Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Описана стратегия пробоподготовки для визуализации ранних эмбрионов данио-рерио в интактном хорионе с помощью светового микроскопа. В нем анализируются различные ориентации, которые эмбрионы приобретают в хорионе на 70% стадиях эпиболии и почки, а также подробно описываются стратегии визуализации для получения клеточного разрешения по всему эмбриону с использованием системы световых листов.

Аннотация

Световая листовая микроскопия стала предпочтительной методологией для получения изображений эмбрионов рыбок данио в реальном времени в длительных временных масштабах с минимальной фототоксичностью. В частности, многовидовая система, которая позволяет вращать образец, позволяет визуализировать целые эмбрионы под разными углами. Тем не менее, в большинстве сеансов визуализации с помощью системы multiview установка образцов является хлопотным процессом, поскольку образцы обычно подготавливаются в полимерной пробирке. Чтобы помочь в этом процессе, данный протокол описывает основные стратегии крепления для визуализации раннего развития данио-рерио между 70% эпиболией и ранними стадиями сомита. В частности, в исследовании приводятся статистические данные о различных положениях, в которых эмбрионы по умолчанию находятся на 70% стадиях эпиболии и зачатков в хорионе. Кроме того, в ней обсуждается оптимальное количество углов и интервал между углами, необходимый для визуализации целых эмбрионов данио-рерио на ранних стадиях развития, чтобы можно было извлечь информацию клеточного масштаба путем объединения различных видов. Наконец, поскольку эмбрион покрывает все поле зрения камеры, что требуется для получения разрешения клеточного масштаба, этот протокол детализирует процесс использования информации о бусинах сверху или снизу эмбриона для регистрации различных видов.

Введение

Обеспечение минимальной фототоксичности является основным требованием для визуализации живых эмбрионов с высоким пространственно-временным разрешением в течение длительных периодов времени. За последнее десятилетие световая листовая микроскопия стала методологией выбора для удовлетворения этого требования 1,2,3,4,5,6,7. Вкратце, в этой методике, которая впервые была использована в ....

протокол

Процедуры содержания и экспериментирования с рыбками данио-рерио, использованные в этом исследовании, были одобрены институциональным комитетом по этике животных, см. Reference TIFR/IAEC/2023-1 и TIFR/IAEC/2023-5. Эмбрионам, полученным путем скрещивания гетерозиготных рыб, экспрессирующих Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)19, вводили мРНК H2A-mCherry (30 pg) на одноклеточной стадии. МРНК H2A-mCherry синтезировали с использованием плазмиды pCS2+ H2A-mCherry (подарок от лаборатории Оутса, EPFL) методом транскрипции in vitro . Эмбрионы, экспрессирующие оба маркера, обозначенные как Utr-GFP и H2A-mCherry, соо....

Результаты

Точная ориентация образца является жизненно важной частью эффективного использования микроскопической установки. Однако ручная ориентация образцов часто невозможна при использовании многоракурсной системы световых листов, учитывая требования к подготовке образ?.......

Обсуждение

Позиционирование эмбриона в правильной ориентации для получения изображения интересующей области является одним из шагов по ограничению скорости, который часто приводит к неудачному сеансу микроскопии для пользователя. Это особенно верно в многоракурсном светово?.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Выражаем признательность д-ру Калидасу Кохале и его команде за обслуживание рыбного хозяйства, а также К. В. Боби за обслуживание светового листового микроскопа. SRN выражает признательность за финансовую поддержку со стороны Департамента атомной энергии (DAE) правительства Индии (номер идентификации проекта. RTI4003, DAE OM No 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 от 11.02.2020), программа Партнерской группы Общества Макса Планка (M.PG. A MOZG0010) и грант Совета по научным и инженерным исследованиям для стартапов (SRG/2023/001716).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose, low gelling temperatureSigma-AldrichA9414
Calcium Chloride dihydrateSigma-Aldrich12022
FIJIVersion: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspensionSigma-AldrichL3280
Magnesium sulfate heptahydrateSigma-AldrichM2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kitThermoFischer ScientificAM1340For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium ChhlorideSigma-AldrichP9541
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05 Adtech Innovations in FluoroplasticsSTW15PTFE tubes
Sodium ChlorideSigma-AldrichS3014
Sodium phosphate dibasicSigma-Aldrich71640
Ultrasonic CleanerLabmanLMUC3Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 SystemZeiss

Ссылки

  1. Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
  2. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены