Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Этот протокол обеспечивает методику сбора и культивирования эксплантированного ганглия дорсального корня (DRG) от взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном устройстве (MC).
Наиболее распространенным признаком боли со стороны периферических нейронов является пониженный порог стимуляции или гиперчувствительность терминальных нервов из ганглиев дорсального корешка (DRG). Одна из предполагаемых причин этой гиперчувствительности связана с взаимодействием между иммунными клетками в периферических тканях и нейронами. Модели in vitro предоставили фундаментальные знания о том, как эти механизмы приводят к гиперчувствительности ноцицепторов. Тем не менее, модели in vitro сталкиваются с проблемой переноса эффективности на человека. Для решения этой проблемы была разработана физиологически и анатомически значимая модель in vitro для культивирования интактных ганглиев дорсальных корешков (DRGs) в трех изолированных компартментах в 48-луночном планшете. Первичные DRG добываются у взрослых крыс Sprague Dawley после гуманной эвтаназии. Лишние нервные корешки обрезают, а ДРГ нарезают на соответствующие размеры для культивирования. Затем DRG выращиваются в натуральных гидрогелях, что обеспечивает устойчивый рост во всех областях. Эта многокомпонентная система предлагает анатомически значимую изоляцию тел клеток DRG от нейритов, физиологически значимых типов клеток и механических свойств для изучения взаимодействий между нервными и иммунными клетками. Таким образом, эта культуральная платформа предоставляет ценный инструмент для исследования стратегий изоляции лечения, что в конечном итоге приводит к улучшению подхода к скринингу для прогнозирования боли.
Хроническая боль является основной причиной инвалидности и потери работы во всем мире1. Хроническая боль затрагивает около 20% взрослого населения во всем мире и является значительным социальным и экономическим бременем2, при этом общие затраты в Соединенных Штатах оцениваются от 560 до 635 миллиардов долларов США в год3.
Основной периферической особенностью пациентов с хронической болью является пониженный порог стимуляции нервов, что приводит к тому, что нервная система становится более чувствительной к раздражителям 4,5
Сбор DRG был проведен в соответствии с требованиями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Небраски-Линкольна. Для исследования использовались самки крыс Sprague Dawley в возрасте 12 недель (~250 г). Подробная информация о животных, реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Изготовление и сборка многокамерного устройства
В настоящем протоколе описан метод сбора и культивирования DRG у взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном (MC) устройстве. Как показано на рисунке 1, DRG, собранный у взрослых крыс, был обрезан и разрезан на ~0,5 мм. Затем обрезанные и разрезанные DRG были помещены в гидроге.......
В этом протоколе описан метод сбора взрослых DRG Sprague Dawley и их культивирования в 3D-натуральных гидрогелях. В отличие от этого метода, другие подходы к забору DRG у мышей и крыс предполагают изоляцию позвоночного столба. Иссеченный позвоночный столб разрезается вдвое, а спинной мозг удаляет.......
Авторы данного исследования заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Эта работа была поддержана грантом NSF (2152065) и премией NSF CAREER Award (1846857). Авторы хотели бы поблагодарить всех нынешних и бывших членов лаборатории Вакса за вклад в этот протокол. Диаграммы на рисунке 1 были сделаны в Biorender.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
#5 forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | For trimming and cutting DRG |
10x DMEM | MilliporeSigma | D2429 | |
1x PBS (autoclaved) | Prepared in lab | 7.3 - 7.5 pH | |
24 well plates | VWR | 82050-892 | To temporarily store harvested and cut DRGs |
3 mL Syringe sterile, single use | BD | 309657 | |
48 well plates | Greiner Bio-One | 677180 | |
60 mm Petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | To hold media for trimming and cutting |
Aluminium foil | Fisherbrand | 01-213-104 | |
B27 Plus 50x | ThermoFisher | 17504044 | For DRG media |
Collagen type I | Ibidi | 50205 | |
Curved cup Friedman Pearson Rongeur | Fine Science Tools | 16221-14 | For dissection |
Dumont #3 forceps | Fine Science Tools | 11293-00 | For dissection |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | For DRG media |
Form cure | Form Labs | curing agent | |
Form wash | Form Labs | To wash excess resins off MC | |
Glass bead sterilizer | Fisher Scientific | NC9531961 | |
Glass vials (8 mL) | DWK Life Sciences (Wheaton) | 224724 | |
GlutaMax | ThermoFisher | 35050-061 | For DRG media |
HEPES (1M) | Millipore Sigma | H0887 | |
High temp V2 resin | FormLabs | FLHTAM02 | |
Hyaluronic Acid Sodium Salt | MilliporeSigma | 53747 | Used to make MAHA |
Irgacure | MilliporeSigma | 410896 | |
Laminin | R&D Systems | 344600501 | |
Large blunt-nose scissors | Militex | EG5-26 | For dissection |
Large forceps (serrated tips) | Militex | 9538797 | For dissection |
Large sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14010-15 | For dissection |
Low Retention pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-017 | For pipetting collagen and MAHA |
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA) | Prepared in lab | N/A | 85 - 115 % methacrylation |
Nerve Growth Factor (NGF) | R&D Systems | 556-NG-100 | For DRG media |
Neurobasal A Media | ThermoFisher | 10888022 | For DRG media |
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Parafilm | Bemis | PM996 | |
Penicillin/Streptomycin (PS) | EMD Millipore | 516106 | For DRG media |
pH test strips | VWR International | BDH35309.606 | |
Pipette tips (1000 µL) | USA Scientific | 1111-2021 | |
Preform 3.23.1 software | Formslab | To upload STL file | |
Rat | Charles River | ||
Resin 3D printer | Form Labs | Form 3L | 3D printing MC device |
Small sharp-nosed scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | For dissection |
Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S6014 | |
Straight cup rongeur | Fine Science Tools | 16004-16 | For dissection |
Straight edge spring scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | For dissection |
Surgical Scaplel blade (No. 10) | Fisher Scientific | 22-079-690 | |
Syring filters, PES (0.22 µm) | Celltreat | 229747 | |
Tiny spring scissors | World Precision Instruments | 14003 | For trimming and cutting DRG |
UV lamp | Analytik Jena US | To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2) |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены