
Y-27632 dihydrochlorideBiogems1293823

Ссылки

  1. Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
  2. Sheyn, D., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

205

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены