Получение и характеристика органоидов колоректального рака из клеточной линии SW1222 в ультракороткой самоорганизующейся пептидной матрице

Резюме

Этот протокол направлен на оценку биофункциональных самоорганизующихся пептидов на предмет клеточной адгезии, морфологии органоидов и экспрессии генов путем иммуноокрашивания. Мы будем использовать клеточную линию колоректального рака, чтобы обеспечить экономически эффективный способ получения органоидов для интенсивного тестирования.

Аннотация

Ультракороткие самоорганизующиеся пептиды (САП) могут спонтанно образовывать нановолокна, напоминающие внеклеточный матрикс. Эти волокна позволяют образовывать гидрогели, которые являются биосовместимыми, биоразлагаемыми и неиммуногенными. Ранее мы доказали, что САП, будучи биофункционализированными с помощью белковых мотивов, могут имитировать характеристики внеклеточного матрикса, которые поддерживают формирование колоректальных органоидов. Эти биофункциональные пептидные гидрогели сохраняют механические свойства исходного родительского пептида, его настраиваемость и печатаемость, при этом они включают сигналы, которые позволяют клеточно-матриксным взаимодействиям увеличивать клеточную адгезию. В данной статье представлены протоколы, необходимые для оценки и характеристики влияния различных биофункциональных пептидных гидрогелей на адгезию клеток и формирование просвета с использованием клеточной линии аденокарциномы рака, способной экономически эффективно образовывать органоиды колоректального рака. Эти протоколы помогут оценить влияние биофункционального пептидного гидрогеля на клеточную адгезию и образование люминалей с помощью иммуноокрашивания и анализа флуоресцентного изображения. Клеточная линия, используемая в этом исследовании, ранее использовалась для генерации органоидов в матрицах животного происхождения.

Введение

В последние годы самоорганизующиеся пептиды (САП) стали перспективными биоматериалами для применения в тканевой инженерии. САП обладают уникальными свойствами, включая спонтанное образование нановолокон, биосовместимость, биоразлагаемость и неиммуногенность, что делает их привлекательными кандидатами^{для разработки} скаффолда. САП ранее использовались вместе с различными типами клеток, и, в частности, сообщалось, что ультракороткие САП способствовали инкапсуляции стволовых клеток, сохраняя их плюрипотентность в течение длительных периодов, охватывающих более 30 пассажей, и с минимальной частотой хромосомных аберраций

протокол

1. Приготовление буфера и раствора

ПРИМЕЧАНИЕ: Все указанные концентрации являются конечными концентрациями.

1. Добавьте фетальную бычью сыворотку (FBS) и пенициллин-стрептомицин в конечной концентрации 10% и 1% соответственно, чтобы получить полную модифицированную среду Dulbecco's Medium (IMDM) от Iscove. Хранить в темноте при температуре 4 °C до 1 месяца.
2. Смешайте MgCl₂ (3 мМ), сахарозу (300 мМ) и Triton X-100 (0,5%) в фосфатном буфере (PBS) для приготовления буфера для пермеабилизации. Храните этот раствор при температуре 4 °C до 2 месяцев.
3. Объедините бычий сывороточный альбумин (БС....

Результаты

Во-первых, мы оценили клетки, выращенные в 24-луночном планшете в течение 7 дней с помощью визуализации в светлом поле. Мы идентифицировали небольшие кластеры клеток, собирающихся в органоиды в течение недели, как показано на рисунке 4. Метод контролируемого сканирования ?.......

Обсуждение

Огромный потенциал САП в биомедицинских исследованиях подчеркивается их податливостью и адаптивностью за счет биофункционализации. При таком обширном спектре перестановок возникает проблема эффективного тестирования и определения наиболее перспективных конфигураций для конкретн.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	14190144
6-well plate, tissue culture treated	Corning	07-200-83
10x PBS, no calcium, no magnesium	Gibco	70011044
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906
24-well plate, tissue culture treated	Corning	09-761-146
96-well black plate, tissue culture treated	Corning	07-200-565
alamarBlue Cell Viability Reagent	Invitrogen	DAL1025
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal	Abcam	ab40839	Secondary used: anti-rabbit Dylight 633
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal	Abcam	ab16505	Secondary used: anti-rabbit Alexa 488
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal	Abcam	ab190085	Secondary used: anti-goat Alexa 488
BSA	Sigma-Aldrich	A9418
Cellpose 2.0	NA	NA	Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan	ZEISS	LSM 880
DAPI	Invitrogen	D1306
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055
Glycine	Cytiva	GE17-1323-01
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11008
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633	Invitrogen	35562
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)	Gibco	16140071
ImageJ 1.54f	NIH	NA
IMDM	Gibco	12440079
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Invitrogen	L3224
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)	Sigma-Aldrich	M2393
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free	Corning	356255	Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.
Microscope, brightfield
Microscope, EVOS	Thermo Scientific	EVOS M7000
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154	OriginLab Corp	NA
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)	Lab-made	NA	Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.
Rhodamine Phalloidin	Invitrogen	R415
Round Cover Slip, 10 mm diameter	VWR	631-0170
Scanning Electron Microscope	Thermo Fisher - FEI	TENEO VS
Sterile 30 μm strainer	Sysmex	04-004-2326
sucrose	Sigma-Aldrich	S1888
SW1222 cell line	ECACC	12022910
Triton x-100	Thermo Scientific	85111
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco	25200056
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
UltraPure water	Invitrogen	10977015