АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает разработку мышиной модели с гиперчувствительностью к кашлю, которая может служить идеальной моделью для изучения механизмов хронического кашля.

Аннотация

Кашель является одним из наиболее распространенных симптомов многих респираторных заболеваний. Хронический кашель существенно влияет на качество жизни и налагает значительное экономическое бремя. Повышенная чувствительность к кашлю является патофизиологическим признаком хронического кашля. Было замечено, что гиперчувствительность к кашлю связана с воспалением дыхательных путей, ремоделированием сенсорных нервов дыхательных путей и изменениями в центральной нервной системе. Тем не менее, точные молекулярные механизмы остаются неясными и требуют дальнейшего разъяснения с использованием подходящих животных моделей. В предыдущих исследованиях в качестве моделей для изучения кашля использовались морские свинки, но эти модели имеют ряд экспериментальных ограничений, включая высокую стоимость, отсутствие трансгенных инструментов и нехватку коммерческих реагентов. Кроме того, морские свинки обычно демонстрируют плохую переносимость окружающей среды и высокую смертность при воздействии раздражителей. В отличие от них, мыши меньше, проще в уходе, более экономичны и поддаются генетическим манипуляциям, что делает их более подходящими для механистических исследований. В этом исследовании мы создали мышиную модель с гиперчувствительностью к кашлю за счет непрерывного вдыхания лимонной кислоты (КА). Эта модель проста в использовании и дает воспроизводимые результаты, что делает ее ценным инструментом для дальнейших исследований механизмов и потенциальных новых методов лечения хронического кашля.

Введение

Кашель является важнейшим защитным рефлексом, который помогает выводить дыхательные выделения или инородные вещества из дыхательных путей. Тем не менее, это также один из наиболее распространенных симптомов многих респираторных заболеваний, часто побуждающий пациентов обращатьсяза медицинской помощью. Хронический кашель, определяемый как постоянный кашель, продолжающийся более 8 недель у взрослых, значительно влияет на качество жизни, вызывая такие проблемы, как недержание, бессонница, рефлюкс и другие неприятные ощущения, а также значительное экономическое бремя 2,3,4. Широко распространено мнение, что повышенная чувствительность к кашлю является патофизиологическим признаком хронического кашля, при котором низкий уровень термических, механических и химических раздражителей может вызвать кашель. Гиперчувствительность к кашлю связана с воспалением дыхательных путей6, ремоделированием чувствительных нервов дыхательных путей 7 и изменениями в центральной нервной системе8, хотя точные молекулярные механизмы остаются неясными и требуют дальнейшего уточнения с помощью подходящих животных моделей.

Различные животные, в том числе морские свинки, кошки, кролики, собаки и свиньи, использовались для изучения механизмов кашля. Морские свинки традиционно признаны наиболее подходящей моделью для изучения механизмов кашля и эффективности противокашлевых препаратов 9,10,11,12. Тем не менее, эти модели имеют несколько экспериментальных ограничений, в том числе высокую стоимость, нехватку трансгенных инструментов и дефицит коммерческих реагентов. Кроме того, морские свинки часто демонстрируют плохую переносимость окружающей среды и высокую смертность при воздействии раздражителей. В отличие от них, мыши меньше, проще в уходе, более экономичны и поддаются генетическим манипуляциям, что делает их более подходящими для механистических исследований. Предыдущие исследования моделей кашля в основном были сосредоточены на кашле, вызванном воспалением дыхательных путей, в основном используемом для оценки эффективности противокашлевых препаратов и периферических механизмов13,14. В настоящее время не хватает животных моделей гиперчувствительности к кашлю.

В ответ на это мы представляем метод создания мышиной модели гиперчувствительности к кашлю путем непрерывного вдыхания лимонной кислоты (КА). Эта модель проще, легче в построении и более осуществима по сравнению с другими животными моделями.

протокол

Все процедуры экспериментов на животных были одобрены Комитетом по этике лабораторных животных Первой аффилированной больницы Медицинского университета Гуанчжоу (20230656). В данном исследовании использовались взрослые самцы мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель и массой 20-25 г без специфических патогенов. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Приготовление химических реагентов

  1. Приготовление раствора лимонной кислоты (ЦА)
    1. Для оценки кашля приготовьте 0,4 М раствор, растворив 3,84 г порошка лимонной кислоты в обычном физиологическом растворе до конечного объема 50 мл.
    2. Для лечения животных готовят 0,1 М раствор, растворяя 9,6 г порошка лимонной кислоты в обычном физрастворе до конечного объема 500 мл.
  2. Приготовление раствора капсаицина
    1. Растворите 30,5 мг порошка капсаицина в PBS, содержащем 10% этанола и 10% Tween-80, чтобы получить 10 мМ исходный раствор.
    2. Разведите исходный раствор в соотношении 1:100 в обычном физрастворе до получения рабочего раствора с концентрацией 100 мкм.
  3. Приготовление раствора метахолина
    1. Растворите 100 мг порошка метахолина в PBS до конечного объема 2 мл до получения раствора 50 мг/мл.
    2. Разбавляют этот раствор PBS до получения концентраций 25 мг/мл, 12,5 мг/мл, 6,25 мг/мл и 3,125 мг/мл.

2. Подготовка животных

  1. Жилищные условия
    1. Домашние мыши в клетках со свободным доступом к пище и воде, содержании при температуре 22 ± 1 °C со стандартным 12-часовым циклом свет/темнота. Экспериментальные манипуляции проводили через 1 неделю после акклиматизации к кормовой среде.
  2. Акклиматизация
    1. Дайте мышам акклиматизироваться к кормовой среде за 1 неделю до проведения экспериментальных манипуляций.

3. Разработка модели

  1. Групповое назначение
    1. Случайным образом разделите мышей на модельную группу и контрольную группу, по 8 мышей в каждой группе.
  2. Настройка экспозиции
    1. Поместите мышей в две независимые камеры (как показано на рисунке 1), каждая из которых подключена к ультразвуковому небулайзеру.
    2. Подвергайте модельную группу воздействию аэрозоля 0,1 М лимонной кислоты (СА), а контрольную группу – 0,9% аэрозолю физиологического раствора (NS) со скоростью распыления 3 мл/мин в течение 2 ч в день в течение 2 недель (как показано на рисунке 2). Возвращайте мышей в клетки после каждого воздействия.
  3. Оценка чувствительности к кашлю
    1. После последнего контакта оцените чувствительность к кашлю путем оценки рефлекторного кашля (при использовании NS, CA (0,4 M) и капсаицина (100 μM)) и спонтанного кашля (без каких-либо проблем).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для мониторинга динамических изменений чувствительности к кашлю во время разработки модели оценивайте чувствительность к кашлю в дни 0, 3, 7 и 10 с помощью провокации CA (0,4 M).

4. Оценка чувствительности к кашлю

  1. Подготовка инструмента
    1. Используйте неинвазивную систему плетизмографии всего тела (WBP) для измерения чувствительности к кашлю. Подключите камеры, преобразователи потока, смещение потока и другие компоненты в соответствии с инструкцией по применению (см. Таблицу материалов).
    2. Выполните процесс калибровки, чтобы обеспечить точность измерений, нажав кнопку «Калибровать ». На экране состояния отобразится ход выполнения, и как только строка состояния достигнет 100%, калибровка будет завершена.
  2. Обнаружение кашля
    1. Создайте исследование кашля для мышей и настройте параметры на 1 минуту акклиматизации, 10 минут времени ответа и 10 минут доставки химического раствора.
    2. Поместите находящихся в сознании мышей в отдельные камеры, убедившись, что в каждой камере будет только одна мышь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед закрытием крышки убедитесь, что мышь полностью находится внутри камеры, чтобы не повредить ее хвост и пальцы.
    3. Добавьте в небулайзер 1 мл химических растворов (NS, CA или капсаицина).
      Примечание: Количество кашлевых событий, каждая из которых состоит из трех фаз: вдоха, компрессии и экспульсивной15 (как показано на рисунке 3), будет зарегистрировано после начала исследования. Через 10 минут записи обнаружение кашля будет завершено. Очистите камеру после обнаружения каждого животного, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

5. Измерение гиперреактивности дыхательных путей (AHR)

  1. Подготовка инструмента
    1. Подготовьте инструменты, как описано в шаге 4.1.
  2. Измерение AHR
    1. Создание исследования «доза-реакция» для мышей, настроив типы измерений, параметры и последовательность задач: 1 мин на акклиматизацию, 30 с на доставку раствора метахолина, 3 мин на время реакции и 1 мин на восстановление.
    2. Поместите находящихся в сознании мышей в отдельные камеры, убедившись, что в каждой камере будет только одна мышь.
    3. Добавьте 50 μL химических растворов (PBS или метахолина) в небулайзер и начните исследование.
    4. Запишите значение Пеня, индикатора бронхоконстрикции, в ответ на различные концентрации метахолина (0 мг/мл, 3,125 мг/мл, 6,25 мг/мл, 12,5 мг/мл, 25 мг/мл, 50 мг/мл).

6. Сбор бронхоальвеолярного лаважа

  1. Жертва
    1. Умерните мышей с помощью гиперанестезии пентобарбиталом натрия (50 мг/кг) путем внутрибрюшинной инъекции (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
  2. Забор образцов
    1. Соберите кровь из орбитального синуса мыши в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, затем поместите пробирку на лед. Центрифугируйте кровь при 3000 х г в течение 10 минут при 4°C. С помощью пипетки соберите надосадочную жидкость, выделите ее и храните при температуре -80 °C.
    2. Соберите жидкость бронхоальвеолярного лаважа (BALF), открыв грудную клетку, чтобы обнажить трахею, введя иглу 22 г в трахею, затем трижды промыв 0,5 мл предварительно охлажденного PBS и собрав жидкость.
    3. После сбора центрифугируйте BALF при 500 x g в течение 10 минут при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость, накройте ее и храните при температуре -80 °C. Повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл PBS и подготовьте мазки клеток для дальнейшего анализа.
    4. Соберите легочные ткани, открыв грудную клетку, чтобы обнажить легкие, удалив легочные ткани и поместив их в криогенные флаконы. Храните флаконы при температуре -80 °C для будущих исследований.

7. Количественная ОТ-ПЦР

  1. Извлечь общую РНК из легочной ткани с помощью реагента TRIzol. Выполняйте синтез кДНК с помощью набора для синтеза кДНК первой цепи, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов).
  2. Проводите ПЦР в системе количественного обнаружения ПЦР в режиме реального времени с использованием зеленой флуоресценции SYBR. Нормализовать количественную оценку относительной экспрессии мРНК SP и CGRP в соответствии с экспрессией β-актина9.

8. Статистический анализ

  1. Представьте данные в виде среднего ± SEM. Используйте t-критерий для сравнения данных между двумя группами, считая P < 0,05 статистически значимым. Проводите все статистические анализы с помощью статистического и графического программного обеспечения.

Результаты

Как показано на рисунке 4А, чувствительность к кашлю в модельной группе (группа КА) значительно увеличилась после 1 недели воздействия по сравнению с контрольной группой (группа НС), и эта повышенная чувствительность сохранялась в течение всего периода...

Обсуждение

В этом исследовании была успешно создана мышиная модель с гиперчувствительностью к кашлю при непрерывном вдыхании лимонной кислоты (КА). Эта модель продемонстрировала достоверное повышение чувствительности к кашлю как при спонтанном кашле, так и п?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC 82100034), Проектом планирования науки и технологий в Гуанчжоу (202102010168).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% normal salineBiosharpBL158A
CapsaicinCayman chemical92350
Citric AcidSigma-AldrichC2404
EthanolGuangzhou chemical reagent factoryGSHB15-AR-0.5L
First-strand cDNA synthesis kitTransGen BiotechAT341
MethacholineSigma-AldrichA2251
Non-invasive whole-body plethysmography (WBP) systemDSI601-1400-001
Pentobarbital sodiumMerkP3761
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601
Phosphate Buffered Saline (PBS)MeilunbioMA0015
Real-time quantitative PCR detecting systemBio-rad CFX  Connect
TRIzol reagentInvitrogen15596026CN
Tween-80SolarbioT8360-100
Ultrasonic nebulizerYuwell402AI

Ссылки

  1. Morice, A. H. Epidemiology of cough. Pulm Pharmacol Ther. 15 (3), 253-259 (2002).
  2. Lai, K., Long, L. Current status and future directions of chronic cough in China. Lung. 198 (1), 23-29 (2020).
  3. Zeiger, R. S., et al. Patient-reported burden of chronic cough in a managed care organization. J Allergy Clin Immunol Pract. 9 (4), 1624-1637.e10 (2021).
  4. Chamberlain, S. A., et al. The impact of chronic cough: A cross-sectional European survey. Lung. 193 (3), 401-408 (2015).
  5. Morice, A. H., et al. Expert opinion on the cough hypersensitivity syndrome in respiratory medicine. Eur Respir J. 44 (5), 1132-1148 (2014).
  6. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiol Rev. 96 (3), 975-1024 (2016).
  7. Shapiro, C. O., et al. Airway sensory nerve density is increased in chronic cough. Am J Respir Crit Care Med. 203 (3), 348-355 (2021).
  8. Ando, A., et al. Neural correlates of cough hypersensitivity in humans: Evidence for central sensitization and dysfunctional inhibitory control. Thorax. 71 (4), 323-329 (2016).
  9. Plevkova, J., et al. Animal models of cough. Respir Physiol Neurobiol. 290, 103656 (2021).
  10. Smith, J. A., Hilton, E. C. Y., Saulsberry, L., Canning, B. J. Antitussive effects of memantine in guinea pigs. Chest. 141 (4), 996-1002 (2012).
  11. Hewitt, M. M., et al. Pharmacology of bradykinin-evoked coughing in guinea pigs. J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 620-628 (2016).
  12. Zhong, S., et al. Antitussive activity of the Schisandra chinensis fruit polysaccharide (SCFP-1) in guinea pigs models. J Ethnopharmacol. 194, 378-385 (2016).
  13. Zhong, S., et al. Effects of Schisandra chinensis extracts on cough and pulmonary inflammation in a cough hypersensitivity guinea pig model induced by cigarette smoke exposure. J Ethnopharmacol. 165, 73-82 (2015).
  14. Wei, L., et al. Effects of Shiwei longdanhua formula on LPS-induced airway mucus hypersecretion, cough hypersensitivity, oxidative stress and pulmonary inflammation. Biomed Pharmacother. 163, 114793 (2023).
  15. Chen, L., Lai, K., Lomask, J. M., Jiang, B., Zhong, N. Detection of mouse cough based on sound monitoring and respiratory airflow waveforms. PLoS One. 8 (3), e59263 (2013).
  16. Gibson, P., et al. Treatment of unexplained chronic cough: Chest guideline and expert panel report. Chest. 149 (1), 27-44 (2016).
  17. Nakaji, H., et al. Airway remodeling associated with cough hypersensitivity as a consequence of persistent cough: An experimental study. Respir Investig. 54 (6), 419-427 (2016).
  18. Xu, X., et al. Association of cough hypersensitivity with tracheal trpv1 activation and neurogenic inflammation in a novel guinea pig model of citric acid-induced chronic cough. J Int Med Res. 46 (7), 2913-2924 (2018).
  19. Iwata, T., et al. Mechanical stimulation by postnasal drip evokes cough. PLoS One. 10 (11), e0141823 (2015).
  20. Chen, L., et al. Establishment of a mouse model with all four clinical features of eosinophilic bronchitis. Sci Rep. 10 (1), 10557 (2020).
  21. Zhang, C., Lin, R. L., Hong, J., Khosravi, M., Lee, L. Y. Cough and expiration reflexes elicited by inhaled irritant gases are intensified in ovalbumin-sensitized mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 312 (5), R718-R726 (2017).
  22. Amato, A., Becci, A., Beolchini, F. Citric acid bioproduction: The technological innovation change. Crit Rev Biotechnol. 40 (2), 199-212 (2020).
  23. Hu, W., Li, W. J., Yang, H. Q., Chen, J. H. Current strategies and future prospects for enhancing microbial production of citric acid. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (1), 201-209 (2019).
  24. Morice, A. H., Kastelik, J. A., Thompson, R. Cough challenge in the assessment of cough reflex. Br J Clin Pharmacol. 52 (4), 365-375 (2001).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены