Визуализация и монтаж легких листов для ранних эмбрионов данио-рерио

Резюме

Описана стратегия пробоподготовки для визуализации ранних эмбрионов данио-рерио в интактном хорионе с помощью светового микроскопа. В нем анализируются различные ориентации, которые эмбрионы приобретают в хорионе на 70% стадиях эпиболии и почки, а также подробно описываются стратегии визуализации для получения клеточного разрешения по всему эмбриону с использованием системы световых листов.

Аннотация

Световая листовая микроскопия стала предпочтительной методологией для получения изображений эмбрионов рыбок данио в реальном времени в длительных временных масштабах с минимальной фототоксичностью. В частности, многовидовая система, которая позволяет вращать образец, позволяет визуализировать целые эмбрионы под разными углами. Тем не менее, в большинстве сеансов визуализации с помощью системы multiview установка образцов является хлопотным процессом, поскольку образцы обычно подготавливаются в полимерной пробирке. Чтобы помочь в этом процессе, данный протокол описывает основные стратегии крепления для визуализации раннего развития данио-рерио между 70% эпиболией и ранними стадиями сомита. В частности, в исследовании приводятся статистические данные о различных положениях, в которых эмбрионы по умолчанию находятся на 70% стадиях эпиболии и зачатков в хорионе. Кроме того, в ней обсуждается оптимальное количество углов и интервал между углами, необходимый для визуализации целых эмбрионов данио-рерио на ранних стадиях развития, чтобы можно было извлечь информацию клеточного масштаба путем объединения различных видов. Наконец, поскольку эмбрион покрывает все поле зрения камеры, что требуется для получения разрешения клеточного масштаба, этот протокол детализирует процесс использования информации о бусинах сверху или снизу эмбриона для регистрации различных видов.

Введение

Обеспечение минимальной фототоксичности является основным требованием для визуализации живых эмбрионов с высоким пространственно-временным разрешением в течение длительных периодов времени. За последнее десятилетие световая листовая микроскопия стала методологией выбора для удовлетворения этого требования 1,2,3,4,5,6,7. Вкратце, в этой методике^{, которая} впервые была использована в ....

протокол

Процедуры содержания и экспериментирования с рыбками данио-рерио, использованные в этом исследовании, были одобрены институциональным комитетом по этике животных, см. Reference TIFR/IAEC/2023-1 и TIFR/IAEC/2023-5. Эмбрионам, полученным путем скрещивания гетерозиготных рыб, экспрессирующих Tg(actb2:GFP-Hsa.UTRN)¹⁹, вводили мРНК H2A-mCherry (30 pg) на одноклеточной стадии. МРНК H2A-mCherry синтезировали с использованием плазмиды pCS2+ H2A-mCherry (подарок от лаборатории Оутса, EPFL) методом транскрипции in vitro . Эмбрионы, экспрессирующие оба маркера, обозначенные как Utr-GFP и H2A-mCherry, соо....

Результаты

Точная ориентация образца является жизненно важной частью эффективного использования микроскопической установки. Однако ручная ориентация образцов часто невозможна при использовании многоракурсной системы световых листов, учитывая требования к подготовке образ?.......

Обсуждение

Позиционирование эмбриона в правильной ориентации для получения изображения интересующей области является одним из шагов по ограничению скорости, который часто приводит к неудачному сеансу микроскопии для пользователя. Это особенно верно в многоракурсном светово?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose, low gelling temperature	Sigma-Aldrich	A9414
Calcium Chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	12022
FIJI			Version: ImageJ 1.54f
Latex beads, carboxylate-modified polystyrene, fluorescent red, 0.5 μm mean particle size, aqueous suspension	Sigma-Aldrich	L3280
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	M2773
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kit	ThermoFischer Scientific	AM1340	For in vitro transccription of H2A-mCherry plasmid
Potassium Chhloride	Sigma-Aldrich	P9541
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
PTFE Sleeving AWG 15L - 1.58 mm ID x 0.15 mm Wall +/-0.05	Adtech Innovations in Fluoroplastics	STW15	PTFE tubes
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640
Ultrasonic Cleaner	Labman	LMUC3	Ultrasonicator
Zeiss LightSheet 7 System	Zeiss