Селекция функционального риса с помощью технологий редактирования генома

Резюме

Протокол описывает выведение устойчивых сортов крахмального риса с использованием технологий редактирования генома точным, эффективным и технически простым способом.

Аннотация

Традиционные подходы к селекции сельскохозяйственных культур, которые опираются преимущественно на трудоемкие и трудоемкие методы, такие как традиционная гибридизация и мутационная селекция, сталкиваются с проблемами эффективного внедрения целевых признаков и создания разнообразных популяций растений. С другой стороны, появление технологий редактирования генома привело к смене парадигмы, позволив точно и быстро манипулировать геномами растений для преднамеренного введения желаемых характеристик. Одним из наиболее распространенных инструментов редактирования является система CRISPR/Cas, которая используется исследователями для изучения важных биологических проблем. Тем не менее, точный и эффективный рабочий процесс редактирования генома не был четко определен в селекции сельскохозяйственных культур. В этом исследовании мы продемонстрировали весь процесс селекции сортов риса, обогащенных высоким уровнем резистентного крахмала (RS), функционального признака, который играет решающую роль в профилактике таких заболеваний, как диабет и ожирение. Рабочий процесс включал в себя несколько ключевых этапов, таких как выбор функционального гена SBEIIb , разработка однонаправляющей РНК (sgRNA), выбор подходящего вектора для редактирования генома, определение метода доставки вектора, проведение культивирования тканей растений, генотипирование мутаций и фенотипический анализ. Кроме того, были четко продемонстрированы временные рамки, необходимые для каждого этапа процесса. Этот протокол не только оптимизирует процесс селекции, но и повышает точность и эффективность внедрения признаков, тем самым ускоряя разработку функциональных сортов риса.

Введение

Традиционная селекция опирается на внесение признаков в сельскохозяйственные культуры или получение популяций растений с достаточной изменчивостью, что требует длительного полевого наблюдения ^1,2. В связи с ограничениями традиционной селекции была разработана технология редактирования генов, которая позволяет точно модифицировать геном сельскохозяйственных культур для получения желаемых признаков популяций растений³. Наиболее широко используемой системой редактирования генов у растений является CRISPR/Cas (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic....

протокол

Исследование проводилось в компании Bellagen Biotechnology Co. Ltd в Китае в соответствии с рекомендациями комитета по этике исследований на человеке. Перед началом участия протокол исследования был подробно разъяснен испытуемым, которые дали информированное согласие.

1. Проектирование sgRNA и строительного вектора (сроки 5-7 дней)

Примечание: Двоичный вектор был использован для выражения системы CRISPR/Cas-SF01²¹. Не менее 3 нуклеотидов (nt) не должны совпадать с потенциальным сайтом для sgRNA, не являющимся мишенью. Адаптер sgRNA должен до....

Результаты

В настоящем исследовании были продемонстрированы все процедуры селекции функционального риса с помощью редактирования генома для получения устойчивых устойчивых сортов крахмального риса. Мы интегрировали sgРНК, нацеленную на SBEIIb , в CRISPR/Cas-SF01 (дополнительны.......

Обсуждение

В процессе создания нокдаун-векторов на основе CRISPR/Cas-SF01 решающее значение имеет тщательный отбор однонаправляющих РНК (sgRNA). Это обуславливает необходимость использования последовательностей, которые демонстрируют высокую эффективность редактирования с минимальн?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 x Taq Plus Master Mix II	Vazyme Biotech Co.,Ltd	P213	Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid Solutio	Phyto Technology	D309
AAM medium	Shandong Tuopu Biol-engineering Co., Ltd	M9051C
BsaI-HF	New england biolabs	R3535	Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibiotics	Applygen	APC8250-5	Selection  medium, regeneration medium
Casaminoacid	BBI-Life SciencesCorporation	A603060-0500	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	DL1001	E. coli competent cells
D-Sorbitol	BBI-Life SciencesCorporation	A610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrate	Diamond	A100105-0500	CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent Cell	Weidi Biotechnology Co., Ltd.	AC1010	Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini Kit	Vazyme Biotech Co.,Ltd	REC01-100	Plasmid isolated
Hygromycin antibiotics	Yeasen	60224ES	co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibiotics	Yeasen	60206ES10	Selection agrobacterium
KOH	Macklin	P766798	CTAB buffer
L-Glutamine	Phyto Technology	G229	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-Proline	Phyto Technology	P698	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)	-	-	Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechine	MARUMASU	MHR1500A	To produce white rice
Murashige Skoog	Phyto Technology	M519	Root medium, regeneration medium
Myo-inositol	Phyto Technology	I703	Regeneration medium
NaCl	Macklin	S805275	For  YEP media
NB Basal Medium	Phyto Technology	N492	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone	Solarbio	LA8800	For  YEP media
Phytogel	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24793
Pot	Midea group Co.	MB-5E86	For cooking rice
Refrigerator	Haier	BCD-170	Storage the medium
Resistant Starch Assay Kit	Megazyme	K-RSTAR	Measurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibiotics	Sigma	R3501-250MG	Selection agrobacterium
Sodium hypochlorite solution	Macklin	S817439	For seed sterilization
Sucrose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	B21647	Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA Ligase	New england biolabs	M0202	Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitor	Medical Equipment & Supply Co., Ltd	Xuetang 582	Detection the blood glucose
Tris-HCL	Macklin	T766494	CTAB buffer
Yeast Agar	Solarbio	LA1370	For  YEP media
YEP media	-	-	Cultivation of Agrobacterium