Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол описывает выведение устойчивых сортов крахмального риса с использованием технологий редактирования генома точным, эффективным и технически простым способом.

Аннотация

Традиционные подходы к селекции сельскохозяйственных культур, которые опираются преимущественно на трудоемкие и трудоемкие методы, такие как традиционная гибридизация и мутационная селекция, сталкиваются с проблемами эффективного внедрения целевых признаков и создания разнообразных популяций растений. С другой стороны, появление технологий редактирования генома привело к смене парадигмы, позволив точно и быстро манипулировать геномами растений для преднамеренного введения желаемых характеристик. Одним из наиболее распространенных инструментов редактирования является система CRISPR/Cas, которая используется исследователями для изучения важных биологических проблем. Тем не менее, точный и эффективный рабочий процесс редактирования генома не был четко определен в селекции сельскохозяйственных культур. В этом исследовании мы продемонстрировали весь процесс селекции сортов риса, обогащенных высоким уровнем резистентного крахмала (RS), функционального признака, который играет решающую роль в профилактике таких заболеваний, как диабет и ожирение. Рабочий процесс включал в себя несколько ключевых этапов, таких как выбор функционального гена SBEIIb , разработка однонаправляющей РНК (sgRNA), выбор подходящего вектора для редактирования генома, определение метода доставки вектора, проведение культивирования тканей растений, генотипирование мутаций и фенотипический анализ. Кроме того, были четко продемонстрированы временные рамки, необходимые для каждого этапа процесса. Этот протокол не только оптимизирует процесс селекции, но и повышает точность и эффективность внедрения признаков, тем самым ускоряя разработку функциональных сортов риса.

Введение

Традиционная селекция опирается на внесение признаков в сельскохозяйственные культуры или получение популяций растений с достаточной изменчивостью, что требует длительного полевого наблюдения 1,2. В связи с ограничениями традиционной селекции была разработана технология редактирования генов, которая позволяет точно модифицировать геном сельскохозяйственных культур для получения желаемых признаков популяций растений3. Наиболее широко используемой системой редактирования генов у растений является CRISPR/Cas (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic....

протокол

Исследование проводилось в компании Bellagen Biotechnology Co. Ltd в Китае в соответствии с рекомендациями комитета по этике исследований на человеке. Перед началом участия протокол исследования был подробно разъяснен испытуемым, которые дали информированное согласие.

1. Проектирование sgRNA и строительного вектора (сроки 5-7 дней)

Примечание: Двоичный вектор был использован для выражения системы CRISPR/Cas-SF0121. Не менее 3 нуклеотидов (nt) не должны совпадать с потенциальным сайтом для sgRNA, не являющимся мишенью. Адаптер sgRNA должен до....

Результаты

В настоящем исследовании были продемонстрированы все процедуры селекции функционального риса с помощью редактирования генома для получения устойчивых устойчивых сортов крахмального риса. Мы интегрировали sgРНК, нацеленную на SBEIIb , в CRISPR/Cas-SF01 (дополнительны.......

Обсуждение

В процессе создания нокдаун-векторов на основе CRISPR/Cas-SF01 решающее значение имеет тщательный отбор однонаправляющих РНК (sgRNA). Это обуславливает необходимость использования последовательностей, которые демонстрируют высокую эффективность редактирования с минимальн?.......

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансированием от Biological Breeding-Major Projects (2023ZD04074).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2 x Taq Plus Master Mix IIVazyme Biotech Co.,LtdP213 Detecting Single Nucleotide Polymorphism (SNP) of genes
2,4-Dichlorophenoxyacetic (2,4-D) Acid SolutioPhyto TechnologyD309
AAM mediumShandong Tuopu Biol-engineering Co., LtdM9051C
BsaI-HFNew england biolabsR3535Bsa I enzyme digestion of the editing vector
Carbenicillin antibioticsApplygenAPC8250-5Selection  medium, regeneration medium
CasaminoacidBBI-Life SciencesCorporationA603060-0500Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
DH5α Chemically Competent CellWeidi Biotechnology Co., Ltd.DL1001E. coli competent cells
D-SorbitolBBI-Life SciencesCorporationA610491-0500
EDTA,disodium salt,dihydrateDiamondA100105-0500CTAB buffer
EHA105 Chemically Competent CellWeidi Biotechnology Co., Ltd.AC1010Agrobacterium competent cells
FastPure Plasmid Mini KitVazyme Biotech Co.,LtdREC01-100Plasmid isolated
Hygromycin antibioticsYeasen60224ESco-cultivation medium, selection medium,regeneration medium and root medium
Kanamycin antibioticsYeasen60206ES10Selection agrobacterium
KOHMacklinP766798CTAB buffer
L-GlutaminePhyto TechnologyG229Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
L-ProlinePhyto TechnologyP698Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Mautre dry rice seeds (Xiushui134)--Japonica varieties for breeding RS rice
Mill rice mechineMARUMASUMHR1500ATo produce white rice
Murashige SkoogPhyto TechnologyM519Root medium, regeneration medium
Myo-inositolPhyto TechnologyI703Regeneration medium
NaClMacklinS805275For  YEP media
NB Basal MediumPhyto TechnologyN492Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
Peptone SolarbioLA8800For  YEP media
PhytogelShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdS24793
Pot Midea group Co.MB-5E86For cooking rice
RefrigeratorHaierBCD-170Storage the medium
Resistant Starch Assay KitMegazymeK-RSTARMeasurement and analysis resistant starch
Rifampicin antibioticsSigmaR3501-250MGSelection agrobacterium
Sodium hypochlorite solutionMacklinS817439For seed sterilization
SucroseShanghai yuanye Bio-Technology Co., LtdB21647Callus induction medium, co-cultivation medium, selection medium,regeneration medium
T4 DNA LigaseNew england biolabsM0202Joining sgRNA to the CEISPRY/Cas-SF01 vector
The glucose monitorMedical Equipment & Supply Co., LtdXuetang 582Detection the blood glucose
Tris-HCLMacklinT766494CTAB buffer
Yeast AgarSolarbioLA1370For  YEP media
YEP media--Cultivation of Agrobacterium

Ссылки

  1. Huang, X., Huang, S., Han, B., Li, J. The integrated genomics of crop domestication and breeding. Cell. 185 (15), 2828-2839 (2022).
  2. Labroo, M. R., Studer, A. J., Rutkoski, J. E. Heterosis and hybrid crop breeding: A multidisciplina....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE215

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены