JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Модель ишемии-реперфузионного повреждения (ИРИ) может быть использована на разных стадиях развития острого повреждения почек (ОПП), особенно при прогрессировании ОПП в хроническую болезнь почек (ХБП). В данной статье мы описываем процедуру разработки модели IRI у мышей с помощью трансабдоминального доступа, с зажимом ножек почек с помощью сосудистого зажима для индуцирования ишемического повреждения.

Аннотация

Острое повреждение почек (ОПП) определяется как быстрое снижение функции почек, при котором стойкая почечная дисфункция постепенно прогрессирует до хронической болезни почек (ХБП) из-за необратимой потери нефронов и их дезадаптивной репарации. В последние годы частота ОПП растет в связи с различными этиологиями, включая обезвоживание, сепсис, нефротоксичность, мышечные повреждения и большие травмы, при которых большинство эпизодов приходится на ишемийско-реперфузионное повреждение (ИРИ). Разработка модели IRI у мышей индуцируется хирургическим пережатием ножек почек, что обеспечивает мощные и контролируемые инструменты для доклинических моделей ОПП. Важно отметить, что модель IRI развертывается на разных этапах развития ОПП, особенно в процессах от ОПП к ХБП. Несмотря на то, что модель IRI широко практикуется во многих лабораториях, ряд переменных по-прежнему влияет на результаты этой модели. В данной статье мы описываем процедуру разработки модели IRI, чтобы предоставить исследователям воспроизводимый и надежный метод изучения основного патогенеза в развитии ОПП и прогрессирования ОПП в ХБП.

Введение

Острое повреждение почек (ОПП) – тяжелый клинический синдром со значительной заболеваемостью и смертностью, определяемый как повышение уровня креатинина сыворотки крови на ≥ 0,3 мг/дл (26,5 мкМ/л) в течение 48 ч или повышение уровня креатинина сыворотки крови до ≥ в 1,5 раза от исходного уровня в течение 7 дней, или объема мочи < 0,5 мл/кг/ч в течение 6 ч1, 2,3. Несмотря на десятилетия исследований, эффективная терапия ОПП для облегчения повреждения почек или ускорения их восстановления отсутствует, и у значительной части пациентов с ОПП прогрессирует хроническая болезнь почек (ХБП)4,5,6. Сложные молекулы и пути частично участвуют в ОПП и его прогрессировании, поэтому доклинические модели предоставляют мощные инструменты для разгадки этих сложностей и разработки эффективных терапевтических методов.

Клинически ишемия-реперфузионное повреждение (ИРИ) является основной причиной ОПП при различных состояниях, включая операции на сердце и печени, циркуляторный шок, обезвоживание, сепсис, окклюзию или обструкцию почечных сосудов, трансплантацию почки и т.д.7. Модель мыши IRI-AKI используется с 1960-х годов; Данная модель была разработана путем хирургического пережатия ножек почек нетравматичными зажимами у мышей, приводящих к ишемии и последующей реперфузии почечного кровотока путем удаления зажимов. Модель IRI-ОПП обычно характеризуется гибелью клеток почечных канальцев и прогрессирующим повреждением почечной ткани. IRI является одной из наиболее распространенных моделей, используемых для патогенеза и терапевтического вмешательства при ОПП по нескольким причинам: (1) Простота и безопасность хирургической процедуры повышают выживаемость и вероятность успеха модели IRI-ОПП8; (2) Поскольку ишемия является основной этиологией при ОПП человека, модель IRI-ОПП лучше использовать для оценки клинического события ОПП9; (3) Модель IRI может представлять повреждение почек и гистопатологические изменения на разных стадиях ОПП, что также применимо для изучения прогрессирования от ОПП к ХБП10. В зависимости от плана эксперимента, модели ОПП, индуцированные ИРИ, включают двустороннюю ИРИ, одностороннюю ИРИ с интактной контралатеральной почкой и одностороннюю ИРИ с одновременной контралатеральной нефрэктомией. Примечательно, что модель двустороннего ИРИ считается более актуальной для патологических состояний ОПП у человека, поскольку обе почки были затронуты кровоснабжением11. Модель IRI применима для моделирования эффектов снижения почечного кровотока после трансплантации почки, шунтирования сердца, почечной сосудистой или нефронсохраняющей хирургии, а также в условиях гипотензии9. В данной статье мы описываем процедуру двусторонней модели IRI, чтобы предоставить исследователям последовательный и надежный метод изучения основного патогенеза при ишемическом ОПП, вызванном ишемией.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Самцы мышей C57BL/6J в возрасте 8 недель и массой тела 25 г были использованы для установления модели ОПП методом двусторонней ишемии-реперфузии. Согласно предыдущим исследованиям, мы поддерживаем температуру тела на уровне около 36,5 °C-37 °C, а продолжительность ишемии почек составляет 30 минут в хирургии IRI12,13. Всего для каждой группы требовалось по 6 мышей, а в качестве контроля служили мыши, управляемые имитацией. Эксперименты на животных в этом исследовании были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Чжэцзянского университета для защиты благополучия животных. Все процедуры исследования на животных проводились в соответствии с этическими нормами и принципами Чжэцзянского университета.

1. Предоперационная подготовка

  1. Под высоким давлением стерилизуют все хирургические инструменты.
  2. Приготовьте обезболивающий раствор, добавив 2 мл кетамина и 0,4 мл ксилазина в 7,6 мл стерильного физиологического раствора. Обезболивайте мышь смесью кетамина (80 мг/кг) и ксилазина (16 мг/кг) путем внутрибрюшинного введения. Оцените глубину анестезии с помощью рефлекса щипкования пальцев ног.
  3. Положите мышь под наркозом на гомеотермическое одеяло, чтобы убедиться, что ее дыхательные пути остаются свободными. Поддерживайте температуру тела в пределах 36,5-37 °С.
  4. Покройте глаза мыши 1% тетрациклина гидрохлоридной глазной мазью, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
  5. Сбрейте волосы на животе машинкой для стрижки волос и очистите кожу хирургической области раствором повидон-йода в 3 раза.

2. Хирургия

  1. Хирургическими ножницами через кожу и мышечный слой сделайте срединный разрез брюшной полости примерно на 1-1,5 см и раскройте брюшную полость с помощью распылятеля.
  2. Обнажите почку, переместив забрюшинный жир и сдвинув кишечник и другие органы в офсайд с помощью ватного тампона. Почка расположена в забрюшинном пространстве, примерно в 0,5 см латеральнее позвоночника и ниже13-го ребра.
  3. Рассеките ножку почки тонкими заостренными щипцами, чтобы отделить и удалить фасцию и жировую ткань и обнажить ножки левой почки.
  4. Зажмите ножки почек сосудистым зажимом с помощью удерживающих щипцов и убедитесь, что повреждение сосудов было как можно меньше. Избегайте пережатия избыточного жира почечного синуса, что может привести к неполной почечной ишемии.
  5. Установите продолжительность ишемии почки, начиная с пережатия на 30 минут. Характерной чертой успешной ишемии является то, что почка постепенно меняет цвет с красного на темно-фиолетовый в течение нескольких минут.
  6. Переместите почку в забрюшинное пространство. Повторите процедуру на контралатеральной стороне, чтобы обнажить и зажать правые ножки почек.
  7. Записывайте время ишемии с каждой стороны отдельно, чтобы убедиться, что обе почки получают точную продолжительность ишемии. Снова откройте разрез и освободите сосудистый зажим в конце ишемии.
  8. Переместите почку в забрюшинное пространство, а затем сшите мышцу и кожу слой за слоем с помощью шовного материала Vicryl 4-0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургические процедуры должны проводиться в стерильных условиях. При необходимости очищайте хирургический стол и инструменты с содержанием этанола 75% во время операции.

3. Послеоперационный уход

  1. Введите 0,5-1 мл теплого и стерильного физиологического раствора путем внутрибрюшинного введения для компенсации потери жидкости.
  2. Сохраняйте лежачее положение на грудине с вниманием до тех пор, пока мышь не придет в сознание. Положите мышь на гомеотермическое одеяло до тех пор, пока она полностью не придет в сознание, затем вернитесь в свою клетку. Не возвращайте мышь в компанию других животных до полного выздоровления.
  3. Давайте бупренорфин в дозе 0,05-0,10 мг/кг каждые 12 ч в течение первых 3 дней для облегчения послеоперационной боли. Наблюдайте за операционными мышами каждый день.

4. Оценка модели

  1. Окрашивание гематоксилин-эозином (HE)
    1. Усыпляйте животных с использованием пентобарбитала натрия путем внутрибрюшинной инъекции на 1, 3, 7 или 14 день после ИРИ.
    2. Зафиксируйте свежие ткани почек с помощью 4% параформальдегида (PFA) на ночь и храните в 75% этаноле при температуре 4 °C.
    3. После обезвоживания и заделки полученные образцы разрезать на толщину 8 мкм для окрашивания.
    4. Депарафинизируйте участки тканей в ксилоле, а затем регидратируйте с уменьшением концентрации этанола.
    5. Окрашивайте участки ткани гематоксилином и эозином.
    6. Обезвоживайте участки тканей за счет повышения концентрации этанола и ксилола.
  2. Анализ функции почек
    1. Сбор образцов крови методом забора крови из глазного яблока после анестезии.
    2. Центрифугируйте образцы крови при 12000 х г в течение 10 мин для отделения сыворотки.
    3. Определение уровня креатинина сыворотки крови и азота мочевины (мочевины) в крови с помощью автоматического сухохимического анализатора для мониторинга функции почек.
  3. ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР)
    1. Извлеките общую РНК из тканей почек с помощью набора для быстрого извлечения РНК, а затем синтезируйте кДНК с помощью набора для смешивания обратной транскриптазы. Проведите ОТ-ПЦР с помощью набора SYBR Green Premix Kit и запустите на приборе для ОТ-ПЦР. Использованные здесь последовательности праймеров были описаны до14: KIM1 вперед, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGA-3'; реверс 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3'; нападающий NGAL, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3; реверс 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3'; GAPDH нападающий, 5'-GGTGAAGGTCGGTGAACG-3'; реверс 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Состояние почек во время операции

Характерной чертой успешной ишемии является то, что почка постепенно меняет цвет с красного на темно-фиолетовый в течение 1-2 минут, а успешная реперфузия характеризуется тем, что почка постепенно меняется с те...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В данной статье мы подробно описали модель почечной ИРИ, подчеркнув, что она является надежной моделью для прогрессирования ОПП и ОПП в ХБП. Кроме того, мы демонстрируем влияние двух основных критериев повреждения почек, включая гистологию и функцию почек.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Мы выражаем признательность всем участникам за сотрудничество в настоящем исследовании. Это исследование было поддержано финансированием Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (LZ22H050001) и провинциальной программы провинции Чжэцзян по выращиванию инновационных талантов в области здравоохранения высокого уровня.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Animal hair clipperFEIYUBIO19-7002
1-ml syringesLongreenSR60061
EthanolMacklinE885996
GauzeFEIYUBIO19-5022
Homeothermic monitor systemWarmmate40 x 50
Needle holderDKBTCZQ-00160
SpreaderRWDR22029-03
Sterile salineBiosharpBL158A
Tissue scissorsDKBTDC-YKJ1002
Tissue tweezersDKBTDK079904
Vascular clipFine Science Tools18055-02
Vicryl sutureShanghai Jinhuan4 -0 

Ссылки

  1. Al-Jaghbeer, M., Dealmeida, D., Bilderback, A., Ambrosino, R., Kellum, J. A. Clinical decision support for in-hospital AKI. J Am Soc Nephrol. 29 (2), 654-660 (2018).
  2. Kellum, J. A., Lameire, N. KDIGO AKI Guideline Work Group. Diagnosis, evaluation, and management of acute kidney injury: a KDIGO summary (Part 1). Crit Care. 17 (1), 204(2013).
  3. Zhang, C., et al. The Hippo pathway and its correlation with acute kidney injury. Zool Res. 43 (5), 897-910 (2022).
  4. He, L., et al. AKI on CKD: heightened injury, suppressed repair, and the underlying mechanisms. Kidney Int. 92 (5), 1071-1083 (2017).
  5. Sato, Y., Takahashi, M., Yanagita, M. Pathophysiology of AKI to CKD progression. Semin Nephrol. 40 (2), 206-215 (2020).
  6. Wang, Z., Zhang, C. From AKI to CKD: Maladaptive repair and the underlying mechanisms. Int J Mol Sci. 23 (18), 10880(2022).
  7. Hoste, E. A. J., et al. Global epidemiology and outcomes of acute kidney injury. Nat Rev Nephrol. 14 (10), 607-625 (2018).
  8. Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
  9. Skrypnyk, N. I., Siskind, L. J., Faubel, S., de Caestecker, M. P. Bridging translation for acute kidney injury with better preclinical modeling of human disease. Am J Physiol Renal Physiol. 310 (10), F972-F984 (2016).
  10. Ferenbach, D. A., Bonventre, J. V. Mechanisms of maladaptive repair after AKI leading to accelerated kidney ageing and CKD. Nat Rev Nephrol. 11 (5), 264-276 (2015).
  11. Zhang, J., et al. A two-stage bilateral ischemia-reperfusion injury-induced AKI to CKD transition model in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 319 (2), F304-F311 (2020).
  12. Hukriede, N. A., et al. Experimental models of acute kidney injury for translational research. Nat Rev Nephrol. 18 (5), 277-293 (2022).
  13. Bao, Y., Yuan, Y., Chen, J., Lin, W. Kidney disease models: tools to identify mechanisms and potential therapeutic targets. Zool Res. 39 (2), 72-86 (2018).
  14. Bao, Y., et al. DNA demethylase Tet2 suppresses cisplatin-induced acute kidney injury. Cell Death Discov. 7, 167(2021).
  15. Rossiter, A., La, A., Koyner, J. L., Forni, L. G. New biomarkers in acute kidney injury. Crit Rev Clin Lab Sci. 5, 1-22 (2023).
  16. Hesketh, E. E., et al. Renal ischemia reperfusion injury: a mouse model of injury and regeneration. J Vis Exp. (88), e51816(2014).
  17. Zager, R. A., Altschuld, R. Body temperature: an important determinant of severity of ischemic renal injury. Am J Physiol. 251, F87-F93 (1986).
  18. Delbridge, M. S., Shrestha, B. M., Raftery, A. T., El Nahas, A. M., Haylor, J. L. The effect of body temperature in a rat model of renal ischemia-reperfusion injury. Transplant Proc. 39 (10), 2983-2985 (2007).
  19. Le Clef, N., Verhulst, A., D'Haese, P. C., Vervaet, B. A. Unilateral renal ischemia-reperfusion as a robust model for acute to chronic kidney injury in mice. PLoS One. 11 (3), 0152153(2016).
  20. Tannenbaum, C., Ellis, R. P., Eyssel, F., Zou, J., Schiebinger, L. Sex and gender analysis improves science and engineering. Nature. 575, 137-146 (2019).
  21. Lee, H. T., Ota-Setlik, A., Fu, Y., Nasr, S. H., Emala, C. W. Differential protective effects of volatile anesthetics against renal ischemia-reperfusion injury in vivo. Anesthesiology. 101 (6), 1313-1324 (2004).
  22. Heyman, S. N., Rosen, S., Rosenberger, C. Animal models of renal dysfunction: acute kidney injury. Expert Opin Drug Discov. 4 (6), 629-641 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены