Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем метод репликации микроокружения опухоли глиомы на инвазивном фронте, который включает в себя поток интерстициальной жидкости. Эта модель представляет собой гидрогель гиалуронан-коллаген I в виде вставки для культуры тканей, где может быть применена напорная головка для жидкости. Инвазия может быть количественно определена, а клетки могут быть выделены или лизированы.

Аннотация

Рецидив глиобластомы является основным препятствием на пути к успеху лечения и обусловлен инвазией стволовых клеток глиомы (ГСК) в здоровые ткани, которые недоступны для хирургической резекции и устойчивы к существующей химиотерапии. Движение жидкости на тканевом уровне, или интерстициальный поток жидкости (IFF), регулирует инвазию GSC в зависимости от микроокружения опухоли (TME), что подчеркивает потребность в модельных системах, включающих как IFF, так и TME. Мы представляем доступный метод репликации инвазивной ТМЭ при глиобластоме: гиалуронан-коллагеновый гидрогель, состоящий из человеческих ГСК, астроцитов и микроглии, засеянных во вкладыш для культуры тканей. Повышенный IFF может быть представлен путем приложения к гидрогелю напора жидкости. Кроме того, эта модель может быть настроена для воспроизведения меж- или внутрипациентских различий в клеточных соотношениях, скоростях потока или жесткости матрицы. Инвазия может быть количественно определена, в то время как гели могут быть получены для различных результатов, включая инвазию GSC, проточную цитометрию, экстракцию белка или РНК или визуализацию.

Введение

Глиобластома является разрушительным заболеванием, характеризующимся короткой выживаемостью1, которая лишь умеренно увеличивается при клинически доступных методах лечения 2,3. Это препятствие для эффективной терапии в значительной степени обусловлено высокой инфильтративной природой химиорезистентных стволовых клеток глиомы (ГСК), которые недоступны для резекции и рецидивирующих опухолей4. В то же время, ГСК обладают высокой пластичностью, реагируя на различные стимулы в опухолевом микроокружении (ТМЭ) с целью выживания и

протокол

Этот протокол был разработан в соответствии с руководящими принципами, установленными Институциональным комитетом по биобезопасности Технологического института Вирджинии.

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры в шкафу для клеточных культур BSL-2, если не указано иное. Пожалуйста, обратитесь в комитет по биобезопасности учреждения за рекомендациями по использованию человеческих клеток.

1. Расчеты на приготовление геля

  1. Рассчитайте количество условий, необходимых для проведения эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: «Состояние» определяется содержимым раствора (наприм....

Результаты

Репрезентативные данные по инвазии (рис. 3), жизнеспособности и экспрессии Ki67 и CD71 с помощью проточной цитометрии (рис. 4) представлены для линий GSC, как было ранее опубликовано для тио-модифицированного гиалуронан-коллагенового гидрогел.......

Обсуждение

Сборка модели TME включает в себя шесть основных этапов: 1) пропускание клеток и разделение клеток между одинаковыми состояниями, 2) сборка концентрированного коллагенового раствора для всех состояний, 3) объединение компонентов геля (клеток, коллагена, метакрилированн?.......

Раскрытие информации

У авторов нет соответствующих конфликтов интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить источники финансирования этой работы: Национальный институт здравоохранения Национального института рака (R37 CA222563 до J.M.), Фонд Култера (J.M.) и Virginia Tech ICTAS-CEH (J.M. & J.H.). ГСК, использованные в этом анализе, были получены Якубом Годлевски, доктором философии (Гарвардская медицинская школа).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
12 Well Tissue Culture Plate, SterileCelltreat Scientific Products 229112
250 mL Filter  System, PES Filter Material, 0.22 µm, 50 mm, SterileDOT Scientific667706
385 nm, 1650 mW (Min) Mounted LED, 1700 mA Thorlabs M385LP1-C1
75cm2 Tissue Culture Flask - Vent Cap, SterileCelltreat Scientific Products229341
8.0 μm Cell Culture Plate Insert 12 mm DiameterMillicellPI8P01250
Absolute Ethanol, 200 proof, Molecular Biology GradeThermo Fisher ScientificT038181000CSEthanol for flow cytometry dead cell control.
Astrocyte Medium (Astrofull)ScienCell Research Laboratories1801Contains astrobasal, FBS, and penicillin/streptomycin. 
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A (Gibco)Thermo Fisher Scientific12587010
BSA (MACS)Miltenyi Biotec 130-091-376
CD71 antibody (eBioscience, Invitrogen)Fisher Scientific 25-0719-41
Cell Counting Chambered SlidesNexcelom BioscienceCHT4-PD100-002
Cell ScrapersBiologix USA 70-1250
Cellometer K2 Fluorescent Cell Counter (Nexelcom Bioscience)VWR NEXCCMK2-SK150-FCS
Centrifuge - Low-SpeedEppendorf 5702 RCentrifuge for cell culture.
Clear Polystyrene 96-Well Microplates, CorningFisher Scientific07-200-108V-bottom plates for flow cytometry staining.
CO2 Incubator, 150L, Heracell 150i (Thermo Scientific)Thermo Fisher Scientific50116047
Collagen I, High Concentration, Rat TailCorning354249
Collagen I, Rat TailCorning354236"Low" concentration for coating adherent flasks.
Collagenase (CAS# 9001-12-1)United States BiologicalC7511-30
Collimation Adapter for Olympus BX & IX, AR Coating: 350 - 700 nmThorlabsCOP1-A
Cotton Swabs, Q-tips Precision Tips AmazonB01KCJB3R2
Dispase (CAS# 9001-92-7) United States BiologicalD3760
DMEM, high glucose (Gibco)Thermo Fisher Scientific11330032
EVOS FLInvitrogenAMF4300
Fetal Bovine Serum (Gibco)Thermo Fisher Scientific26140079For microglia culture.
Formalin solution, neutral buffered, 10% (Sigma-Aldrich) Millipore SigmaHT501128
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set (eBioscience, Invitrogen)Thermo Fisher Scientific00-5523-00
Glioma stem cellsn/an/aCan be patient derived or commercial glioma stem cell lines. 
Guava easyCyte HT SystemMillipore Sigma0500-4008Flow cytometer.
HBSS (Sigma-Aldrich) Millipore SigmaH6648
HEPES (1 M) (Gibco)Thermo Fisher Scientific15630080
High-Power 1-Channel LED Driver with Pulse Modulation, 10.0 A Max, 50.0 V Max ThorlabsDC2200Interface for UV Lamp.
Hoechst 33342 Solution (20 mM) (Thermo Scientific)Thermo Fisher Scientific62249
Human AstrocytesScienCell Research Laboratories1800Primary astrocytes derived from the cerebral cortex.
Human EGF Recombinant Protein (Gibco)Thermo Fisher ScientificPHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (aa 10-155) Recombinant Protein (Gibco)Thermo Fisher ScientificPHG0021
Immortalized Human Microglia - hTERTApplied Biological Materials T0251
Incu-mixer MP Heated Microplate Vortexer, 2 positionBenchmark Scientific H6002
Ki67 REAfinity, PerCP-Vio 700 antibodyMiltenyi Biotec130-120-420
LED UV Curing MeterGigahertz-OptikX1-RCH-116Optometer to measure UV light intensity.
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Advanced Biomatrix5269-100MG Photoinitiator.
LIVE/DEAD Fixable Near-IR (Invitrogen) Thermo Fisher ScientificL24975
Methacrylated hyaluronic acid (photoHA)Advanced Biomatrix5212-100MG
Microcentrifuge, Sorvall ST8R (Thermo Scientific)Fisher Scientific75-997-203Centrifuge for flow cytometry staining.
N-2 Supplement (100X) (Gibco)Thermo Fisher Scientific17502048
Neurobasal-A Medium (Gibco)Thermo Fisher Scientific10888022
PBS (10X), pH 7.4 without Ca & MgQuality Biological119-069-101
Sodium hydroxide, pellets ACS (CAS# 1310-73-2)VWR 97064-476
Synergy Ultrapure Water Purification System (MilliporeSigma)Fisher Scientific SYNS0HFUS
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red (Gibco)Thermo Fisher Scientific25200056
ViaStain AOPI Staining SolutionNexcelom BioscienceCS2-0106

Ссылки

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2016-2020. Neuro Oncol. 25, 1-99 (2023).
  2. Stupp, R., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

212

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены