Забор, встраивание и культивирование ганглиев дорсальных корешков в многокамерных устройствах для изучения особенностей периферических нейронов

Резюме

Этот протокол обеспечивает методику сбора и культивирования эксплантированного ганглия дорсального корня (DRG) от взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном устройстве (MC).

Аннотация

Наиболее распространенным признаком боли со стороны периферических нейронов является пониженный порог стимуляции или гиперчувствительность терминальных нервов из ганглиев дорсального корешка (DRG). Одна из предполагаемых причин этой гиперчувствительности связана с взаимодействием между иммунными клетками в периферических тканях и нейронами. Модели in vitro предоставили фундаментальные знания о том, как эти механизмы приводят к гиперчувствительности ноцицепторов. Тем не менее, модели in vitro сталкиваются с проблемой переноса эффективности на человека. Для решения этой проблемы была разработана физиологически и анатомически значимая модель in vitro для культивирования интактных ганглиев дорсальных корешков (DRGs) в трех изолированных компартментах в 48-луночном планшете. Первичные DRG добываются у взрослых крыс Sprague Dawley после гуманной эвтаназии. Лишние нервные корешки обрезают, а ДРГ нарезают на соответствующие размеры для культивирования. Затем DRG выращиваются в натуральных гидрогелях, что обеспечивает устойчивый рост во всех областях. Эта многокомпонентная система предлагает анатомически значимую изоляцию тел клеток DRG от нейритов, физиологически значимых типов клеток и механических свойств для изучения взаимодействий между нервными и иммунными клетками. Таким образом, эта культуральная платформа предоставляет ценный инструмент для исследования стратегий изоляции лечения, что в конечном итоге приводит к улучшению подхода к скринингу для прогнозирования боли.

Введение

Хроническая боль является основной причиной инвалидности и потери работы во всем мире¹. Хроническая боль затрагивает около 20% взрослого населения во всем мире и является значительным социальным и экономическим бременем², при этом общие затраты в Соединенных Штатах оцениваются от 560 до 635 миллиардов долларов США в год³.

Основной периферической особенностью пациентов с хронической болью является пониженный порог стимуляции нервов, что приводит к тому, что нервная система становится более чувствительной к раздражителям ^4,5

протокол

Сбор DRG был проведен в соответствии с требованиями Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Небраски-Линкольна. Для исследования использовались самки крыс Sprague Dawley в возрасте 12 недель (~250 г). Подробная информация о животных, реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Изготовление и сборка многокамерного устройства

1. Автоматизированное проектирование и 3D-печать многокамерного устройства
   ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство MC состоит из трех отсеков для выделения тел клеток DRG и нейритов (

Результаты

В настоящем протоколе описан метод сбора и культивирования DRG у взрослых крыс Sprague Dawley в многокамерном (MC) устройстве. Как показано на рисунке 1, DRG, собранный у взрослых крыс, был обрезан и разрезан на ~0,5 мм. Затем обрезанные и разрезанные DRG были помещены в гидроге.......

Обсуждение

В этом протоколе описан метод сбора взрослых DRG Sprague Dawley и их культивирования в 3D-натуральных гидрогелях. В отличие от этого метода, другие подходы к забору DRG у мышей и крыс предполагают изоляцию позвоночного столба. Иссеченный позвоночный столб разрезается вдвое, а спинной мозг удаляет.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#5 forceps	Fine Science Tools	11252-00	For trimming and cutting DRG
10x DMEM	MilliporeSigma	D2429
1x PBS (autoclaved)	Prepared in lab		7.3 - 7.5 pH
24 well plates	VWR	82050-892	To temporarily store harvested and cut DRGs
3 mL Syringe sterile, single use	BD	309657
48 well plates	Greiner Bio-One	677180
60 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875713A	To hold media for trimming and cutting
Aluminium foil	Fisherbrand	01-213-104
B27 Plus 50x	ThermoFisher	17504044	For DRG media
Collagen type I	Ibidi	50205
Curved cup Friedman Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16221-14	For dissection
Dumont #3 forceps	Fine Science Tools	11293-00	For dissection
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher	16000044	For DRG media
Form cure	Form Labs		curing agent
Form wash	Form Labs		To wash excess resins off MC
Glass bead sterilizer	Fisher Scientific	NC9531961
Glass vials (8 mL)	DWK Life Sciences (Wheaton)	224724
GlutaMax	ThermoFisher	35050-061	For DRG media
HEPES (1M)	Millipore Sigma	H0887
High temp V2 resin	FormLabs	FLHTAM02
Hyaluronic Acid Sodium Salt	MilliporeSigma	53747	Used to make MAHA
Irgacure	MilliporeSigma	410896
Laminin	R&D Systems	344600501
Large blunt-nose scissors	Militex	EG5-26	For dissection
Large forceps (serrated tips)	Militex	9538797	For dissection
Large sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14010-15	For dissection
Low Retention pipette tips	Fisher Scientific	02-707-017	For pipetting collagen and MAHA
Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)	Prepared in lab	N/A	85 - 115 % methacrylation
Nerve Growth Factor (NGF)	R&D Systems	556-NG-100	For DRG media
Neurobasal A Media	ThermoFisher	10888022	For DRG media
Parafilm	Bemis	PM996
Parafilm	Bemis	PM996
Penicillin/Streptomycin (PS)	EMD Millipore	516106	For DRG media
pH test strips	VWR International	BDH35309.606
Pipette tips (1000 µL)	USA Scientific	1111-2021
Preform 3.23.1 software	Formslab		To upload STL file
Rat	Charles River
Resin 3D printer	Form Labs	Form 3L	3D printing MC device
Small sharp-nosed scissors	Fine Science Tools	14094-11	For dissection
Sodium bicarbonate	MilliporeSigma	S6014
Straight cup rongeur	Fine Science Tools	16004-16	For dissection
Straight edge spring scissors	Fine Science Tools	15024-10	For dissection
Surgical Scaplel blade (No. 10)	Fisher Scientific	22-079-690
Syring filters, PES (0.22 µm)	Celltreat	229747
Tiny spring scissors	World Precision Instruments	14003	For trimming and cutting DRG
UV lamp	Analytik Jena US		To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)