JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье мы представляем методологию краткой оценки уровня аутофагосомного маркера LC3-II во внеклеточных везикулах (ВВ) методом иммуноблоттинга. Анализ уровней LC3-II в ВВ, образовании аутолизосом и образовании омегасом позволяет предположить новую роль STX6 в высвобождении LC3-II-положительных ВВ при ингибировании слияния аутофагосом и лизосом.

Аннотация

(Макро)аутофагия представляет собой фундаментальный путь клеточной деградации. В этом процессе двухмембранные везикулы, известные как аутофагосомы, поглощают содержимое цитоплазмы, впоследствии сливаясь с лизосомами для деградации. Помимо канонической роли, гены, связанные с аутофагией, также модулируют секреторный путь, включающий высвобождение воспалительных молекул, факторов восстановления тканей и внеклеточных везикул (ВВ). Примечательно, что процесс распространения патологических белков между клетками, особенно при нейродегенеративных заболеваниях, поражающих головной и спинной мозг, подчеркивает важность понимания этого феномена. Недавние исследования показывают, что ДНК-связывающий белок 43 кДа (TDP-43) с трансактивным ответом, ключевой игрок в боковом амиотрофическом склерозе и лобно-височной долевой дегенерации, высвобождается аутофагическим зависимым образом через EV, обогащенные аутофагосомными маркерами микротрубочек-ассоциированными белками легкой цепи 1A/1B легкой цепи 3B-II (LC3-II), особенно когда ингибируется слияние аутофагосом и лизосомы.

Чтобы выяснить механизм, лежащий в основе формирования и высвобождения LC3-II-положительных ВВ, необходимо разработать доступный и воспроизводимый метод оценки как внутриклеточных, так и внеклеточных LC3-II-положительных везикул. В данном исследовании представлен подробный протокол оценки уровней LC3-II с помощью иммуноблоттинга в клеточных и EV-фракциях, полученных с помощью дифференциального центрифугирования. Бафиломицин А1 (Baf), ингибитор слияния аутофагосом и лизосом, служит положительным контролем для повышения уровня внутриклеточных и внеклеточных LC3-II-положительных везикул. Ген восприимчивости к опухолям 101 (TSG101) используется в качестве маркера для мультивезикулярных тельц. Применяя этот протокол, было продемонстрировано, что миРНК-опосредованный нокдаун синтаксина-6 (STX6), генетического фактора риска спорадической болезни Крейтцфельдта-Якоба, увеличивает уровни LC3-II во фракции EV клеток, обработанных Baf, не оказывая при этом существенного влияния на уровни TSG101. Эти данные свидетельствуют о том, что STX6 может негативно регулировать внеклеточное высвобождение LC3-II через ВВ, особенно в условиях, когда нарушается слияние аутофагосом и лизосом. В сочетании с установленными методами оценки аутофагии этот протокол дает ценную информацию о роли конкретных молекул в образовании и высвобождении LC3-II-положительных EV.

Введение

ДНК-связывающий белок 43 с трансактивационным ответом (TDP-43) представляет собой широко экспрессируемый гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин, участвующий в регуляции сплайсинга экзонов, транскрипции генов и стабильности мРНК, что жизненно важно для выживания клеток 1,2. При нейродегенеративных состояниях, таких как боковой амиотрофический склероз (БАС) и лобно-височная долевая дегенерация (FTLD), ядерный белок TDP-43 аномально накапливается в цитоплазме. Этот сдвиг приводит к потере функции TDP-43 в ядре и токсическому усилению функции в цитоплазме. Патологическое накопление TDP-43 начинается в определенных областях головного и спинного мозга, распространяясь по этим областям прионоподобным образом, процесс, тесно связанный с прогрессированием заболевания3. Однако точный механизм, с помощью которого патология TDP-43 распространяется по головному и спинному мозгу, остается неизвестным.

TDP-43 секретируется через внеклеточные везикулы (ВВ), а повышенные уровни TDP-43 обнаруживаются в плазме и спинномозговой жидкости (СМЖ) пациентов с БАС и FTLD-TDP 4,5,6. СМЖ у пациентов с диагнозом БАС и ЛЛЗ индуцирует внутриклеточную неправильную локализацию и агрегацию эндогенного TDP-43 в клетках глиомы человека7. Таким образом, TDP-43, высвобождаемый внеклеточно через ВВ, может опосредуть межклеточное распространение патологии TDP-43 от клетки к клетке.

Аутофагия — это хорошо сохранившийся механизм клеточной деградации, который включает в себя заключение нежелательных веществ в двухмембранные везикулы, известные как аутофагосомы, которые помечены LC3. Эти аутофагосомы сливаются с лизосомно-ассоциированными мембранным белком 1 (LAMP1)-положительными лизосомами с образованием аутолизосом (LC3+/LAMP1+), что приводит к деградации их содержимого8. Гистологические анализы свидетельствуют о том, что аутофагосомы, поглощающие включения, накапливаются в нейронах пациентов со спорадическим БАС9. Некоторые причинные гены семейного БАС и FTLD-TDP связаны с регуляцией аутофагии 10,11,12. Эти данные свидетельствуют о том, что аутофагия подавляется у пациентов с БАС и FTLD-TDP.

Предыдущее исследование показало, что TDP-43 секретируется через ВВ, положительные на маркер аутофагосом LC3-II, когда ингибируется слияние аутофагосом и лизосомы. Нарушение регуляции пути аутофагии-лизосомы может привести не только к внутриклеточному накоплению TDP-43, но и к внеклеточному высвобождению TDP-43 через EVs14. Однако остается неизвестным, каким образом высвобождаются LC3-II положительные ВВ и насколько это значимо в распространении патологии TDP-43.

ВВ классифицируются на большие ВВ (от 100 до 1000 нм в диаметре), которые образуются в результате почкования клеточной поверхности, и малые ВВ (от 50 до 150 нм в диаметре), которые образуются в результате почкования эндосомальных мембран к внутренней части эндосомы (известных как экзосомы) и аппарата Гольджи. Чтобы раздельно собирать большие и малые электромобили, мы выполняем последовательное центрифугирование и собираем гранулы методом центрифугирования в концентрации 20 000 × г и 110 000 × г соответственно. Фракция P1 EV (20 000 × г гранул) подготавливается для сбора крупных EV, а фракция P2 EV (110 000 × г гранул) — для сбора мелких EV15. Методика оценки уровней LC3-II в больших и малых ВВ, полученных в результате последовательного центрифугирования методом иммуноблоттинга, стабильна и воспроизводима16. В дополнение к анализу уровней LC3-II в ВВ, анализ образования аутолизосом и омегасом улучшает понимание того, как нарушение регуляции аутофагии приводит к высвобождению LC3-II положительных ВВ. В настоящем исследовании показана подавляющая роль синтаксина 6 (STX6), белка SNARE, который способствует движению транспортных везикул к мембранам-мишеням17, в высвобождении LC3-II положительных EV при ингибировании слияния аутофагосом и лизосом.

протокол

1. Получение клеточной, P1 и P2 EV фракции из культивируемой среды клеток HeLa

  1. Получение фракции P1 и P2 EV из культивируемой среды клеток HeLa
    1. День 1
      1. Подсчитайте клетки с помощью клеточного счетчика и затравите 1 × 106 клеток на 6-сантиметровой пластине, содержащей питательную среду, состоящую из DMEM High Glucose, 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
    2. День 2 (по желанию)
      1. Приготовьте 20 мкМ раствор миРНК.
      2. Смешайте 100 мкл восстановленной сывороточной среды и 3 мкл миРНК в пробирке с низким удержанием для приготовления раствора А.
      3. Смешайте 100 μл восстановленной сывороточной среды и 5 μл реагента для трансфекции в пробирке с низким удержанием для приготовления раствора В.
      4. Смешайте раствор А и раствор В, затем инкубируйте смесь при комнатной температуре (RT) в течение 5 минут.
      5. Добавьте смесь растворов А и В в среду, используемую для культивирования клеток HeLa. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
    3. День 3
      1. Промойте клетки PBS и подвергните их воздействию 500 μL 0,25% трипсина и 1 mM раствора ЭДТА при 37 °C с 5% CO2 и контролируемой влажностью в течение 5 минут.
      2. Добавьте к клеткам 2,5 мл питательной среды и используйте переводную пипетку Пастера с прикрепленным наконечником пипетки объемом 200 мкл для приготовления суспензии для одиночных клеток.
      3. Посчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек и засейте 1 × 106 клеток на пластине 10 см. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
        Необходимо подготовить не менее 1 × 106 клеток для сбора ВВ из питательной среды, необходимой для иммуноблоттингового анализа.
    4. День 4
      1. Готовят питательную среду (см. шаг 1.1.1.1), содержащую либо носитель (ДМСО), либо 100 нМ бафиломицина А1 (Baf).
      2. Подвергнуть клетки воздействию среды, содержащей либо носитель, либо 100 нМ Baf, и инкубировать их при 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажностью в течение 24 часов.
    5. День 5
      1. Соберите всю питательную среду с 10-сантиметровой пластины, переложите ее в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при температуре 3000 × г в течение 10 минут при 4 °C для удаления клеточного мусора.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные ячейки в 10-сантиметровой пластине будут использоваться в разделе 1.2.1.
      2. Для выделения фракции P1 EV надосадочную жидкость после центрифугирования при 3 000 × г перенесите в центрифужную пробирку, а затем центрифугируйте при 20 000 × г при 4 °C в течение 1 ч.
      3. Для выделения фракции P2 EV надосадочную жидкость после центрифугирования при 20 000 × г переносят в ультрацентрифужную пробирку, а затем центрифугируют при 110 000 × г при 4 °C в течение 1 ч.
      4. После вытирания излишков влаги внутри пробирки лабораторной салфеткой повторно суспендируйте оставшиеся гранулы в центрифужной пробирке в 50 мкл 2x буфера для проб [2,5% SDS, 125 мМ буфера Tris-HCl (pH 6,8), 30% глицерина, 10% 2-меркаптоэтанола, 0,4% бромофенола синего] для приготовления фракции P1 EV.
      5. Удалите надосадочную жидкость путем декантации, сотрите лишнюю влагу внутри пробирки с помощью лабораторной салфетки, а затем повторно суспендируйте оставшиеся гранулы в ультрацентрифугирующей пробирке в 50 мкл 2x буфера для образцов для приготовления фракции P2 EV.
      6. Инкубируйте фракции P1 и P2 EV при 100 °C на тепловом блоке в течение 10 минут.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Не встряхивайте пробирки после центрифугирования при концентрации 20 000 × г и 110 000 × г , чтобы случайно не выбросить оставшиеся гранулы. Наклонив трубку для переноса надосадочной жидкости, сохраняйте положение трубки, чтобы предотвратить повторное погружение гранулы в оставшуюся надосадочную жидкость.
  2. Приготовление клеточной фракции из культивируемых клеток HeLa
    1. День 5
      1. После переноса питательной среды из 10-сантиметрового планшета в пробирку объемом 15 мл промойте клетки в 10-сантиметровой чашке PBS и подвергните их воздействию 2 мл 0,25% трипсина и 1 мМ раствора ЭДТА при 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажностью в течение 5 мин.
      2. Добавьте к клеткам 8 мл питательной среды, затем с помощью пипетки Пастера с наконечником пипетки объемом 200 мкл пипетки пипетки и приготовьте суспензию для одиночных клеток.
      3. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 1000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
      4. Удалите надосадочную жидкость с помощью аспиратора, добавьте PBS в клеточную гранулу, а затем центрифугируйте при 1000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
      5. Удалите PBS с помощью аспиратора и обработайте клеточную гранулу ультразвуком в 1 мл буфера A68 [10 мМ буфера Tris-HCl, pH 7,5, 0,8 M NaCl, 1 мМ этиленгликоля бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N,N-тетрауксусной кислоты (EGTA)], содержащей 1% саркозил.
      6. Измерьте концентрацию белка в клеточном лизате с помощью набора для анализа белка BCA.
      7. Смешайте 300 мкл клеточного лизата со 100 мкл 4x буфера для образцов и инкубируйте смесь при 100 °C на тепловом блоке в течение 10 мин для приготовления клеточной фракции.

2. Иммуноблоттинг-анализ

  1. Разделите эквивалентные количества белков в образцах с помощью SDS-PAGE18.
  2. Перенесите разделенные белки на мембраны из поливинилидендифторида (PVDF).
  3. После переноса заблокируйте мембраны блокирующим агентом на 20 минут.
  4. Инкубируйте заблокированную мембрану в течение ночи с указанным первичным антителом в трис-буфере, содержащем 10% (v/v) сыворотки теленка, в режиме ЛТ.
  5. Промывайте мембрану Трис-буфером в течение 5 с, а затем инкубируйте ее с биотин-конъюгированным вторичным антителом при ЛТ в течение 2 ч.
  6. Промывайте мембрану Трис-буфером в течение 5 с, а затем инкубируйте ее с Трис-буфером, содержащим 0,4% (v/v) растворы A и раствор B из набора при RT в течение 1 ч.
  7. Промойте мембрану PBS, а затем инкубируйте ее с PBS, содержащим 0,04% (w/v) диаминобензидина, 0,8% (w/v) NiCl2·6H2O и 0,3% (v/v) H2O2 для колориметрического обнаружения полос.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для детектирования сигналов также приемлем метод хемилюминесценции.
  8. Оцифровать изображение мембраны с помощью сканера и подвергнуть его денситометрическому анализу с помощью Фиджи.
    1. Откройте оцифрованное изображение с помощью Fiji и преобразуйте цветное изображение RGB в 8-битное изображение, нажав Изображение | Тип | 8-битный.
    2. Нажмите на инструмент прямоугольника и отрегулируйте размер прямоугольника, перетащив его, чтобы окружить полосы. Определите канал для анализа, нажав кнопку Анализ | Гели | Выберите Первая полоса.
    3. Расположите прямоугольник на втором и последующих каналах и определите каналы для анализа, нажав кнопку Анализ | Гели | Выберите «Следующая полоса».
    4. После распознавания конечного канала измерьте денситометрию поперек прямоугольника, нажав кнопку Анализ | Гели | Сюжетные дорожки.
    5. Окружите сигнальную область полосы прямой линией, щелкните инструмент «палочка» и щелкните в этой области, чтобы рассчитать интенсивность сигнала полосы.

3. Анализ количества аутофагосом и аутолизосом

  1. День 1
    1. Подсчитайте количество клеток HeLa с помощью счетчика клеток и засейте 1 ×10 5 клеток HeLa, экспрессирующих LAMP1-GFP и mCherry-LC3, на чашке диаметром 3,5 см. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
  2. День 2 (по желанию)
    1. Выполняйте действия, описанные в разделе 1.1.2, в посуде диаметром 3,5 см.
  3. День 3
    1. Выбросьте питательную среду из посуды диаметром 3,5 см.
    2. Промойте камеры PBS, подвергните их воздействию 400 μL 0,25% трипсина и 1 mM раствора ЭДТА и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажностью в течение 5 минут.
    3. Добавьте к клеткам 1,6 мл питательной среды, и пипетируйте их с помощью пипетки Пастера для переноса для приготовления одноклеточной суспензии.
    4. Подсчитайте количество ячеек с помощью счетчика ячеек и засейте 1 × 104 ячейки на 8-камерный покровный лист. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Две лунки камерного покровного стекла подготавливаются для контрольных и монтажных камер STX6, соответственно, после обработки ДМСО или Baf, как описано в разделе 3.4.2.
  4. День 4
    1. Приготовьте питательную среду без фенола красного (DMEM без фенола красного, 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина), содержащую либо носитель (ДМСО), либо 100 нМ Baf, растворенный в ДМСО.
    2. Заменяйте питательную среду средой без фенольного красного, содержащей либо носитель, либо 100 нМ Baf, и инкубируйте в течение 4 ч.
      Примечание: Чтобы оценить влияние Baf на количество аутофагосом и аутолизосом, подготовьте клетки, обработанные носителем, в качестве контроля.
    3. Окрашивание ядер 0,33 мкг/мл Hoechst 33342 в течение 30 мин перед наблюдением.
    4. Проведите визуализацию живых клеток с помощью объектива с 60-кратным увеличением на конфокальном лазерном микроскопе и сделайте десять разных кадров.
      1. Откройте объединенное изображение RGB на Фиджи и разделите его на соответствующие красный, зеленый и синий компоненты изображения, нажав на Изображение | Цвет | Разделение каналов.
      2. Установите постоянный порог для красного и зеленого сигналов на каждом изображении, нажав Изображение | Настройка | Пороговое значение для каждого эксперимента.
      3. Подсчитайте количество областей, положительных для красных или зеленых сигналов, нажав «Анализировать» | Анализируйте частицы. Установите флажок «Суммировать », затем нажмите «ОК». Запишите значения из подсчета , чтобы определить везикулы, связанные с аутофагосомами и лизосомами.
      4. Чтобы наложить зеленое изображение на красное изображение, установите режим передачи в положение И , нажав Редактировать | Управление вставкой. Скопируйте зеленое изображение, а затем вставьте его на красное изображение, чтобы объединить их, выделив области, которые положительно влияют как на красный, так и на зеленый сигналы.
      5. Чтобы определить числа автолизосом, подсчитайте количество областей, положительных как для красных, так и для зеленых сигналов, нажав «Анализировать» | Анализируйте частицы. Установите флажок Суммировать , нажмите OK и запишите значения в разделе Количество , чтобы определить везикулы, связанные с аутофагосомами и лизосомами.
    5. Разделите общее количество аутолизосом и аутофагосом на общее количество клеток, чтобы рассчитать количество аутолизосом и аутофагосом на клетку.
      Примечание: Насчитайте, по крайней мере, 35 клеток в каждом из трех независимых экспериментов.

4. Анализ на образование омегасом

  1. День 1
    1. Подсчитайте количество клеток HeLa с помощью счетчика клеток и высадите 1 × 105 клеток на чашку диаметром 3,5 см. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
  2. День 2 (по желанию)
    1. Выполните действия, описанные в разделе 1.1.2.
  3. День 3
    1. Приготовьте одноклеточную суспензию, как описано в шагах 3.3.1-3.3.2.
    2. Посчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек, и высадите 1 ×10 5 клеток на чашку диаметром 3,5 см. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
  4. День 4
    1. Смешайте 1 г pEGFP-C1-hAtg13, 3 мкл реагента для трансфекции ДНК и 100 мкл восстановленной сывороточной среды в пробирке с низким уровнем удерживания. Выдержите смесь в течение 20 минут, затем добавьте ее в культивированную среду.
    2. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
  5. День 5
    1. Трипсинизируйте клетки, как описано в шагах 3.3.1-3.3.2.
    2. Добавьте в клетки 2,5 мл питательной среды. Пипеткой смеси с помощью переводной пипетки Пастера для приготовления одноклеточной суспензии.
    3. Подсчитайте ячейки с помощью счетчика ячеек и засейте 1 ×10 4 ячейки на 8-камерном покровном листе. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C с 5%CO2 и контролируемой влажности в течение 24 часов.
  6. День 6
    1. Выполните шаги 3.4.1-3.4.4 для проведения визуализации живых клеток из шага 4.5.3 с использованием конфокального лазерного микроскопа. Захватите десять разных кадров изображений.
      1. Выполните шаги 3.4.4.1-3.4.4.3, чтобы разделить объединенные изображения RGB на соответствующие красные, зеленые и синие компоненты, установить постоянный порог для зеленых сигналов в каждом изображении и определить интенсивность сигнала GFP. Запишите значения из раздела Total Area (Общая площадь ), чтобы определить интенсивность сигнала GFP-ATG13.
      2. Разделите общую интенсивность сигнала на количество исследованных клеток, чтобы рассчитать интенсивность сигнала на ячейку.
        Примечание: Насчитайте, по крайней мере, 34 клетки в каждом из трех независимых экспериментов.

Результаты

Как было показано в предыдущих исследованиях, обработка Baf повышала уровни TSG101 (P1: P < 0,01, P2: P = 0,012, что определяется по двустороннему ANOVA в EZR19) и LC3-II (P1: P < 0,01, P2: P < 0,01, как определяется по двустороннему ANOVA в EZR19) в фракции, богатой EV. Примечательно, чт...

Обсуждение

Исследование иммуноблоттинга выявило уровни LC3-II и TSG101 в клеточной фракции, богатой микровезикулами фракцией P1 EV и богатой экзосомами фракцией P2 EV. Визуализация живых клеток была использована для изучения аутофагосом, аутолизосом и омегасом, что дало представление о ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием данной статьи.

Благодарности

Эта работа была поддержана финансированием Y.T. со стороны Японского общества содействия науке KAKENHI [Grant Number 23K06837] (Токио, Япония) и Takeda Science Foundation (Осака, Япония). Авторы выражают признательность доктору Дэвиду С. Рубинштейну (David C. Rubinsztein) (Кембриджский институт медицинских исследований, Кембридж, Великобритания) за поставку клеток HeLa.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25 % Trypsin EDTAFujifilm Wako201-16945
10 cm DishThermo Fisher Scientific150464
15 mL TubeThermo Fisher Scientific339650
200 μL Pipette TipNippon GeneticsFG-301pipetting
2-MercaptoethanolNacalai Tesque21417-52a material for
sample buffer solution
3,3'-Diaminobenzidine TetrahydrochlorideNacalai Tesque11009-41a material for DAB solution
3.5 cm Dish Thermo Fisher Scientific150460
6 cm Dish TrueLineTR4001
Aluminium Block Thermostatic Baths (dry thermobaths)EYELA273860
AspiratorSANSYOSAP-102inhaling solution
Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Bafilomycin A1AdipogenBVT-0252
Biotin-conjugated Goat Anti-rabbit IgG AntibodyVector Laboratories BA-10002nd antibody for immunoblotting
Biotin-conjugated Horse Antimouse IgG AntibodyVector Laboratories BA-20002nd antibody for immunoblotting
Blocking OneNacalai Tesque03953-95a material for immunoblotting
Bromophenol BlueNacalai Tesque05808-61a material for
sample buffer solution
Calf SerumcytivaSH30073.03
CanoScan LiDE 220CanonCSLIDE220Scanner
Centrifuge 5702 Reppendolf5703000039
Counting Slides Dual ChamberBio-Rad1450015Jcell counting
Digital Sonifier 450BRANSON
Dimethyl Sulfoxidenacalai tasque09659-14vehicle
DMEM High GlucoseNacalai Tesque08458-45culture medium
DMEM without Phenol RedNacalai Tesque08489-45culture medium
EGTADojindo 348-01311a material for A68 solution
ExcelMicrosoftversion 16.16.27satistical analysis
EZRReference No. 24version 1.68satistical analysis
FBSSigma173012Culture medium
FijiNIHImage analysis tool
GlycerolNacalai Tesque09886-05a material for
sample buffer solution
Hoehst33342Dojindo H342
Hydrogen PeroxideFujifilm Wako080-0186a material for DAB solution
Kimwipe S-200NIPPON PAPER CRECIA62011cleaning wipe
Low Retention TubeNippon GeneticsFG-MCT015CLBsiRNA and DNA transfection
LSM780 Confocal Laser MicroscopeCarl Zeiss
Monoclonal Mouse Anti-LC3 AntibodyMBLM186-31st antibody for immunoblotting
Nickel(II) Chloride HexahydrateFujifilm Wako149-01041a material for DAB solution
N-Lauroylsarcosine Sodium SaltNacalai Tesque20117-12
Optima XE-90 UltracentrifugeBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985-070siRNA and DNA transfection
pEGFP-C1-hAtg13Addgene22875
Penicillin/StreptomycinNacalai Tesque26253-84Culture medium
Pierce BCA Protein Assay KitsThermo Fisher Scientific23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNA AntibodyBioAcademia70-0801st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 AntibodyProteinTech10841-1-AP1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 AntibodyProteinTech28283-1-AP1st antibody for immunoblotting
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 AntibodyProteinTech20986-1-AP1st antibody for immunoblotting
Polyvinylidene Difluoride MembraneMillioreIPVH00010a material for immunoblotting
RR development core teamversion 4.4.1satistical analysis
RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778siRNA transfection reagent
siRNA STX6Thermo Fisher ScientificHSS115604siRNA for transfection
Sodium ChlorideNacalai Tesque31320-05a material for Tris
buffer and A68 solution
Sodium Dodecyl SulfateFujifilm Wako192-13981a material for
sample buffer solution
SPARK Microplate ReaderTECAN
Stealth RNAi Negative Control Duplexes, Med GCThermo Fisher Scientific12935300siRNA transfection
SucroseFujifilm Wako193-00025a material for A68 solution
TC20 Automated Cell Counter with Thermal PrinterBio-Rad1450109J1cell counting
ThermobathTOKYO RIKAKIKAIMG-3100incubation
TransIT-293Mirus BioMIR 2700DNA transfection reagent
TransIT-LT1Mirus BioMIR2300DNA transfection reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneNacalai Tesque35406-75a material for Tris buffer, sample buffer and A68 solution
Trypan Blue Dye 0.40%Bio-Rad1450021cell counting
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm Beckman Coulter361706collecting for the P1 EV fraction
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mmBeckman Coulter344059collecting for the P2 EV fraction
Vectastain ABC Standard KitVector Laboratories PK-4000immunoblotting
Wash BottleAs One1-4640-02washing membrane
μ-Slide 8 Well Highibidi80806

Ссылки

  1. Tanaka, Y., Hasegawa, M. Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43. Prion. 10 (4), 283-289 (2016).
  2. Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. The era of cryptic exons: Implications for als-ftd. Mol Neurodegener. 18 (1), 16 (2023).
  3. Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy. Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).
  4. Chatterjee, M., et al. Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als. Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).
  5. Kasai, T., et al. Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als. Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).
  6. Iguchi, Y., et al. Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43. Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).
  7. Ding, X., et al. Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure. Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).
  8. Mizushima, N., Levine, B. Autophagy in human diseases. N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).
  9. Sasaki, S. Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).
  10. Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis. Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).
  11. Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).
  12. Tanaka, Y., et al. Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice. Acta Neuropathol Commun. 2, 78 (2014).
  13. Tanaka, Y., et al. Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43. J Biol Chem. 299 (11), 105272 (2023).
  14. Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy. Autophagy Rep. 3 (1), (2024).
  15. Ratajczak, M., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  16. Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux. Biochem Biophys Rep. 38, 101705 (2024).
  17. Dingjan, I., et al. Endosomal and phagosomal snares. Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).
  18. Tanaka, Y., et al. Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes. Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).
  19. Kanda, Y. Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics. Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).
  20. Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. Cell cycle-dependent variations in protein concentration. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).
  21. Plate, L., et al. Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation. eLife. 5, e15550 (2016).
  22. Mizushima, N. The role of mammalian autophagy in protein metabolism. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).
  23. Nanayakkara, R., et al. Autophagic lysosome reformation in health and disease. Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).
  24. Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes. Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

212LC3 IISTX6

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены