Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол обеспечивает методику сбора и культивирования эксплантированного ганглия дорсального корня (DRG) от взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном устройстве (MC).

Аннотация

Наиболее распространенным признаком боли со стороны периферических нейронов является пониженный порог стимуляции или гиперчувствительность терминальных нервов из ганглиев дорсального корешка (DRG). Одна из предполагаемых причин этой гиперчувствительности связана с взаимодействием между иммунными клетками в периферических тканях и нейронами. Модели in vitro предоставили фундаментальные знания о том, как эти механизмы приводят к гиперчувствительности ноцицепторов. Тем не менее, модели in vitro сталкиваются с проблемой переноса эффективности на человека. Для решения этой проблемы была разработана физиологически и анатомически значимая модель in vitro для культивирования интактных ганглиев дорсальных корешков (DRGs) в трех изолированных компартментах в 48-луночном планшете. Первичные DRG добываются у взрослых крыс Sprague Dawley после гуманной эвтаназии. Лишние нервные корешки обрезают, а ДРГ нарезают на соответствующие размеры для культивирования. Затем DRG выращиваются в натуральных гидрогелях, что обеспечивает устойчивый рост во всех областях. Эта многокомпонентная система предлагает анатомически значимую изоляцию тел клеток DRG от нейритов, физиологически значимых типов клеток и механических свойств для изучения взаимодействий между нервными и иммунными клетками. Таким образом, эта культуральная платформа предоставляет ценный инструмент для исследования стратегий изоляции лечения, что в конечном итоге приводит к улучшению подхода к скринингу для прогнозирования боли.

Введение

Хроническая боль является основной причиной инвалидности и потери работы во всем мире1. Хроническая боль затрагивает около 20% взрослого населения во всем мире и является значительным социальным и экономическим бременем2, при этом общие затраты в Соединенных Штатах оцениваются от 560 до 635 миллиардов долларов США в год3.

Основной периферической особенностью пациентов с хронической болью является пониженный порог стимуляции нервов, что приводит к тому, что нервная система становится более чувствительной к раздражителям 4,5

протокол

Сбор DRG был проведен в соответствии с требованиями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Небраски-Линкольна. Для исследования использовались самки крыс Sprague Dawley в возрасте 12 недель (~250 г). Подробная информация о животных, реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Изготовление и сборка многокамерного устройства

  1. Автоматизированное проектирование и 3D-печать многокамерного устройства
    ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство MC состоит из трех отсеков для выделения тел клеток DRG и нейритов (

Результаты

В настоящем протоколе описан метод сбора и культивирования DRG у взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном (MC) устройстве. Как показано на рисунке 1, DRG, собранный у взрослых крыс, был обрезан и разрезан на ~0,5 мм. Затем обрезанные и разрезанные DRG были помещены в гидроге.......

Обсуждение

В этом протоколе описан метод сбора взрослых DRG Sprague Dawley и их культивирования в 3D-натуральных гидрогелях. В отличие от этого метода, другие подходы к забору DRG у мышей и крыс предполагают изоляцию позвоночного столба. Иссеченный позвоночный столб разрезается вдвое, а спинной мозг удаляет.......

Раскрытие информации

Авторы данного исследования заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NSF (2152065) и премией NSF CAREER Award (1846857). Авторы хотели бы поблагодарить всех нынешних и бывших членов лаборатории Вакса за вклад в этот протокол. Диаграммы на рисунке 1 были сделаны в Biorender.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
#5 forcepsFine Science Tools11252-00For trimming and cutting DRG
10x DMEMMilliporeSigmaD2429
1x PBS (autoclaved)Prepared in lab7.3 - 7.5 pH
24 well platesVWR82050-892To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single useBD309657
48 well platesGreiner Bio-One677180
60 mm Petri dishFisher ScientificFB0875713ATo hold media for trimming and cutting
Aluminium foilFisherbrand01-213-104
B27 Plus 50xThermoFisher17504044For DRG media
Collagen type IIbidi50205
Curved cup Friedman Pearson RongeurFine Science Tools16221-14For dissection
Dumont #3 forcepsFine Science Tools11293-00For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)ThermoFisher16000044For DRG media
Form cureForm Labscuring agent
Form washForm LabsTo wash excess resins off MC
Glass bead sterilizerFisher ScientificNC9531961
Glass vials (8 mL)DWK Life Sciences (Wheaton)224724
GlutaMaxThermoFisher35050-061For DRG media
HEPES (1M)Millipore SigmaH0887
High temp V2 resinFormLabsFLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium SaltMilliporeSigma53747Used to make MAHA
IrgacureMilliporeSigma410896
LamininR&D Systems344600501
Large blunt-nose scissorsMilitexEG5-26For dissection
Large forceps (serrated tips)Militex9538797For dissection
Large sharp-nosed scissorsFine Science Tools14010-15For dissection
Low Retention pipette tipsFisher Scientific02-707-017For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)Prepared in labN/A85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)R&D Systems556-NG-100For DRG media
Neurobasal A MediaThermoFisher10888022For DRG media
ParafilmBemisPM996
ParafilmBemisPM996
Penicillin/Streptomycin (PS)EMD Millipore516106For DRG media
pH test stripsVWR InternationalBDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)USA Scientific1111-2021
Preform 3.23.1 softwareFormslabTo upload STL file
RatCharles River
Resin 3D printerForm LabsForm 3L3D printing MC device
Small sharp-nosed scissorsFine Science Tools14094-11For dissection
Sodium bicarbonateMilliporeSigmaS6014
Straight cup rongeurFine Science Tools16004-16For dissection
Straight edge spring scissorsFine Science Tools15024-10For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)Fisher Scientific22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)Celltreat229747
Tiny spring scissorsWorld Precision Instruments14003For trimming and cutting DRG
UV lampAnalytik Jena USTo photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

DRGin vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены